兩種草坪草單種與混種對鉛-鋅-鎘復合污染的生理響應

張 莉， 徐彥紅， 張淑煒， 劉宇宇， 席 溢

(貴州大學動物科學學院， 貴州 貴陽 550025)

礦產(chǎn)資源的開發(fā)是造成土壤重金屬污染的重要原因。如黔西北水城-赫章礦帶是貴州鉛(Pb)、鋅(Zn)礦的主要產(chǎn)地，有研究顯示，貴州省赫章縣新官寨農(nóng)業(yè)土壤中Pb、Zn、鎘(Cd)、汞(Hg)、銅(Cu)、砷(As)平均含量分別為337 mg·kg-1，648 mg·kg-1，9.0 mg·kg-1，0.44 mg·kg-1，121 mg·kg-1和17 mg·kg-1，分別是貴州省農(nóng)業(yè)土壤背景值的7.5，7.9，26.4，2.2，4.7和0.8倍[1]。微生物不能分化重金屬，但重金屬可以被微生物富集，土壤一旦被重金屬污染，其自然凈化的過程和人工管理將變得十分艱難[2]。研究發(fā)現(xiàn)重金屬污染環(huán)境中能正常生長的植物，并將其用于土壤修復具有重要意義[3]。

植物修復是一種利用綠色植物來去除環(huán)境污染物的綠色修復技術(shù)，具有獨特優(yōu)勢。其一，植物可以將污染物加工成可直接去除的物質(zhì)形態(tài)或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為毒性小甚至無毒的物質(zhì)，從而對污染環(huán)境進行徹底治理；其二，一些植物種植后可進行多次修剪，從而最大程度實現(xiàn)減少土壤重金屬污染的目的。超富集植物常被選擇用于植物修復過程中，目前國內(nèi)外報道的超富集植物已有721種,其中超過70%為鎳超富集植物[4]。然而，專門針對Pb，Zn，Cd等重金屬的超富集植物研究較少。

多年生黑麥草(LoliumperenneL.)屬于禾本科黑麥草屬，須根發(fā)達，抗性強，可富集多種重金屬。研究表明[5]，黑麥草對Pb，Zn，Cd的毒害具有較強的耐性，對尾礦砂的改良作用明顯，可作為Pb，Zn礦區(qū)污染土壤生態(tài)修復的植物材料。徐衛(wèi)紅等[6]發(fā)現(xiàn)在鋅污染的土壤中，當Zn2+濃度在0～520 mg·g-1時促進了多年生黑麥草的生長。余游等[7]研究發(fā)現(xiàn)，野地瓜和黑麥草套種的條件下，黑麥草地上部對Cd的富集量為5.64×103mg，野地瓜和多年生黑麥草套作提高了多年生黑麥草對Cd的富集能力。高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)是禾本科早熟禾亞科羊茅屬多年生草本植物，是一種較好的綠色草坪用草。有研究表明，高羊茅具有一定的吸收和耐受土壤中重金屬的能力[8]。徐佩賢等對四種冷季型草坪植物對Cd的耐受性與積累特性進行比較，結(jié)果表明高羊茅對Cd的耐受性最好,其次為多年生黑麥草高羊茅[9]。劉騏華等在銅、鎘、鉛對高羊茅種子萌發(fā)及幼苗生長影響的研究中，發(fā)現(xiàn)高羊茅在鎘脅迫下表現(xiàn)修護最強的耐受性[10]。馬志強等[11]研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的茉莉酸甲酯可以增強高羊茅對鎘污染土的修復能力。目前，重金屬Pb，Zn，Cd對多年生黑麥草和高羊茅的影響主要集中于單一金屬的脅迫，而關(guān)于重金屬復合脅迫的研究較少。由于Pb，Zn，Cd在污染土壤中不是單獨存在的，而是相互伴生存在的。因此，對于Pb，Zn，Cd重金屬復合脅迫的研究具有重要的現(xiàn)實意義。本研究通過盆栽實驗，研究多年生黑麥草和高羊茅單種與混種對Pb-Zn-Cd復合污染的生理響應，以期為Pb-Zn-Cd污染土中草坪草種植的適宜性研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

1.1.1試驗設(shè)計 土壤經(jīng)過風干、研磨和過5 mm篩后，將土壤裝入規(guī)格為48 cm×33 cm×26 cm(長×寬×高)的塑料花盆(每盆裝土21 kg)待用。以貴州省赫章縣新官寨農(nóng)業(yè)土壤中重金屬濃度作為試驗參照值[1]，Pb(NO3)2，Zn(NO3)2·6H2O，Cd(NO3)2·4H2O溶于水后加入土壤中，Pb，Zn，Cd離子濃度分別為337 mg·kg-1，648 mg·kg-1，9 mg·kg-1，混勻，靜置3個月作為供試土壤?；蕿閺秃戏剩┓柿繛?2.5 g·m-2。選取籽粒飽滿的高羊茅、多年生黑麥草種子用10% H2O2消毒10 min后用水沖洗幾遍后撒種，待出苗一致后進行間苗，每盆種6行，每行留苗30株?；旆N，一行為多年生黑麥草，一行為高羊茅。盆與盆之間間隔10 cm，隨機放置。植物生長過程中及時去除雜草，防治蟲害，并不定期澆水，使田間持水量保持在60%左右。種植2個月后修剪一次，待其再生長一個月后，此時兩種植物都處于營養(yǎng)生長階段，測定不同種植方式下多年生黑麥草和高羊茅的地上部分生理指標。

1.2 供試材料

供試土壤取自貴州大學西校區(qū)試驗基地，取樣深度為20 cm以內(nèi)表層土。其Pb，Zn，Cd含量分別為5.76 mg·kg-1，16.50 mg·kg-1，0.03 mg·kg-1。土壤基本理化性質(zhì)為：pH值5.2，有機質(zhì)3.8 g·kg-1，全氮0.59 g·kg-1，全磷0.46 g·kg-1，全鉀18.23 g·kg-1，堿解氮26.5 g·kg-1，有效磷24.7 g·kg-1，速效鉀182.5 g·kg-1。供試種子高羊茅(‘Gold Crown’)和多年生黑麥草(‘雅晴’)，購于貴州眾智恒生態(tài)科技有限公司。重金屬添加劑以分析純Pb(NO3)2，Zn(NO3)2·6H2O，Cd(NO3)2·4H2O的形式添加。

1.2.1測定內(nèi)容與方法 葉綠素a、葉綠素b以及類胡蘿卜素含量采用采用95%乙醇浸提法。生理指標檢測均參考李合生[12]等方法，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性采用NBT光化還原法；過氧化物酶(Peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法；過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用碘量法；丙二醛(Malondaldehyde，MDA)含量硫代巴比妥酸(TBA)顯色法；游離脯氨酸(Proline，Pro)含量采用茚三酮比色法間接測定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法。巰基化合物的測定：還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione，GSH)含量、半胱氨酸(Cysteine，Cys)含量、非蛋白巰基(Non-protein sulfhydryl，NPT)含量采用試劑盒測定，試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供，具體操作步驟按照相關(guān)規(guī)定說明書進行。

耐性的綜合評價：應用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法綜合評價Pb-Zn-Cd復合污染對不同種植方式下多年生黑麥草和高羊茅生理指標的影響以及同種種植方式下多年生黑麥草和高羊茅耐受性的比較，先利用公式X=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)或X=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)分別對多年生黑麥草和高羊茅的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素、光合色素、POD，SOD，CAT，MDA，Pro，可溶性糖，可溶性蛋白，Cys，NPT，GSH進行隸屬函數(shù)值計算[13]。式中，X為參試植物某一指標的測定值，Xmax和Xmin分別為所有材料中該指標的最大值和最小值，然后把每一指標在不同種植方式下的隸屬值累加求平均值，最后把每份材料各項指標隸屬函數(shù)值累加求平均值，根據(jù)各材料平均隸屬函數(shù)值大小確定多年生黑麥草和高羊茅對Pb-Zn-Cd復合污染的耐受性，平均值越大，耐性越強；反之，耐性越弱。

1.2.2數(shù)據(jù)處理方法 SigmaPlot 14.0用于整理數(shù)據(jù)和圖形的制作，統(tǒng)計分析軟件SPSS 20.0用于數(shù)據(jù)單因素方差分析(One-way ANOVA)和鄧肯多重比較(Duncan’s multiple comparison)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對兩種草坪草光合色素含量的影響

在無污染處理下，兩種草坪草的混種(HL,HF)和單種相比降低了多年生黑麥草和高羊茅的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量。Pb-Zn-Cd復合污染下高羊茅單種和無污染處理相比，葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量被提高，多年生黑麥草的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量被降低，但未達到顯著差異；但是混種模式下(PHL，PHF)，多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量被提高，高羊茅葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量被降低，均未達到顯著差異(表2)。

表2 不同處理對兩種草坪草光合色素含量的影響Table 2 Effects of different treatments on photosynthetic pigment content of two turfgrasses 單位:mg·g-1

2.2 不同處理對兩種草坪草抗氧化酶系統(tǒng)的影響

由圖1A所示，添加Pb-Zn-Cd均提高了多年生黑麥草和高羊茅的POD活性；Pb-Zn-Cd污染下，相對于單種(PL,PF)而言，混種(PHL)對多年生黑麥草和高羊茅POD活性影響不顯著；混種(PHF)顯著提高了高羊茅POD的活性(P<0.05)。未添加Pb-Zn-Cd時，相對于單種(L，F(xiàn))而言，混種模式下(HL，HF)高羊茅和多年生黑麥草POD活性變化也不明顯。由圖1B可知，添加Pb-Zn-Cd時，均降低了多年生黑麥草和高羊茅的SOD活性，相對于單種(PL，PF)而言，混種(PHL，PHF)提高了多年生黑麥草和高羊茅SOD活性；當不添加Pb-Zn-Cd時，對于單種(L，F(xiàn))而言，混種(HL，HF)降低了多年生黑麥草SOD酶活性，提高了高羊茅SOD酶活性。由圖1C所示，在單一和混合種植模式下，多年生黑麥草和高羊茅的CAT的活性變化差異較大；無論是單一種植還是混種，添加Pb-Zn-Cd對多年生黑麥草CAT活性沒有顯著影響，與高羊茅單種相比(F，HF),添加Pb-Zn-Cd(PF，PHF)高羊茅的CAT活性被顯著提高(P<0.05)；當不添加Pb-Zn-Cd時，與單種(L，F(xiàn))相比，混種(HL，HF)更為明顯的降低了高羊茅和多年生黑麥草的CAT活性(P<0.05)。

Pb-Zn-Cd的添加(PL，PHL，PHF)均增加了多年生黑麥草和高羊茅的MDA的物質(zhì)含量(除高羊茅單種)，與單一種植模式相比(HL，HF)，混種(PHL，PHF)增加了多年生黑麥草和高羊茅MDA的物質(zhì)含量。當不添加Pb-Zn-Cd時，與單一種植模式(L，F(xiàn))相比，混種(HL)減少了多年生黑麥草MDA的物質(zhì)含量,混種(HF)顯著降低了高羊茅MDA的物質(zhì)含量(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同處理對兩種草坪草丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on MDA content in two turfgrasses注：不同小寫字母表示多年生黑麥草不同處理間的差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示高羊茅不同處理間的差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate the differences between different treatments of perennial ryegrass at the 0.05 level. Different capital letters indicate differences among different treatments of tall fescue at the 0.05 level

2.3 不同處理對兩種草坪草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

從圖3A可知，對單種而言(L，F(xiàn))，Pb-Zn-Cd的添加(PL，PF)提高了多年生黑麥草和高羊茅游離脯氨酸的營養(yǎng)物質(zhì)含量，而混種方式下，Pb-Zn-Cd的添加(PHL)顯著降低了多年生黑麥草游離脯氨酸的含量，與單種相比(PF),混種(PHF)提高了高羊茅游離脯氨酸的含量(P<0.05)。未污染處理下，與多年生黑麥草單種(L)、高羊茅單種(F)相比，兩種草坪草混種(HL，HF)對多年生黑麥草和高羊茅游離脯氨酸含量沒有顯著影響。從圖3B可知，對單種(L，F(xiàn))而言，添加Pb-Zn-Cd降低了單一物種的可溶性糖含量，而添加Pb-Zn-Cd增加了混種模式下(PHL，PHF)多年生黑麥草和高羊茅可溶性糖的含量；當不添加Pb-Zn-Cd時，與單一種植模式相比(L，F(xiàn))，混種模式下(HL，HF)，多年生黑麥草和高羊茅可溶性糖含量均降低；在添加Pb-Zn-Cd時，與單一種植模式相比(PL，PF)，混種模式下(PHL，PHF)，多年生黑麥草和高羊茅可溶性糖含量均顯著提高(P<0.05)。由圖3C可知，添加Pb-Zn-Cd(PL，PHL，PHF)會增加多年生黑麥草和高羊茅的可溶性蛋白含量(高羊茅的單一物種除外)；與無污染高羊茅混種(HL)相比，添加Pb-Zn-Cd(PHL)顯著提高高羊茅可溶性蛋白的含量(P<0.05)。當不添加Pb-Zn-Cd時，與單一種植模式(L，F(xiàn))相比，混種模式下，多年生黑麥草的可溶性蛋白的含量增加，高羊茅的可溶性蛋白含量顯著減少(P<0.05)。

圖3 不同處理對兩種草坪草滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on osmotic adjustment substance content in two turfgrasses注：不同小寫字母表示多年生黑麥草不同處理間的差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示高羊茅不同處理間的差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate the differences between different treatments of perennial ryegrass at the 0.05 level. Different capital letters indicate differences among different treatments of tall fescue at the 0.05 level

2.4 不同處理對兩種草坪草巰基化合物含量的影響

從圖4A可知，對于單一物種而言(L，F(xiàn))，Pb-Zn-Cd的添加(PL，PF)顯著降低了多年生黑麥草和高羊茅Cys的含量(P<0.05)，而混種模式下，(PHL)降低了多年生黑麥草Cys的含量，但未達到顯著差異，(PHF)顯著降低了高羊茅Cys的含量(P<0.05)。未污染處理下，相對于多年生黑麥草、高羊茅單種而言(L，F(xiàn))，混種(HL，HF)對多年生黑麥草和高羊茅半胱氨酸含量的影響不顯著。由圖4B可知，與無污染單種相比(L),Pb-Zn-Cd的添加(PL)降低了多年生黑麥草NPT的含量，與無污染混種相比(HL)，Pb-Zn-Cd的添加(PHL)顯著提高了多年生黑麥草NPT的含量(P<0.05)，無論是單種還是混種，Pb-Zn-Cd的添加(PF，PHF)均提高了高羊茅NPT的含量。未添加Pb-Zn-Cd時，與多年生黑麥和高羊茅單一種植相比(L，F(xiàn))，混種模式下(HL，HF)，多年生黑麥草和高羊茅NPT的含量顯著減少(P<0.05)。從圖4C可以看出，對于單一物種而言(L，F(xiàn))，Pb-Zn-Cd的添加(PL，PF)對多年黑麥草沒有顯著影響，但顯著增加了高羊茅GSH的含量(P<0.05)，而在混合種植模式下，與無污染混種相比(HL，HF)，Pb-Zn-Cd的添加(PHL，PHF)均顯著提高了多年生黑麥草和高羊茅GSH的含量(P<0.05)。與無污染單種相比(L，F(xiàn))，混種(HL)對多年生黑麥草GSH的含量無明顯影響，但混種模式下(HF)高羊茅GSH的含量有所增加。

圖4 不同處理對兩種草坪草巰基化合物含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on the content of sulfhydryl compounds in two turfgrasses注：不同小寫字母表示多年生黑麥草不同處理間的差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示高羊茅不同處理間的差異顯著(P<0.05)Note:Different lowercase letters indicate the differences between different treatments of perennial ryegrass at the 0.05 level. Different capital letters indicate differences among different treatments of tall fescue at the 0.05 level

2.5 不同種植方式對多年生黑麥草和高羊茅的耐Pb-Zn-Cd的綜合評價

不同的種植方式多年生黑麥草和高羊茅的各生理指標不盡相同，為避免單獨指標所帶來的片面性，同時又可克服多個指標帶來的復雜性，采用模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法全面而準確的評價Pb-Zn-Cd復合污染對不同種植方式下多年生黑麥草和高羊茅生理指標的影響，對多年生黑麥草和高羊茅的葉綠素a，葉綠素b，類胡蘿卜素，葉綠素，光合色素，POD，SOD，CAT，MDA，Pro，可溶性糖，可溶性蛋白，Cys，NPT，GSH進行隸屬函數(shù)值計算，得出不同種植方式對多年生黑麥草和高羊茅的耐Pb-Zn-Cd的綜合評價值(表3)。由綜合評價得出多年生黑麥草各個處理的耐受性為：無污染單種>污染混種>污染單種>無污染混種；高羊茅各個處理的耐受性為：污染單種>無污染單種>污染混種>無污染混種。Pb-Zn-Cd污染下，多年生黑麥草和高羊茅的耐受性比較：單種時，高羊茅>多年生黑麥草；混種時，多年生黑麥草>高羊茅。

表3 多年生黑麥草和高羊茅的不同種植方式耐Pb-Zn-Cd的綜合評價值Table 3 Comprehensive evaluation values of Pb-Zn-Cd tolerance of perennial ryegrass and tall fescue in different planting ways

3 討論

3.1 重金屬污染對植物光合色素含量的影響

植物光合作用是植物獲取能量的重要途徑，植物能量含量與光合作用之間有著非常密切的關(guān)系。重金屬脅迫下，植物的葉綠素含量會顯著降低，葉綠體膜結(jié)構(gòu)會受到一定程度的損傷，抑制葉綠體內(nèi)的光合酶合成，導致植物葉片氣孔關(guān)閉，使光合作用的強度降低[14]。前人研究顯示，在重金屬Pb2+的脅迫下，多年生黑麥草的葉綠素含量顯著高于對照組，而在重金屬Cd2+的脅迫下，多年生黑麥草的葉綠素含量呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢[15]；在Pb，Zn，Cd，Pb-Zn和Cu-Cd脅迫下，多年生黑麥草和高羊茅的葉綠素含量都呈顯著下降趨勢，在Cu單一脅迫下，多年生黑麥草和高羊茅的葉綠素含量呈上升趨勢[16]。在Zn2+和Mn2+的脅迫下，兩種禾本科植物的葉綠素a含量和葉綠素b含量以及葉綠素a /b的比值比對照組均顯著降低[17]。本研究中，Pb-Zn-Cd污染下，提高了高羊茅葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量，降低了多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量，未達到顯著差異?？赡苁且驗樵谠摑舛萈b-Zn-Cd復合污染下，能夠促進高羊茅植物體內(nèi)光合色素相關(guān)酶的合成，多年生黑麥草對該濃度Pb-Zn-Cd復合污染下的耐受性較差，部分與光合色素合成的相關(guān)酶受到抑制，也有可能是Pb-Zn-Cd的復合脅迫致使多年生黑麥草葉片中的Fe2+含量下降，加上Pb-Zn-Cd自身對葉綠素的新陳代謝具有消極影響，可能會導致葉綠素的降解受到抑制、生物合成受阻。Pb-Zn-Cd污染下，混種提高了多年生黑麥草葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量，降低了高羊茅葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素以及光合色素的含量，均未達到顯著差異。可能是因為這種混種模式可以促進多年生黑麥草植物體內(nèi)光合色素相關(guān)酶的激活和合成，但卻抑制了高羊茅植物體內(nèi)光合色素相關(guān)酶的激活和合成。

3.2 重金屬污染對植物抗氧化酶系統(tǒng)的影響

氧化損傷是重金屬脅迫下植物的重要作用機制。在重金屬脅迫下，植物中的活性氧物種(Reactive oxygen species，ROS)將過度產(chǎn)生和積累[18]，高水平的ROS一般會破壞細胞的輔助成分，如細胞膜、核酸和葉綠素等[19]，造成氧化損傷，影響植物正常的生長發(fā)育。低濃度的重金屬會激活植物的抗氧化管理系統(tǒng)，誘導SOD，POD和CAT的抗氧化蛋白酶活性增加，并去除植物中的活性氧物種[20]，抗氧化酶的誘導性是減少氧化變色損傷的重要保護運行機制，其中SOD在誘導下降解增加，催化超氧陰正離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧氣；過氧化氫也是自由基的一種，它也會對細胞膜造成氧化損傷，POD和CAT可以催化過氧化氫產(chǎn)生無毒的水和氧氣分子，使植物體內(nèi)的自由基保持在一個較低水平，避免自由基對植物造成的氧化損害，過氧化氫酶是植物在逆境下代謝的關(guān)鍵保護酶[21]。HU等人[22]研究發(fā)現(xiàn)，在濃度為1 000 mg·L-1的Pb脅迫下，高羊茅的SOD和POD活性均增加。對14份禾本科牧草的耐鉛性研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬鉛脅迫下，植物的POD和SOD活性均呈先上升后下降的趨勢，CAT活性整體呈下降趨勢[23]。在本研究中，在Pb-Zn-Cd污染下，多年生黑麥草和高羊茅的POD活性均增加、高羊茅的CAT活性也增加、多年生黑麥草和高羊茅的SOD活性降低；與單一種植模式相比，混種模式下，多年生黑麥草和高羊茅的SOD活性成分均有增加，高羊茅CAT活性顯著增加(P<0.05)，但對高羊茅的POD活性和多年生黑麥草的POD和CAT活性沒有顯著影響。與Alonso-Blázquez等[24]研究結(jié)果不同。在重金屬污染下，SOD的活性降低可能是因為在該濃度的Pb，Zn，Cd復合脅迫和混種條件下，植物體內(nèi)所有的活性氧清除酶系統(tǒng)和具生理抗性特征的生理活動被抑制，SOD的活性在此條件下會逐漸被降低，從而導致了植物體內(nèi)過多的超氧陰離子自由基得不到很好的清除，Pb-Zn-Cd脅迫產(chǎn)生的超氧陰離子沒有被SOD很好的清除，在清除自由基的這個過程中，抗氧化酶系統(tǒng)之間存在協(xié)同作用，當SOD酶活性降低時，CAT和POD的活性就會升高。

MDA是膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，在外界環(huán)境的刺激下，生長中的植物會失衡膜脂的過氧化程度，產(chǎn)生大量不利于植物生長的活性氧。實際上，MDA含量通常被用作衡量植物根系在脅迫下受損程度的綜合指標[25]。本研究的結(jié)果顯示，無論是重金屬污染還是在沒有污染情況下，混種模式對多年生黑麥草和高羊茅的MDA含量沒有顯著影響，與于保港等[26]對莎草/蠶豆間作的科學研究結(jié)果相似。在Pb-Zn-Cd未污染下，與單種相比，混種對多年生黑麥草和高羊茅的MDA含量的影響不顯著，混種多年生黑麥草和高羊茅的MDA物質(zhì)含量低于單種，可能是在混種下植物細胞膜脂質(zhì)過氧化水平減小，植株膜透性減小，進而MDA含量下降；在Pb-Zn-Cd污染下，混種對多年生黑麥草和高羊茅的MDA含量的影響與單種相比不顯著，混種多年生黑麥草和高羊茅的MDA含量高于單種。MDA含量增加是植物膜質(zhì)過氧化水平加劇的表現(xiàn)，在Pb-Zn-Cd脅迫下，雖然抗氧化酶一定程度的增加起到保護作用，但是多年生黑麥草和高羊茅植物體的細胞膜仍然會受到傷害，從而導致細胞膜會受到一定的損傷。

3.3 重金屬污染對植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

脯氨酸是一個重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫中，游離氨基酸的合成得到加強，游離脯氨酸通過滲透作用調(diào)節(jié)植物細胞，從而提高植物抵抗逆境的能力，保護自身機制免受最大程度的傷害[27]。在重金屬脅迫下，由于重金屬離子的存在，外部滲透勢降低，植物細胞內(nèi)的水分以低滲透勢低流失到外部，造成植物缺水和常見的植物損害。脯氨酸含量的增加能夠降低植物細胞內(nèi)的滲透勢，提高植物的持水能力，從而避免缺水對植物贊成的損害[28]。劉圓等人在3種藜科植物對復合重金屬污染的生理響應的研究中，發(fā)現(xiàn)在不同濃度金屬的物和脅迫下，游離脯氨酸的含量降低[27]。Pb2+濃度在1 000 mg·L-1以下，多年生黑麥草游離脯氨酸(Pro)含量呈上升趨勢，Pb2+濃度超過1 000 mg·L-1，多年生黑麥草游離脯氨酸(Pro)含量呈下降趨勢[29]。這表明，重金屬濃度不同，植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化也隨之不同。本研究中，對單種而言，Pb-Zn-Cd的添加提高了多年生黑麥草和高羊茅游離脯氨酸的含量，這表明，在Pb-Zn-Cd污染單種模式下，使植物體內(nèi)水分虧缺嚴重，兩種草坪草通過合成大量的游離脯氨酸來提高兩種草坪草的保水能力，從而緩解重金屬脅迫對植物造成的傷害。而混種方式下，Pb-Zn-Cd的添加顯著降低了多年生黑麥草游離脯氨酸的含量，提高了高羊茅游離脯氨酸的含量，這表明混種增加重金屬對多年生黑麥草的脅迫作用，加之混種增加了對多年生黑麥草細胞膜系統(tǒng)的破壞，因而刺激植物生成的脯氨酸減少，但本研究中，混種對高羊茅脯氨酸的合成沒有顯著的影響。

可溶性蛋白可以參與植物細胞的滲透調(diào)節(jié)，從而提高植物的抗逆性，它不僅是植物篩選抗性的指標之一，也是了解植物體總代謝的重要指標[30]。在植物中，可溶性蛋白質(zhì)主要是不與膜系統(tǒng)特異結(jié)合的酶，可溶性蛋白含量越高，其生理生化反應和代謝活動越強。一般來說，在不利條件下，由于蛋白質(zhì)分解的加速，蛋白質(zhì)的合成受到抑制，植物中蛋自質(zhì)的含量降低[31]。何冰等人[32]發(fā)現(xiàn)，在6 mmol·L-1的高鉛濃度處理下，楊梅葉片可溶性蛋白的含量表現(xiàn)出顯著下降趨勢，這顯著抑制了楊梅葉片的代謝活性。本研究顯示，無污染下，混種降低了高羊茅的可溶性蛋白含量，而多年生黑麥草的可溶性蛋白含量變化不明顯，可能是在混種下，高羊茅表現(xiàn)出混種劣勢；在Pb-Zn-Cd污染下，混種對兩種植物的可溶性蛋白含量沒有顯著影響。

可溶性糖是一種調(diào)節(jié)細胞滲透壓力的小分子物質(zhì)，它在維持細胞擴張、酶活性、維持細胞膜系統(tǒng)穩(wěn)定性和植株光合作用等方面起著重要的生理作用[33]。植物可以通過在逆境中提高可溶性糖以及其他有機物質(zhì)的含量，從而細胞的滲透壓得到調(diào)節(jié)，植物適應逆境的能力就會得到提高[34]。孫小霞[35]認為高濃度的鉛促使高羊茅可溶性糖的增加；李珊等[36]的研究發(fā)現(xiàn)隨著鉛濃度的升高，栝樓(Trichosantheskirilowii Maxim.)幼苗體內(nèi)可溶性糖含量逐漸下降，因此，重金屬脅迫下不同種植物體內(nèi)的可溶性糖是復雜多變的。本研究顯示，在Pb-Zn-Cd未污染下，與單種相比，混種多年生黑麥草和高羊茅的可溶性糖含量下降，可能是因為混種刺激植物生成的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)減少；在Pb-Zn-Cd污染下，多年生黑麥草和高羊茅在混合種植模式下的可溶性糖含量較單一種有所增加，這可能是由于Pb-Zn-Cd脅迫下植物的淀粉水解增加、光合產(chǎn)物產(chǎn)量緩慢以及水分虧缺導致的碳水化合物積累所致。

3.4 重金屬污染對植物巰基化合物含量的影響

Cys是無機化合物硫酸鹽同化的初始產(chǎn)物，也是谷胱甘肽合成的限速因子，對Cd來說，Cys的合成是因為它參與了植物的解毒過程。在本研究中，在Pb-Zn-Cd復合脅迫下，無論是單一種植模式還是混種模式，多年生黑麥草和高羊茅中Cys的含量均降低。這可能是因為該濃度的Pb-Zn-Cd復合脅迫降低了兩種草坪草對金屬離解的螯合能力，削弱了兩種草坪草對重金屬脅迫的耐受性，這與韓淑梅[37]和其他人在孔雀草的研究結(jié)果不一致。巰基化合物在植物的抗金屬脅迫中有重要作用，由細胞中的各種金屬和準金屬誘導能促使NPT的合成，其防御金屬毒性作用主要通過螯合金屬離子來實現(xiàn)[38]。本研究中，無論是單種還是混種，Pb-Zn-Cd的添加均提高了多年生黑麥草和高羊茅NPT的含量，這表明重金屬處理能夠誘導多年生黑麥草和高羊茅NPT的合成。有研究表明，NPT含量的增加促進了低分子量巰基化合物的合成，如GSH和植物絡(luò)合素(PCs)，這些物質(zhì)通過金屬硫醇的形式參與重金屬的解毒過程[39]。GSH可以保護體內(nèi)重要的植物免受氧化和失活。它們具有抗氧化、整合和解毒作用，共同參與清除植物毒素[40]。本研究中，對于單種而言，Pb-Zn-Cd的添加提高了高羊茅GSH的含量，而混種模式下，均提高了多年生黑麥草和高羊茅GSH的含量，說明在重金屬脅迫下，刺激了高羊茅GSH的合成，混種能刺激多年生黑麥草GSH的合成，GSH合成為植物PCs的合成提供合成前體，PCs通過與重金屬絡(luò)合保護植物免受毒害。

4 結(jié)論

在Pb-Zn-Cd復合脅迫下，多年生黑麥草和高羊茅單種與混種表現(xiàn)出一定的耐受性，根據(jù)多年生黑麥草和高羊茅單種與混種(1∶1)苗在Pb-Zn-Cd復合污染下的生理響應和耐受性綜合評價，得出結(jié)論，在Pb-Zn-Cd復合脅迫下，高羊茅單種具有較好的抗逆性，多年生黑麥草和高羊茅1∶1混種使多年生黑麥草有較好的抗逆性。