超聲聯(lián)合血清MYCN、Smad7 mRNA檢測(cè)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷價(jià)值

張 明，蔣蘭君，左汴京，霍亞玲

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450018)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種起源于組織器官的交感神經(jīng)系統(tǒng)兒童惡性腫瘤，這種惡性腫瘤占所有兒童癌癥病例的8%～10%，占全球所有兒童腫瘤死亡病例的15%[1-2]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤確診時(shí)年齡小于18個(gè)月兒童的預(yù)后(即低風(fēng)險(xiǎn))要好于晚些時(shí)候診斷的兒童，而年齡的增長(zhǎng)反過(guò)來(lái)又與較差的預(yù)后(即高風(fēng)險(xiǎn))相關(guān)[3]。因此，及早準(zhǔn)確診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤可改善兒童預(yù)后。超聲檢查可明確腫瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu)及血流狀態(tài)等，一般用于尋找起源于腹部的腫瘤，通常作為疑似神經(jīng)母細(xì)胞瘤兒童的首選檢查方法之一[4]。MYCN是近幾年提出的一種與神經(jīng)母細(xì)胞瘤密切相關(guān)的標(biāo)志物，多項(xiàng)研究報(bào)道顯示MYCN擴(kuò)增是衡量神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療效果及預(yù)后的生物指標(biāo)[5-6]。Smad7與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤化療耐藥性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有密切聯(lián)系[7]。本研究收集48例手術(shù)或穿刺病理確診的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒，通過(guò)分析其超聲圖像特征及血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA檢測(cè)水平，探討其聯(lián)合后在兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年3月至2022年6月期間于河南省兒童醫(yī)院確診的48例神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒為神經(jīng)母細(xì)胞瘤組，患兒年齡1個(gè)月至7歲，平均年齡(2.78±1.06)歲，男26例，女22例；同期選取因腹脹、腹瀉、便秘、嘔吐等原因就診最終排除神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患兒50例作為對(duì)照組，患兒年齡2個(gè)月至7歲，平均年齡(2.82±1.01)歲，男28例，女22例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒經(jīng)查體、CT等檢查，且最終經(jīng)手術(shù)或穿刺病理確診，符合中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)小兒腫瘤專(zhuān)業(yè)委員會(huì)等編訂的《兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤診療專(zhuān)家共識(shí)》[8]；②患兒臨床資料完善，意識(shí)清楚，符合研究需要；③入選前未接受放化療或手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病或免疫系統(tǒng)疾病者；②有其他嚴(yán)重臟器疾病或腫瘤者；③有先天性心臟病或臟器畸形者。本研究經(jīng)由河南省兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，入選患兒家長(zhǎng)均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)：所有患兒均空腹采血，室溫下靜置30～60 min，采用離心機(jī)以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，提取血清保存?zhèn)溆?。采用美?guó)ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀進(jìn)行血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平的檢測(cè)。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)方法采用RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)R1200-100)提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，貨號(hào)J-SRP1105-100)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置20 μl體積的反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃、5 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，45個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量計(jì)算，MYCN、Smad7及內(nèi)參GAPDH的引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.2 超聲檢查：所有患兒均采用荷蘭Philips公司生產(chǎn)的Elite三維超聲診斷儀檢查，探頭頻率為5～12 MHz的線陣探頭及1～5 MHz的凸陣探頭。檢查前囑家長(zhǎng)使患兒空腹4 h，患兒取仰臥位或側(cè)臥位，常規(guī)掃查腹部、肝臟、腹腔淋巴結(jié)、雙側(cè)腎上腺、盆腔，發(fā)現(xiàn)腫瘤后進(jìn)行多切面檢查，主要觀察病灶大小、形態(tài)、位置、內(nèi)部回聲，是否發(fā)生遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，與周?chē)芗芭K器的關(guān)系，并采用彩色多普勒觀察腫瘤內(nèi)部血流情況。神經(jīng)母細(xì)胞瘤內(nèi)部血流分級(jí)：腫瘤內(nèi)未見(jiàn)血流信號(hào)為0級(jí)；腫瘤內(nèi)少量血流且可見(jiàn)點(diǎn)狀血流信號(hào)為Ⅰ級(jí)；中量血流，一個(gè)斷面上可見(jiàn)2～4個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)為Ⅱ級(jí)；血流豐富，可見(jiàn)彌漫性交織網(wǎng)狀血流顯示或4條以上血管為Ⅲ級(jí)[9]。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和對(duì)照組血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)水平比較 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤組和對(duì)照組血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)水平對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷價(jià)值 以血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平為檢驗(yàn)變量，是否為神經(jīng)母細(xì)胞瘤為狀態(tài)變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的曲線下面積(AUC)分別為0.867(95%CI:0.795～0.938)、0.818(95%CI:0.734～0.901)，特異度分別為88.00%、84.00%，靈敏度均為75.00%，臨界值分別為1.28、1.18,見(jiàn)圖1。

圖1 血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA表達(dá)水平診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤ROC曲線

2.3 超聲單獨(dú)及聯(lián)合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷價(jià)值 超聲檢查結(jié)果中假陽(yáng)性8例，假陰性11例(3例超聲誤診為肝母細(xì)胞瘤，4例超聲誤診為頸部淋巴瘤，4例超聲誤診為畸胎瘤)，超聲檢查與手術(shù)或穿刺病理結(jié)果比較，診斷符合率為77.08%(37/48)，其一致性較高，Kappa值為0.612(P<0.05)；超聲聯(lián)合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA(采用并聯(lián)試驗(yàn)進(jìn)行聯(lián)合診斷，即任一方法為陽(yáng)性則判定陽(yáng)性)檢查結(jié)果中假陽(yáng)性9例，假陰性4例，超聲檢查與手術(shù)或穿刺病理結(jié)果比較，診斷符合率為91.67%(44/48)，其一致性較高，Kappa值為0.735(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 超聲單獨(dú)及聯(lián)合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的診斷價(jià)值(例)

2.4 超聲、血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA單獨(dú)及聯(lián)合診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的效能比較 超聲聯(lián)合血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的靈敏度顯著高于三者單獨(dú)診斷(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 超聲、血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA單獨(dú)及聯(lián)合診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的效能比較[%(例/n)]

3 討 論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤雖發(fā)病率較低，但仍是兒童期最常見(jiàn)的實(shí)體瘤，發(fā)病年齡中位數(shù)為23個(gè)月，5歲后確診病例不到10%[10-11]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤在臨床上有顯著特性，從局部疾病自發(fā)消退到積極進(jìn)展，盡管目前有強(qiáng)化的多模式治療，但診斷為晚期的兒童預(yù)后不佳，5年總生存率約為40%[12]。既往臨床診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤主要以手術(shù)或穿刺病理結(jié)果為主，但其存在患兒耐受差、創(chuàng)傷大的弊端[13]。因此，需要新的輔助診斷方法。

超聲是一種公認(rèn)的周?chē)窠?jīng)檢查方法，它對(duì)神經(jīng)創(chuàng)傷、多發(fā)性神經(jīng)病、單神經(jīng)炎和神經(jīng)腫瘤的診斷和治療規(guī)劃具有很高的價(jià)值，由于其設(shè)備的不斷改進(jìn)，超聲軸向分辨率現(xiàn)在可以達(dá)到30 μm[14]。超聲具有成本效益高、易于獲取、無(wú)輻射等優(yōu)點(diǎn)，因此也適用于兒童的檢查[15]。此外超聲在多種癌癥的鑒別診斷及治療中均有重要作用[16-17]。本研究中超聲診斷與手術(shù)或穿刺病理結(jié)果的一致性相對(duì)較高，其Kappa值可達(dá)0.612，且診斷符合率為77.08%，與劉麗萍等[9]研究結(jié)果中的診斷準(zhǔn)確率83%相似。

MYCN是Myc基因家族中最具特征的成員之一，主要表達(dá)于間質(zhì)組織和神經(jīng)系統(tǒng)中，原癌基因MYCN的異常表達(dá)是高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分子標(biāo)志物，其高表達(dá)與患者腫瘤快速增長(zhǎng)、化學(xué)耐藥性及生存率低有關(guān)[18-19]。早期研究顯示，微小RNA-181c靶向作用于Smad7抑制其表達(dá)，可達(dá)到抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的目的[20]。表明Smad7在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮癌基因作用。本研究同樣顯示Smad7在神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒血清中高表達(dá)，推測(cè)其過(guò)度表達(dá)可能對(duì)激活神經(jīng)母細(xì)胞瘤腫瘤細(xì)胞活力有重要作用，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力，推動(dòng)腫瘤發(fā)生發(fā)展。ROC曲線結(jié)果顯示，血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA水平檢測(cè)可有效診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤，其診斷特異度分別為88.00%、84.00%。當(dāng)兩者臨床檢測(cè)水平高于其截?cái)嘀?.28、1.18時(shí)，診斷為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的概率可能更高。此外，超聲聯(lián)合血清指標(biāo)MYCN mRNA、Smad7 mRNA后診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤的靈敏度顯著增加。進(jìn)一步提示超聲聯(lián)合血清指標(biāo)可通過(guò)多方面綜合診斷，進(jìn)而使診斷效能得到提高，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的早期診斷提供了新的思路及臨床指導(dǎo)。

綜上，超聲與血清MYCN mRNA、Smad7 mRNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤有較高的診斷價(jià)值，其靈敏度較三者單獨(dú)診斷顯著提高，一定程度彌補(bǔ)了超聲診斷神經(jīng)母細(xì)胞瘤時(shí)因影像學(xué)特征不典型而導(dǎo)致的漏診。