紅皮蓮子中黃酮的提取研究

鐘云紅 黃盈盈

(四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川都江堰，611830)

紅皮蓮子，外觀呈卵形或類球形，屬睡蓮科，是水生植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)在秋季采摘成熟的蓮蓬[1]，剝?nèi)」麑崳喝ス?，干燥后的種子，養(yǎng)脾止瀉、止帶，具益腎澀精和靜心安神之功效[1-4]。大家將植物蓮成熟種子中的胚根和綠色嫩葉稱為蓮心[1]，又稱蓮子心、苦薏、蓮薏，長1-1.4 cm，通常呈細圓筒形[1-4]。蓮子心沒有明顯的氣味，嘗起來有苦味，其藥用歷史悠久，是一味重要的中草藥，具有藥理和食用研究價值[2]。蓮子性味甘、平、微澀，其化學(xué)成分十分復(fù)雜，不僅含有豐富的黃酮類化合物和生物堿類，還含有揮發(fā)性油類、多糖等其他活性成分[2-4]。黃酮類化合物具有C6-C3-C6的基本骨架，含有2-苯基色原酮的結(jié)構(gòu)[5]，在植物界分布非常普遍，同時也是蓮子心除生物堿以外的主要化學(xué)成分[6-7]。遺憾的是黃酮類化合物不能在人體內(nèi)自己合成，必須從食物和藥物中攝取[5]。目前已應(yīng)用于藥品和保健產(chǎn)品，它們對人類健康起著十分重要的作用。黃酮類物質(zhì)曾被叫作“維生素P”，能有效祛除體內(nèi)自由基，具有抗氧化、抗腫瘤和抗輻射等功效[6-9]。純天然黃酮類化合物絕大部分與糖結(jié)合形成碳糖基或苷類，黃酮固體普遍為無定形粉末，其余黃酮類化合物多為結(jié)晶固體[5-6]。而蓮子的黃酮含量豐富，其中蓮子外殼和蓮子心中均含有一定量的黃酮。

目前，黃酮類化合物的提取，實驗室常采用熱水提取法、堿提取法[9]、有機溶劑提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法[10]、超聲波輔助提取法[2,4,11]及超臨界流體提取法等方法[9]。但海文[12]等人使用堿提酸沉法提取黃酮，優(yōu)選出了最佳的提取方法；宋曉凡[13]等人對空心蓮子草中黃酮的提取進行了進一步研究。文獻資料中探究較多的是蓮子心中黃酮的提取，紅皮蓮子中黃酮的提取報道尚未查閱到。本課題選取福建建寧縣紅皮蓮子為實驗原料，探索紅皮蓮子中總黃酮的提取，研究紅皮蓮子中黃酮的最佳提取條件及影響因素，為紅皮蓮子中黃酮功能因子的進一步開發(fā)利用提供參考依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗原料、試劑及儀器

1.1.1 實驗原料

紅皮蓮子，取自福建建寧縣，市售，屬初級農(nóng)產(chǎn)品。

1.1.2 實驗試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥98%，合肥博美生物科技有限公司)；氫氧化鈉(AR)、無水乙醇(AR)、亞硝酸鈉(AR)、硝酸鋁(AR)，均購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水(自制)。

1.1.3 實驗儀器

電子天平(TB-215D，d=0.01 mg，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；高速萬能粉碎機(FW100，天津市泰斯特儀器有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZHWY-100C，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；800電動離心機(常州市國旺儀器制造有限公司)；紫外-可見分光光度計(UV-1800，上海翱藝儀器有限公司)。

2 實驗原理

黃酮類化合物大多具有酚羥基，故呈弱酸性，其酸性大小與酚羥基所在的位置和數(shù)量有關(guān)，基于不易溶于酸水而易溶于堿水的化學(xué)屬性，選取堿溶酸沉淀法，即使用堿水提取液加酸酸化，析出黃酮類化合物[6]。在弱堿性或中性條件下，滴加亞硝酸鈉溶液，鋁鹽與黃酮類化合物反應(yīng)形成螯合物，滴加氫氧化鈉溶液時出現(xiàn)橙紅色。通過黃酮類化合物與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，顯色后，在最佳吸收波長條件下測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求出總黃酮濃度，再按照以下的公式計算紅皮蓮子中總黃酮的提取率。

紅皮蓮子總黃酮的提取率(%)：

式中：Y——紅皮蓮子總黃酮的提取率(%)；c——根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出的總黃酮溶液的濃度(mg/mL)；n——測定時提取液的稀釋倍數(shù)；V——提取時待測溶液的體積(mL)[9]；m——紅皮蓮子粉的質(zhì)量(g)[10-11]。

2.1 樣品制備

將采購的紅皮蓮子倒入潔凈干燥的白瓷盤中，在75 ℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，用萬能粉碎機磨碎成粉末，通過40目篩，然后轉(zhuǎn)移至棕色磨口試劑瓶中，備注上標(biāo)簽，保存在干燥器中備用[2]。

2.2 最大吸收波長的確定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測樣品進行顯色反應(yīng)后，以第一支比色管作為試劑空白調(diào)零，在200—600 nm波長范圍內(nèi)掃描，每隔10 nm進行波長的測量，測量結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測樣品均在510 nm處吸光度值最大。因此，實驗中確定的最大吸收波長為510 nm，與查閱的相關(guān)文獻一致。

3 實驗探究

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL分別準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移到10 mL已編號的比色管中[14]，依次補充50%乙醇溶液到5 mL的刻度線；再逐一加入0.3 mL的5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min；再加入0.3 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min；然后加入4 mL 1 moL/L氫氧化鈉溶液，振蕩混勻，最后再用蒸餾水定容至10 mL的刻度線[2,14-15]，混合搖勻，靜置15 min；以第一支比色管(試劑空白)為參比溶液調(diào)零，設(shè)置波長為510 nm，依次測定其吸光度，根據(jù)濃度和吸光度值，完成標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[2]。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

3.2 最佳提取劑濃度的選擇

黃酮類物質(zhì)通常容易溶解于強極性溶劑水、甲醇、乙醇等，難溶于有機溶劑三氯甲烷、苯等，因此實驗中多選取甲醇和乙醇作為提取黃酮類化合物的溶劑[2,16-17]。常利用黃酮類化合物與混入的雜質(zhì)極性不同的特征，選取不同濃度的溶劑進行提取，以期達到分離純化的效果?？紤]到甲醇毒性大，乙醇安全無毒、操作容易、回收利用方便等因素，選取乙醇作為提取劑[2]。本次實驗主要探索乙醇濃度對提取效果的影響，探索出最佳的乙醇濃度。

準(zhǔn)確稱取20.00 g紅皮蓮子粉于一系列已編號的具塞錐形瓶中，依次加入70 mL濃度為30%、40%、60%、70%、80%、90%的乙醇溶液，蓋上瓶塞，在55 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振速150 rpm連續(xù)提取30 min后，取出上層清夜或過濾后，離心25 min，測定吸光度，計算黃酮類物質(zhì)的提取率。繪制乙醇濃度與提取率的關(guān)系圖，見圖2。

圖2 提取劑乙醇濃度對黃酮提取率的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，紅皮蓮子中黃酮的提取率也逐漸提高[2]；當(dāng)乙醇濃度為30%—70%時，黃酮提取率提高顯著；當(dāng)乙醇濃度升到70%后，黃酮提取率提高比較緩慢。根據(jù)溶質(zhì)比例確定其溶劑的量，當(dāng)乙醇濃度過低需要延長有效的實驗提取時間，導(dǎo)致實驗時間拖長，并且并不能完全將紅皮蓮子中的黃酮浸提出；當(dāng)乙醇濃度過于飽和時不利于黃酮的提取，乙醇的用量也比較浪費。因此，在提取過程中提取率最佳的同時也必須保證實驗的效率。綜合以上因素，選擇的乙醇濃度以70%為最佳，此時的提取率也極佳。該方法具有應(yīng)用廣泛、安全、經(jīng)濟、易操作和方便等優(yōu)點。

3.3 最佳料液比的選擇

準(zhǔn)確稱取20.00 g紅皮蓮子粉放入若干具塞錐形瓶中，按1:2、1:3、1:4、1:5、1:6的料液比加入相應(yīng)的70%乙醇，蓋上瓶塞，置于55 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中，振速150 rpm進行浸提30 min，選擇最佳料液比[17]。

從圖3可知，提取料液比的多少直接影響著黃酮的提取率。當(dāng)料液比為1:2、1:3時，紅皮蓮子中黃酮不能充分浸取出，其浸出率比較低；當(dāng)料液比為1:4時，黃酮的提取率最高，達到3.1%；當(dāng)料液比為1:5時，黃酮提取率曲線呈急劇下降趨勢，這一現(xiàn)象的原因可能是紅皮蓮子提取過程中有除黃酮以外的雜質(zhì)析出，導(dǎo)致其浸出率降低。因此，選取最佳料液比為1:4。

圖3 不同料液比對黃酮提取率的影響

3.4 選擇最佳提取時間

提取時間也是影響蓮子中黃酮提取率的重要因素之一。準(zhǔn)確稱取20.00 g紅皮蓮子粉放入若干具塞錐形瓶中，加入80 mL 70%乙醇溶液，蓋上瓶塞，放入55 ℃恒溫振蕩器中，選取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min作為提取時間，取出上層清夜或者過濾后，離心測定吸光度，計算其提取率。

根據(jù)圖4可知，黃酮提取率隨著時間的增加而增大，溶液的顏色也隨著時間的延長而逐漸變深，達到40 min時，提取效果最好，提取率為3.6%。再延長時間到50 min，甚至反應(yīng)更長時間，提取率反而降低，主要是時間延長會導(dǎo)致紅皮蓮子中其他雜質(zhì)的析出，降低提取率，但提取時間短則紅皮蓮子中的黃酮類物質(zhì)不能充分提取出來[14]。因此，紅皮蓮子中黃酮的最佳提取時間設(shè)為40 min，此時的浸出率也是最佳的。

圖4 時間對黃酮提取率的影響

3.5 最佳溫度的選擇

由于分子在溫度較高時易于擴散和運動，溫度對其浸出率也有一定的影響。準(zhǔn)確稱取20.00 g紅皮蓮子粉放入若干具塞錐形瓶中，加入80 mL 70%乙醇溶液，蓋上瓶塞，在不同溫度的恒溫振蕩器中連續(xù)提取40 min后，取出上層清夜或者過濾后，離心測定吸光度，計算黃酮類物質(zhì)的提取率。本次實驗探究了在其他條件一致的情況下，不同溫度對紅皮蓮子中黃酮提取率的影響。

由圖5可知，在20—80 ℃時，紅皮蓮子黃酮的提取率隨著溫度的增高而增大，上升到70 ℃時黃酮的提取率為4.0%，80 ℃時黃酮提取率逐漸降低。在相對較低的溫度下提取的雜質(zhì)較少，紅皮蓮子中的黃酮成分未被完全浸提出；隨著溫度的增高，黃酮類成分溶解、擴散、滲透的速度加快，其提取率也增加；但溫度不能過高，溫度過高，極易破壞黃酮類成分，同時雜質(zhì)的含量也逐漸增加[14,18]。由于紅皮蓮子的提取溶液穩(wěn)定性較差，主要表現(xiàn)為褐變速率快，極易出現(xiàn)沉淀物。因此，當(dāng)達到適當(dāng)?shù)臏囟葧r，黃酮類化合物能夠被充分提取出來。綜合考慮，最佳提取溫度為70 ℃。

圖5 溫度對黃酮提取率的影響

4 結(jié)論

通過實驗探索了影響紅皮蓮子黃酮提取率的4個影響因素，根據(jù)測定結(jié)果，將實驗條件優(yōu)化設(shè)定為最佳狀態(tài)：乙醇濃度70%、料液比1:4、提取溫度70 ℃、提取時間40 min，此時紅皮蓮子的黃酮提取率最高，黃酮的提取率達到4.0%[19]。

實驗所采用的分光光度計法方便快捷，安全性好，黃酮提取含量高，儀器和成本消耗低，實驗總體效果好，為提取和進一步開發(fā)利用紅皮蓮子中黃酮類化合物提供了實驗參考依據(jù)。