楊祎辰，王二歡，王繼強，田國慶，唐茜琳，張 淼，郭方森，王雪健，馬存德

（1.陜西國際商貿(mào)學院中藥研究院，陜西 咸陽 712046；2.陜西步長制藥有限公司，陜西 西安 710075；3.山東步長制藥股份有限公司，山東 菏澤 274000）

甘松，別名香松、甘松香，始載于唐·陳藏器的《本草拾遺》[1]。明·李時珍稱其“產(chǎn)于川西松洲，味甘”，故而得名[2]。甘松外用祛濕消腫，內(nèi)服則有理氣止痛、開郁醒脾之功效[3]?，F(xiàn)代藥理臨床研究表明，甘松具有抗心律失常、抗心肌缺血、調(diào)節(jié)血壓等作用。Flora of China指出甘松屬共2種，分布于喜馬拉雅山區(qū)，我國產(chǎn)1種，即Nardostachys jatamansi（D.Don）DC.[4]，沿用至今。由于甘松適宜的生長環(huán)境嚴苛，人工栽培技術發(fā)展滯后，多年以來市場流通供給完全依賴野生采挖。因此，甘松的野生資源破壞嚴重，瀕臨滅絕。國內(nèi)學者對多種瀕危藥材的質量評價及資源高效利用進行了相關研究，但甘松卻少見報道，其研究主要集中在提取分離、臨床醫(yī)學及藥理藥效學等方向，涉及質量評價相關的研究較少[5]。僅有李瑩等[6]、劉國林等[7]及買吾蘭江等[8]對甘松的質量評價及特征圖譜進行了不同程度的研究，但樣本數(shù)量少、采集地點單一，且未建立共有模式，亦未能提出有效的質量評價方法，已不能有效反映當前主產(chǎn)區(qū)甘松藥材的整體質量，亟待深入開展相關研究。此外，基于指紋圖譜的綜合主成分分析評價，已作為當前中藥材質量評價手段之一，廣泛應用于丹參[9]、三棱[10]、秦皮[11]等多味大宗中藥材，其評價結果具有客觀、準確、適用范圍廣等特點，可彌補甘松藥材現(xiàn)代化質量評價手段的空白。基于上述現(xiàn)狀，本研究以不同產(chǎn)地收集的甘松藥材作為研究對象，通過HPLC法建立甘松藥材指紋圖譜，并運用主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，對所有樣品的圖譜進行分析并篩選，建立甘松藥材指紋圖譜；并對其共有模式進行研究，構建甘松藥材的綜合主成分評價模型，為甘松藥材的質量評價提供方法及參考依據(jù)，以期規(guī)范當前甘松藥材的市場流通及產(chǎn)地采收加工現(xiàn)狀，保障優(yōu)質的甘松藥材能夠應用于中醫(yī)藥臨床。

1 儀器與試藥

1.1 試藥筆者于2021年6—7月，前往四川、甘肅及青海3省，共采集27個批次甘松藥材樣品。經(jīng)陜西步長制藥有限公司副主任藥師馬存德鑒定，均為敗醬科甘松屬甘松Nardostachys jatamansi（D.Don）DC.。樣品采集信息表見表1。

表1 甘松藥材樣品采集信息

1.2 主要儀器與試劑LC-2030 Plus型液相色譜儀（日本SHIMADZU公司）；TU-1810型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；TE124S型分析天平（德國Sartorius公司）；QUINTIX224-1CN型電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司）；HC-3018R型高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；DHG-9050B型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海瑯玕實驗設備有限公司）；KQ-800KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TQ-300型高速多功能粉碎機（上海市天祺盛世科技有限公司）。

甘松新酮對照品（批號：AF21021603）、綠原酸對照品（批號：AF21012553）購于成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，購于美國BCR試劑公司；水為娃哈哈純凈水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil Plus 5 μm C18-A，250 mm×4.6 mm；流動相：A-（乙腈），B-（0.2%磷酸水溶液）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；檢測波長：275 nm。洗脫條件見表2。各主成分與鄰峰之間分離度均大于1.5，分離度良好，所測定的各成分理論塔板數(shù)均不低于5 000。

表2 洗脫條件

2.2 對照品溶液的制備精密稱取甘松新酮對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含0.250 0 mg的溶液；精密稱取綠原酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含1.000 1 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備精密稱取甘松藥材粉末（過40目篩）0.5 g，置具塞錐形瓶中，準確加入甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率800 W，頻率40 kHz）15 min，放冷，再稱質量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 用甲醇稀釋對照品溶液，分別為原濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32倍，搖勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲除氣，備用。在“2.1”項條件下，以液相色譜峰面積（Y）對兩種成分濃度（mg/L，X），繪制標準曲線，分別建立甘松新酮和綠原酸的線性回歸方程：Y=31.380X+11.806，R2=0.999 9；Y=37.373X+36.920，R2=0.999 9。表明甘松新酮在7.8～250.0 mg/L濃度范圍內(nèi)、綠原酸在31.2～1 000.0 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號：S26），在“2.1”項條件下，連續(xù)進樣6次。甘松新酮含量分別為1.35%、1.35%、1.32%、1.28%、1.33%、1.43%，平均值為1.34%，RSD為3.74%，綠原酸含量分別為0.15%、0.14%、0.13%、0.14%、0.14%、0.15%，平均值為0.14%，RSD為4.65%。表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（編號：S～26），分別于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項條件下測定。甘松新酮含量分別為1.36%、1.32%、1.32%、1.30%、1.30%、1.30%，平均值為1.32%，RSD為1.64%；綠原酸含量分別為0.15%、0.13%、0.14%、0.14%、0.14%、0.14%、0.13%，平均值為0.14%，RSD為4.79%。表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復性試驗 精密稱取同一樣品（編號：S26）6份，按“2.1”項方法制備，在“2.1”項條件下測定。甘松新酮含量分別為1.33%、1.32%、1.33%、1.35%、1.32%、1.30%，平均值為1.32%，RSD為1.09%；綠原酸含量分別為0.13%、0.13%、0.13%、0.14%、0.13%、0.13%，平均值為0.13%，RSD為2.71%。表明方法的重復性良好。

2.4.5 含量測定 分別取27批次不同產(chǎn)地的甘松藥材，按“2.3”項方法制備，在“2.1”項條件下測定甘松新酮和綠原酸的含量。

2.4.6 加樣回收率試驗 取已知質量分數(shù)的同一樣品（編號：S26）0.5 g，精密稱定，平行樣9份，分別加入供試品中待測成分含量50%、100%、150%的甘松新酮、綠原酸對照品各3份，混勻；按“2.3”項方法制備，在“2.1”項條件下測定，分別計算甘松新酮和綠原酸的加樣回收率。結果顯示，甘松新酮、綠原酸的平均回收率分別為97.67%和98.81%，RSD分別為1.46%和2.75%。（見表3）

表3 加樣回收率試驗結果（n=3）

2.5 樣品測定綠原酸和甘松新酮為甘松的次生代謝產(chǎn)物，應用于甘松質量評價[12-14]。其中，甘松新酮為現(xiàn)行版《中華人民共和國藥典》規(guī)定的甘松藥材指標性成分。如圖1所示，27批次甘松藥材的綠原酸含量在0.10%～0.83%范圍內(nèi)，其中S15（甘南州瑪曲縣阿萬倉鎮(zhèn)娘瑪寺）最高，為0.83%，較最低的S18（果洛州久治縣智合日散木）高出730.00%；而甘松新酮含量在0.40%～8.73%范圍內(nèi)，其中S25（阿壩州紅原縣邛溪鎮(zhèn)-仿野生栽培）最高，為8.73%，較最低的S16（甘南州瑪曲縣阿萬倉鎮(zhèn)尼瑪?。└叱?082.50%?？梢?，各產(chǎn)地甘松藥材的綠原酸和甘松新酮含量差異較大，主要原因考慮如下：（1）甘松屬于高原植物，生長條件苛刻，高原地區(qū)海拔跨度大、氣候各異，不同的生長環(huán)境影響植物的次生代謝；（2）甘松為多年生草本植物，本研究收集的樣品生長年限未知，導致主要活性成分含量差異較大；（3）甘松樣品根莖葉花比例不均一，同種藥材的不同部位有效成分含量亦存在一定的差異?，F(xiàn)行規(guī)定，本品按干燥品計算，含甘松新酮（C15H22O3）不得少于0.10%。本研究收集的27個不同批次甘松藥材均高于此一標準。

圖1 不同產(chǎn)地甘松藥材主要活性成分含量

2.6 指紋圖譜的建立與化學模式識別分析

2.6.1 甘松藥材樣品指紋圖譜及相似度評價 通過將27批次不同產(chǎn)地的甘松藥材樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件》（2012版）軟件，并對其進行相似度評價分析。以編號為S26的樣品圖譜作為參照圖譜，篩選出17個主要特征峰，構建甘松藥材的指紋圖譜，并對2、13號峰進行指認，分別為綠原酸和甘松新酮。后經(jīng)多點校正，得到27批次甘松樣品圖譜與對照圖譜的相似度計算結果在0.754～0.996之間。其中，S7、S16、S25樣品的相似度分別為0.881、0.754、0.896，而其它批次樣品的相似度均大于0.900。（見圖2）

圖2 27批次甘松藥材指紋圖譜

2.6.2 聚類分析 通過將17個共有峰峰面積作為變量，運用SPSS 23.0軟件，采用組間聯(lián)接法，以平方歐式距離27批次甘松藥材樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結果見圖3。當組間距離大于10時，27批次樣品聚為2類，其中S25（仿野生栽培品）、S27（大田栽培品）為一類，剩余批次為一大類。當組間距離為5～10區(qū)間，最多可分為5類。其中，S4、S25、S27分別單獨為一類；甘南州的2批（S7、S16）及S24（仿野生栽培品）為一類；剩余批次為一大類，聚類特征較為模糊。當組間距離為0～5區(qū)間，該大類中的甘南州的3批（S11、S13、S15）、果洛州的S18及阿壩州的（S20、S23）為一類；S5、S8、S9、S17、S26為一類；甘南州的5批（S1、S6、S10、S12、S14）及阿壩州的2批（S19、S21）為一類；甘南州的2批（S2、S3）為一類；阿壩州的2批（S7、S247）為一類；S22單獨為一類；同時，S4、S16、S25、S27分別單獨為一類。綜上，甘松野生品及栽培品差異明顯，而不同產(chǎn)地的甘松亦存在一定的差異。因此，可用聚類分析的方法對藥材樣品進行分類評價，其結果與相似度評價結果基本保持一致。

圖3 27批次甘松藥材的聚類分析

2.6.3 主成分分析（PCA）通過將27批次甘松藥材樣品的17個共有峰峰面積作為變量，采用SPSS 23.0軟件將原始數(shù)據(jù)矩陣經(jīng)z-score標準化處理后。通過降維因子分析中的KMO檢驗和Barlett球形度檢驗，結果顯示：其中KMO取樣適切性量數(shù)為0.728，適合進行主成分分析；Bartlett球形度檢驗近似卡方為679.697，自由度為136，P=0.000＜0.001，顯示該例變量可以為主成分分析提供合理基礎。同時，經(jīng)主成分分析及權重計算后，前3個主成分特征值均大于1，累積貢獻率達83.314（見表4）；而因子分析碎石圖（見圖4）亦可看出，在第3個主成分特征值處出現(xiàn)拐點，后逐漸趨于平緩?；谏鲜龇治鼋Y果，故提取前3個成分為主成分?；谠摋l件，以產(chǎn)地作為Group，批次作為Observations，運用OriginPro 2021軟件對標準化處理后的原始數(shù)據(jù)進行主成分分析，并繪制Score Plot圖（見圖5）?？梢钥闯?，除S4、S16、S25、S27外，其余批次藥材距離較近且均分別處于兩個置信橢圓范圍內(nèi)，與系統(tǒng)聚類分析結果基本一致。

圖4 碎石圖

表4 27批甘松共有峰特征值與貢獻率

圖5 Score Plot圖

2.6.4 綜合主成分評價模型 由甘松主成分因子負荷矩陣（見表5）可知，主成分1主要解釋了F4～F5、F8～F17共13個色譜峰的信息，其中，F(xiàn)5及F8～F17在主成分1中的正相負荷值均大于0.6，即峰面積增加，第1主成分權重亦增大；主成分2主要解釋了F1～F3、F6共4個色譜峰的信息，僅有F7在主成分3中的正相負荷值大于0.6。此外，F(xiàn)7～F12、F16共7個色譜峰在全部主成分中負荷值均為正相。通過綜合主成分分析，將甘松17個共有峰在各主成分中的因子負荷值轉換為對應的線性組合系數(shù)（見表5），進而得到主成分1、2、3的評分線性方程Y1、Y2、Y3，再與3個主成分的方差貢獻率加權后即得到甘松藥材綜合質量評價模型F。將z-score標準化處理后的27批次甘松藥材樣品的17個共有峰峰面積數(shù)值依次代入上述方程及評價模型后，結果即為甘松藥材綜合主成分F值。對F值進行排序，其結果亦是對甘松質量綜合評價的結果。（見表6）

表5 主成分分析因子負荷矩陣及線性組合系數(shù)

表6 綜合主成分評價結果

計算公式如下：

綜上可知，主成分因子得分值計算公式為Yi=∑Xj·λj，而綜合主成分評價模型F=∑Yi；式中，Xj為標準化后的峰面積值，λj為線性組合系數(shù)。

2.6.5 甘松藥材標準指紋圖譜的建立 基于相似度評價，參考主成分分析及系統(tǒng)聚類分析結果，將S4、S16、S25、S27批次剔除，取剩余23批次甘松樣品建立甘松藥材的標準指紋圖譜。將23批次甘松樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)重新導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）軟件，對其進行相似度評價（見表7）；并繼續(xù)設定S26為參照圖譜，經(jīng)多點校正、匹配，R為生成的對照指紋圖譜（見圖6）。結果顯示，剩余23批次甘松樣品與對照圖譜比較的相似度均在0.915以上，這可為甘松藥材的質量評價提供科學依據(jù)。

圖6 甘松藥材標準指紋圖譜

表7 23批次甘松樣品的相似度評價

3 討 論

3.1 供試品的制備方法參照2020年版《中華人民共和國藥典》甘松新酮“含量測定”項下供試品溶液的制備方法[3]，在超聲處理（功率50 W，頻率45 kHz）15 min條件下，開展重復性試驗時，RSD較大?？紤]為超聲提取不充分，故采用超聲處理（功率800 W，頻率40 KHz）15 min，結果較好。此外，2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定甘松的入藥部位為根及根莖，而本研究所采集的甘松樣品均為全草。原因在于甘松資源均依賴于野生，且資源量匱乏，實際流通品均為全草。因此，結合市場及產(chǎn)地流通調(diào)研情況及文獻報道，本研究中各批次樣品檢測部位均為甘松全草。

3.2 色譜條件的選擇為了保證建立的甘松指紋圖譜能夠體現(xiàn)更多的化學成分，且篩選的2種有效成分具有較好的分離度，使得該方法適宜于定量分析。故分別對綠原酸和甘松新酮對照品溶液在紫外190～400 nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長差異較大。綜合考慮，選擇在275 nm波長條件下對2種成分進行測定，結果較好。此外，配置2種成分的混合對照品溶液考察洗脫體系，結果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相，對混合對照品的分離度較好，基線穩(wěn)定，色譜峰理論塔板數(shù)高，同時也適用于供試品溶液。

買吾蘭江等[8]建立的甘松藥材HPLC指紋圖譜方法需60 min，且30 min后已無共有特征峰出現(xiàn)，僅標注4個共有峰；而李瑩等[5]以10批藥材，建立的甘松HPLC指紋圖譜方法則需65 min，但色譜峰分離度一般。本研究構建的HPLC指紋圖譜，分析時間短（40 min），減少了溶劑用量，降低了分析及人工成本，同時各色譜峰分離效果良好。

3.3 分析方法評價23批次藥材與對照指紋圖譜相似度均在0.915以上，表明不同產(chǎn)地的甘松藥材質量較穩(wěn)定。主成分分析結果與聚類分析結果基本一致，大多數(shù)甘松野生品聚為一類，而甘松栽培品聚為一類，但其中亦有個別產(chǎn)地的甘松野生品與栽培品未能有效聚類。考慮由于部分產(chǎn)地的栽培甘松采用仿野生栽培模式，因此質量與野生品較為接近。此外，由于甘松屬多年生草本，而此生代謝產(chǎn)物的積累往往與植物的生長年限相關，野生甘松生長年限等信息的不明確，亦會影響聚類分析的結果。因此，尚需開展不同采收期栽培甘松或不同生長年限的野生甘松質量評價研究。綜上，建立的分析方法基本可行，亦可為甘松的來源及產(chǎn)地識別提供支持。

3.4 綜合主成分評價模型指紋圖譜是中藥材質量評價、控制的主要手段之一，其可通過相似度評價體現(xiàn)不同批次藥材的差異；但當樣本量過大且相似度較為接近時，單一的指紋圖譜便不能有效、準確地判斷藥材質量的優(yōu)劣，往往需要結合統(tǒng)計學評價[15-17]。而綜合主成分評價法是在主成分分析的基礎上，在不損失或盡量少損失原樣本內(nèi)在指標信息的前提下，將數(shù)個具有一定相關性的指標通過加權計算，轉換成一個綜合指標F值，以此來進行綜合評價、考量，并據(jù)此對不同樣本進行優(yōu)劣排序。本研究建立的綜合主成分評價模型結果表明，S27、S25的F值最高，分別為隴南大田栽培品及阿壩仿野生栽培品，而系統(tǒng)聚類分析中當組間距離大于10時，S27、S25亦聚為一類，其它批次為一大類，二者結果保持一致；S2、S3的F值最低，均為甘南合作的野生品，而系統(tǒng)聚類分析中當組間距離小于3時，S2、S3聚為一類，故綜合主成分評價模型得到了系統(tǒng)聚類分析的驗證。因此，基于甘松藥材HPLC指紋圖譜構建的綜合主成分評價模型較好，具有一定參考價值。

4 小 結

本研究通過HPLC法建立了不同產(chǎn)地甘松藥材的指紋圖譜，通過主成分分析及系統(tǒng)聚類分析兩種統(tǒng)計學方法對色譜數(shù)據(jù)進行模式識別初探?；诜治鼋Y果，剔除了個別樣品，確定入選的樣品批次，最終得到了較為標準的甘松藥材對照指紋圖譜，為甘松藥材的質量評價研究奠定了基礎。此外，首次建立了基于指紋圖譜的甘松藥材綜合主成分評價模型。其評價結果與系統(tǒng)聚類基本保持一致，并能夠較好地體現(xiàn)相似度評價，其F值的優(yōu)劣排序具有一定的客觀性，可作為未來甘松藥材質量評價的手段。同時，研究結果亦表明不同產(chǎn)地的野生甘松藥材、野生與栽培甘松藥材的質量均具有明顯的差異。因此，基于本研究取得的成果，亟待進一步開展甘松野生與栽培品主要活性成分及不同產(chǎn)地甘松的主要活性成分含量研究，為甘松的產(chǎn)地與品質的相關性及甘松藥材的道地性提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐[18-21]。但本研究亦有不足之處，由于全部27批次甘松樣品生長年限等信息不明確，導致主要活性成分含量測定差異較大，未能得到與產(chǎn)地的相互關聯(lián)性分析，具有一定的局限性，還需進一步優(yōu)化樣品采集方式，深入開展相關研究。