外源2,4-表油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)茶樹(shù)低溫抗性的生理機(jī)制研究

李 鑫，李夢(mèng)菡，余紅偉，武雅嫻,3，張 蘭，韓文炎

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 建德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 建德 230036；3. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071000

茶樹(shù)[Camellia sinensis(L.) O. Ktze.]是多年生常綠喬木，具有喜溫畏寒的生長(zhǎng)特性[1]。近年來(lái)，隨著全球氣候變化的不斷加劇，茶樹(shù)等園藝作物越來(lái)越容易遭受低溫凍害和高溫干旱等極端環(huán)境的影響。我國(guó)北方茶區(qū)冬季氣溫偏低，茶園易受凍害而出現(xiàn)越冬困難；南方茶區(qū)尤其是江南茶區(qū)，在春季常遭受“倒春寒”影響，給當(dāng)?shù)孛麅?yōu)茶的生產(chǎn)帶來(lái)較大影響[2]。近年有關(guān)茶樹(shù)遭受倒春寒危害的報(bào)道也在不斷增加。隨著早芽良種的培育、肥培管理水平的提高以及先進(jìn)科學(xué)技術(shù)的推廣應(yīng)用，茶葉發(fā)芽時(shí)間日趨提早，倒春寒對(duì)名優(yōu)茶生產(chǎn)的影響也日益嚴(yán)重[3]。茶樹(shù)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，低溫脅迫會(huì)嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)?？梢?jiàn)，探究茶樹(shù)低溫抗性調(diào)控的生理機(jī)制以及研發(fā)茶樹(shù)低溫抗性栽培技術(shù)是科研和生產(chǎn)中亟待解決的重要問(wèn)題。

油菜素甾醇類化合物（Brassinosteroids，BRs）是從油菜的花粉中分離鑒定的一類新型植物激素[4]，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，對(duì)植物適應(yīng)或抵抗逆境脅迫也具有重要作用[5]。目前，具有較高生物活性的油菜素內(nèi)酯類似物表油菜素內(nèi)酯（2,4-epibrassinolide，EBR）在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上已廣泛應(yīng)用[6]。近年來(lái)，已有較多研究對(duì)于EBR在改善植物逆境脅迫方面進(jìn)行了探究。張愛(ài)敏等[7]用不同質(zhì)量濃度EBR處理低溫脅迫下黃瓜種子，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度EBR處理可提高黃瓜種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率及側(cè)根數(shù)等，減輕種子萌發(fā)和幼苗受到的低溫傷害。石玲等[8]發(fā)現(xiàn)EBR能調(diào)控杏果實(shí)采后的活性氧代謝，增強(qiáng)杏果實(shí)采后抗病性。Shu等[9]在研究低溫和弱光條件下外源EBR對(duì)番茄葉片的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，EBR可減輕低溫脅迫引起的對(duì)光合作用和氮代謝的有害影響，從而改善植物生長(zhǎng)。李淑葉等[10]也發(fā)現(xiàn)，外源EBR可通過(guò)降低棉花幼苗的相對(duì)電導(dǎo)率、提高葉片光能捕獲能力及光合電子傳遞能力等緩解低溫對(duì)棉花光合作用的抑制。

綜上，外源噴施油菜素內(nèi)酯為緩解茶樹(shù)的低溫脅迫狀況提供了新思路，我們前期的研究也探明了外源EBR對(duì)茶樹(shù)光合特性及耐熱性影響的生理機(jī)制[11-12]。然而，目前有關(guān)BRs誘導(dǎo)茶樹(shù)低溫抗性的生理機(jī)制尚不明確，有必要開(kāi)展進(jìn)一步研究。本研究以茶樹(shù)品種‘龍井43’為材料，通過(guò)外源EBR處理茶樹(shù)葉片，探究低溫脅迫下茶樹(shù)葉片過(guò)氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2-·）、茶多酚、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等抗氧化酶活性的變化，并結(jié)合茶多酚生物合成中部分關(guān)鍵基因（PAL、CHI、C4H、CHS）的表達(dá)量分析，以解析外源表油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)茶樹(shù)對(duì)低溫脅迫抗性的生理機(jī)制，為茶樹(shù)逆境栽培技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試茶樹(shù)品種選用‘龍井43’，系中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所培育并推廣種植的茶樹(shù)優(yōu)質(zhì)品種。選擇生長(zhǎng)狀態(tài)一致、無(wú)病蟲(chóng)害侵襲的三年生茶樹(shù)幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。用濃度為0.1 μmol/L的EBR（含0.3‰有機(jī)硅）噴施葉面，直至葉片滴水為止，以含相同濃度有機(jī)硅的清水進(jìn)行噴施作為對(duì)照。

葉面噴施12 h后，將茶樹(shù)幼苗分別置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常溫處理（25℃）和低溫處理（-4℃）。兩個(gè)培養(yǎng)箱的其他環(huán)境因子設(shè)置相同，平均光強(qiáng)為600 μmol/m2·s，平均相對(duì)濕度控制為80%。

最終試驗(yàn)分為4個(gè)處理：（1）對(duì)照（Control），即清水噴施處理后置于25℃常溫；（2）常溫下表油菜素內(nèi)酯預(yù)處理（EBR），即在茶樹(shù)葉面均勻噴施EBR后置于25℃常溫；（3）單一低溫處理（Cold），即清水預(yù)處理后置于-4℃低溫；（4）表油菜素內(nèi)酯和低溫的復(fù)合處理（EBR + Cold），即將葉面噴施EBR后的幼苗置于-4℃低溫。經(jīng)人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行不同溫度處理30 min后，取從頂芽向下第三張葉片進(jìn)行DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）和NBT（氮藍(lán)四唑）染色；取一芽及半展葉用于基因表達(dá)分析；取一芽二葉稱重后置于液氮中用于其他生理指標(biāo)的測(cè)定。每次測(cè)量設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 H2O2和O2-·的定性檢測(cè)

H2O2的存在采用DAB染色法檢測(cè)，O2-·的存在采用NBT染色法檢測(cè)[13]，兩種染色液均現(xiàn)配現(xiàn)用。染色：將葉片用蒸餾水洗凈，取各組葉圓片分別置于染液中抽真空5 ～ 10 min，在25℃室溫下染色約5 h至葉片出現(xiàn)明顯斑點(diǎn)。脫色：將離心管中的染液倒掉，加入無(wú)水乙醇后沸水浴10 min。重復(fù)三次左右，直至葉圓片完全脫綠，用顯微鏡觀察拍照（Leica DM4000B &DFC425，萊卡公司，德國(guó)）。

1.2.2 茶多酚含量測(cè)定

采用酒石酸亞鐵比色法（GB/T 8313—2002）[14]。將茶樣磨成粉末后稱取0.1 g于10 mL離心管中，加入5 mL純水后置于100℃沸水浴中浸提5 min，中途振蕩一次使茶樣和水充分混勻。結(jié)束后立即置于冰水浴中快速冷卻，在4℃條件下12000 g離心10 min，取上清液用于茶多酚含量測(cè)定。吸取1 mL上清液于25 mL的容量瓶中，加入4 mL超純水和5 mL酒石酸亞鐵溶液，混勻后再加入pH 7.5的磷酸緩沖液至刻度，搖勻后測(cè)定D540吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算茶多酚含量。

1.2.3 MDA含量分析

參照Cakmak等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。取0.3 g樣品加入提取液（50 mmol/L磷酸緩沖液，0.2 mmol/L EDTA和2% PVP）研磨后，離心20 min，取上清液待測(cè)。在1 mL上清液中加入3 mL TBA反應(yīng)液，95℃水浴條件下保溫30 min，立即置于冰水浴中冷卻。然后在4℃環(huán)境下1500 g離心10 min，測(cè)定D532和D600的吸光值。

1.2.4 抗氧化酶活性測(cè)定

提取方法與上述MDA提取方法[15]相同。

超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定方法參照 Gi-annopolitis等[16]。酶液 50 μL 中加入3 mL 50 mmol/L 磷酸緩沖液（pH 7.8, 15 mmol/L甲 硫 氨 酸，2.0 μmol/L核 黃 素，65 μmol/L NBT和0.1 mmol/L EDTA），由緩沖液替代酶液作為空白管。在室溫和光強(qiáng)100 μmol/m·s條件下照光10 min，置于暗下終止反應(yīng)，測(cè)定D560吸光值。

愈創(chuàng)木酚過(guò)氧化物酶（G-POD）參照Cakmak等[15]的方法測(cè)定。酶液100 μL中加入1700 μL 25 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0, 0.1 mmol/L EDTA）、100 μL 20 mmol/L 過(guò)氧化氫和100 μL 1%愈創(chuàng)木酚，在25℃條件下反應(yīng)，分析D470的動(dòng)力學(xué)變化。

過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定參照Cakmak等[15]的方法并略作改進(jìn)。酶液100 μL中加入1700 μL 25 mmol/L 磷酸緩沖液（pH7.0, 0.1 mmol/L EDTA）和200 μL 10 mmol/L過(guò)氧化氫。在25℃條件下反應(yīng)，分析D470的動(dòng)力學(xué)變化。

抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）活力的測(cè)定參照Nakano等[17]的方法并略作改進(jìn)。吸取酶液 100 μL，加入 1700 μL 25mmol/L PBS（pH 7.0，含 0.1 mmol/L EDTA）、100 μL 20 mmol/L H2O2及100 μL 5 mmol/L ASA（抗壞血酸），充分混合后測(cè)定40 s內(nèi)D290的動(dòng)力學(xué)變化（消光系數(shù)為2.8 mmol/L·cm）。

1.2.5 qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）分析

茶樹(shù)葉片總RNA提取采用Invitrogen TRIzol?試劑盒按說(shuō)明書(shū)方法提取，RNA濃度采用NanoDrop?ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，利用變性瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行RNA質(zhì)量的檢測(cè)，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，qRT-PCR使用SYBR?Premix EX Taq? II（Tli RNaseH Plus）熒光定量試劑盒，并利用StepOnePlus? Real-Time PCR System進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)程序設(shè)置如下：在94℃預(yù)變性2 min；98℃條件下變性10 s，56℃退火30 s后在68℃延伸2 min，總共35個(gè)循環(huán)；在72℃條件下延伸10 min。CsPTB作為內(nèi)參基因，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。PCR循環(huán)完成后的熔解曲線證實(shí)PCR產(chǎn)物均為單一性物質(zhì)，并根據(jù)Livak等[18]的方法計(jì)算基因表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Table 1 Primers used for real time RT-PCR

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Microsoft Excel 2019及SAS 9.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，用Origin Pro 8.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片中活性氧自由基的影響

低溫脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多種活性氧自由基。本試驗(yàn)采用DAB及NBT染色法，定性檢測(cè)了外源EBR處理后茶樹(shù)葉片內(nèi)H2O2和O2-·含量的變化。由圖1可見(jiàn)，與對(duì)照相比，外源EBR常溫處理（EBR）后DAB及NBT染色情況無(wú)明顯變化，而低溫處理（Cold）后，DAB被氧化生成的暗棕色顆粒顯著增多，NBT被氧化出現(xiàn)較大藍(lán)色斑點(diǎn)，表明受到低溫脅迫后葉片中H2O2和O2-·會(huì)大量積累。而與單一低溫處理（Cold）相比，經(jīng)外源EBR預(yù)處理后低溫脅迫誘導(dǎo)的茶樹(shù)葉片內(nèi)DAB染色生成的暗棕色面積顯著減小，NBT染色生成的藍(lán)色斑點(diǎn)面積也明顯縮小。上述現(xiàn)象說(shuō)明，低溫脅迫會(huì)使茶樹(shù)葉片中的H2O2及O2-·含量大量增加，而外源EBR預(yù)處理則能顯著降低活性氧自由基的積累，緩解茶樹(shù)低溫脅迫下的氧化損傷情況。

圖1 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片DAB及NBT染色的影響Figure 1 The effect of EBR treatment on DAB and NBT staining in tea leaves under cold stress

2.2 外源EBR對(duì)低溫脅迫下茶樹(shù)葉片茶多酚含量的影響

茶多酚不僅是茶葉中重要的滋味物質(zhì)，還具有很強(qiáng)的抗氧化性。張建忠等[19]發(fā)現(xiàn)，茶多酚的抗衰老、抗輻射、抗菌等功能與其清除自由基的抗氧化效果密切相關(guān)。由圖2可知，與對(duì)照相比，外源EBR處理（EBR）及單一低溫處理（Cold）后，茶樹(shù)葉片中的茶多酚含量均無(wú)顯著差異。然而，經(jīng)外源EBR預(yù)處理后進(jìn)行低溫處理（Cold + EBR），茶樹(shù)葉片內(nèi)茶多酚含量顯著提高（P＜0.05），較單一低溫處理相比提高13.37%（圖2）。由此可見(jiàn)，外源EBR處理能顯著增加低溫脅迫下茶樹(shù)葉片中的茶多酚含量，提高茶樹(shù)的抗氧化能力。

圖2 EBR對(duì)低溫脅迫下茶樹(shù)葉片茶多酚含量的影響Figure 2 The effect of EBR treatment on the tea polyphenols content in tea leaves under cold stress

2.3 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片中MDA含量的影響

由于低溫脅迫下植物細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生了膜脂過(guò)氧化過(guò)程，從而使細(xì)胞膜通透性加大，膜相分離產(chǎn)生大量丙二醛（MDA）。在對(duì)植物低溫抗性的生理研究中，細(xì)胞內(nèi)的MDA含量常作為衡量植物低溫抗性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一，MDA含量越高，說(shuō)明細(xì)胞膜受到的損傷越嚴(yán)重[20]。由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照相比，外源EBR常溫處理（EBR）后的茶樹(shù)葉片內(nèi)MDA含量顯著降低了15.65%（P＜0.05），但在單一低溫處理（Cold）后MDA含量又比對(duì)照明顯提高了19.49%（P＜0.05）。然而，與單一低溫處理（Cold）相比，經(jīng)外源EBR和低溫前后復(fù)合處理（Cold + EBR）的茶樹(shù)葉片內(nèi)的MDA含量顯著減少（P＜0.05），降幅達(dá)21.79%（圖3）。因此，外源EBR預(yù)處理能夠減少低溫脅迫導(dǎo)致的MDA含量過(guò)度積累，從而有效緩解膜脂過(guò)氧化過(guò)程對(duì)細(xì)胞膜的損傷。

圖3 EBR對(duì)低溫脅迫下茶樹(shù)葉片中MDA含量的影響Figure 3 The effect of EBR treatment on the MDA content in tea leaves under cold stress

2.4 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片中抗氧化酶活性的影響

本研究對(duì)抗氧化酶系統(tǒng)中的4種關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行了研究，即超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）及抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）。由圖4B和圖4D可知，外源EBR常溫處理（EBR）可顯著提高細(xì)胞內(nèi)POD和APX活性（P＜0.05），與對(duì)照相比分別提高了15.00%和14.08%，而常溫處理（EBR）對(duì)SOD和CAT活性的提高則不顯著。經(jīng)低溫脅迫（Cold）后，與對(duì)照相比，茶樹(shù)葉片內(nèi)SOD的活性顯著降低了13.16%（P＜0.05），而POD、CAT、APX活性稍有下降但響應(yīng)不顯著。但與單一低溫處理相比，經(jīng)外源EBR和低溫脅迫復(fù)合處理（Cold + EBR）后茶樹(shù)葉片中SOD活性提高了8.41%，但未達(dá)顯著水平；而APX、POD、CAT活性則顯著提高（P＜0.05），分別提高了27.85%、35.32%和124.94%，其中對(duì)CAT活性的提高最為顯著?？梢?jiàn)，在茶樹(shù)受到低溫脅迫后外源EBR預(yù)處理能夠在不同程度提高茶樹(shù)葉片中抗氧化酶活性，從而增強(qiáng)抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)活性氧自由基的清除能力。

圖4 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片中抗氧化酶活性的影響Figure 4 The effect of EBR treatment on antioxidant enzymes activity in tea leaves under cold stress

2.5 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片茶多酚合成基因表達(dá)量的影響

茶多酚中的主要成員類黃酮是大多數(shù)氧自由基的清除劑，能減少M(fèi)DA的產(chǎn)生[21]。在類黃酮合成途徑中，苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸羧化酶（C4H）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、查爾酮合成酶（CHS）是研究較多的關(guān)鍵酶[22]。在本試驗(yàn)中，茶樹(shù)經(jīng)外源EBR常溫處理（EBR）后，C4H和CHS的基因表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），與對(duì)照相比分別上調(diào)了24.32%和166.75%，而PAL和CHI的表達(dá)量略有上調(diào)但不顯著（圖5）。在受到低溫脅迫（Cold）后，茶樹(shù)葉片中C4H、CHS、CHI的表達(dá)量無(wú)顯著變化，而PAL的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），比對(duì)照上調(diào)了78.24%。與低溫脅迫單獨(dú)處理（Cold）相比，經(jīng)外源EBR和低溫脅迫復(fù)合處理（Cold + EBR）后PAL、CHI、CHS的表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.05），分別上調(diào)了56.10%、98.27%和448.45%，僅有C4H表達(dá)量的上調(diào)未達(dá)顯著水平?？梢?jiàn)，外源EBR能調(diào)控茶多酚合成關(guān)鍵基因的表達(dá)，不同程度地上調(diào)了PAL、CHI、CHS和C4H的表達(dá)量，從而提高茶樹(shù)葉片中茶多酚含量。

圖5 低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理對(duì)茶樹(shù)葉片中茶多酚合成基因表達(dá)量的影響Figure 5 The effects of EBR treatment on the gene expression of tea polyphenols synthesis in tea leaves under cold stress

3 討論

茶樹(shù)生長(zhǎng)的適宜溫度為20℃ ～ 25℃，當(dāng)溫度低于15℃時(shí)其新梢生長(zhǎng)減緩；而當(dāng)溫度低于-6℃時(shí)，茶樹(shù)將會(huì)嚴(yán)重受害[23]。低溫脅迫可通過(guò)誘導(dǎo)膜脂過(guò)氧化等過(guò)程影響植物的逆境響應(yīng)。在非逆境條件下植物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而在逆境條件下這種平衡會(huì)被打破，大量自由基的產(chǎn)生會(huì)使植物受到損傷[20]。油菜素內(nèi)酯（BR）被認(rèn)為可以提高植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。在對(duì)辣椒[24]、棉花[25]、黃瓜[7]等園藝作物的研究中已發(fā)現(xiàn)，BRs能夠顯著增加植物抗氧化物酶活性及抗氧化物質(zhì)的含量，從而提高作物的抗逆性。本研究的結(jié)果表明，低溫處理后，茶樹(shù)葉片細(xì)胞內(nèi)H2O2和O2-·含量明顯提高；而在外源EBR預(yù)處理后，低溫脅迫下茶樹(shù)葉片細(xì)胞內(nèi)H2O2和O2-·含量顯著減少（圖1）。這說(shuō)明外源EBR預(yù)處理能有效清除低溫脅迫下茶樹(shù)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的累積，減輕活性氧（ROS）帶來(lái)的氧化脅迫。同時(shí)，低溫下ROS積累對(duì)生物膜造成的損傷還會(huì)啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使膜內(nèi)脂雙分子層中含有的不飽和脂肪酸鏈降解，從而破壞了細(xì)胞膜的完整性，使過(guò)氧化產(chǎn)物MDA積累，電解質(zhì)外滲，嚴(yán)重時(shí)可造成細(xì)胞死亡[26]。王英姿等[27]的研究也發(fā)現(xiàn)H2O2和O2-·的積累可能激發(fā)了MDA的大量產(chǎn)生。在本研究中，外源EBR處理能顯著降低低溫脅迫后茶樹(shù)葉片細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累的MDA含量（圖3）。這表明，在EBR預(yù)處理的條件下低溫脅迫導(dǎo)致的茶樹(shù)葉片細(xì)胞膜受到的ROS損傷得到緩解，從而抑制茶樹(shù)葉片的膜脂過(guò)氧化過(guò)程。該結(jié)果與辣椒[24]和葡萄[27]等方面的相關(guān)研究結(jié)論一致，即低溫脅迫下EBR預(yù)處理能夠保護(hù)作物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。

低溫脅迫下植物體內(nèi)活性氧自由基的積累受多方面因素調(diào)控，主要包括抗氧化酶和非酶類抗氧化物質(zhì)，其中抗氧化物酶在保護(hù)作物免受ROS積累導(dǎo)致的氧化脅迫中發(fā)揮著重要作用[26]。在本研究中，茶樹(shù)遭受低溫脅迫后抗氧化物酶活性受到不同程度的抑制（圖4），且SOD活性更易受到低溫抑制，對(duì)超氧陰離子的清除能力明顯降低，導(dǎo)致茶樹(shù)葉片內(nèi)ROS大量積累。而低溫下外源EBR預(yù)處理后茶樹(shù)葉片中抗氧化物酶活性均得到提升，POD、CAT、APX的活性顯著增強(qiáng)，且CAT活性的增幅高達(dá)124.94%，說(shuō)明葉片細(xì)胞對(duì)H2O2的清除能力大幅度提高。這與高山離子芥[28]和甘薯[29]等作物中的研究結(jié)論基本一致。這說(shuō)明外源EBR能夠通過(guò)增強(qiáng)茶樹(shù)的抗氧化酶活性來(lái)清除低溫脅迫下細(xì)胞內(nèi)過(guò)度積累的ROS，有效地緩解低溫脅迫對(duì)茶樹(shù)造成的氧化脅迫。

在茶樹(shù)葉片中，類黃酮等多酚類物質(zhì)也發(fā)揮著重要的抗氧化作用，其抗氧化能力是人工合成抗氧化劑的4 ～ 10倍，且在茶葉中的含量遠(yuǎn)超其他植物。張建忠等研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚具有清除自由基的抗氧化效果[19]。本研究結(jié)果表明，低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理能顯著提高茶樹(shù)葉片中茶多酚的含量（圖2）?；虮磉_(dá)數(shù)據(jù)顯示，低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理能誘導(dǎo)PAL、CHI、CHS的表達(dá)量顯著上調(diào)，且CHS的表達(dá)量增幅高達(dá)448.45%。在類黃酮合成代謝的早期階段，PAL、C4H、4CL等關(guān)鍵酶催化苯丙氨酸反應(yīng)生成香豆酰-CoA，CHS則將香豆酰-CoA和丙二酰-CoA共同催化轉(zhuǎn)變?yōu)椴闋柾?，之后查爾酮被CHI催化生成的柚皮素是所有類黃酮物質(zhì)合成的直接前體[22]。因此，低溫脅迫下外源EBR預(yù)處理能顯著上調(diào)類黃酮合成代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)量，促進(jìn)了類黃酮含量的提高，從而進(jìn)一步提升了茶樹(shù)在低溫下的抗氧化能力。

此外，研究還發(fā)現(xiàn)，在正常溫度下噴施EBR對(duì)茶樹(shù)的抗氧化物酶活性、茶多酚含量的增幅均明顯低于在低溫脅迫下噴施EBR的效果。這說(shuō)明EBR可能在維持ROS的形成與消除的動(dòng)態(tài)平衡中擔(dān)任著重要角色，這與楊萍等[24]的研究結(jié)果一致。然而，在低溫脅迫下外源EBR調(diào)控茶樹(shù)抗氧化酶活性和類黃酮合成相關(guān)基因表達(dá)的分子機(jī)制及其信號(hào)途徑，還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究表明外源EBR能夠有效緩解低溫脅迫對(duì)茶樹(shù)造成的氧化脅迫。這主要是由于外源EBR預(yù)處理能夠顯著增強(qiáng)茶樹(shù)葉片中抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、POD、CAT、APX）的活性，從而提高茶樹(shù)對(duì)活性氧自由基的清除能力，降低MDA的含量，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，在一定程度上緩解了低溫脅迫下活性氧對(duì)茶樹(shù)細(xì)胞膜的損傷。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，外源EBR預(yù)處理還能通過(guò)誘導(dǎo)類黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因（PAL、CHI、CHS、C4H）表達(dá)量的上調(diào)，促進(jìn)葉片中茶多酚等抗氧化物質(zhì)的積累，從而增強(qiáng)了低溫下茶樹(shù)的抗氧化能力。因此，外源EBR預(yù)處理能夠通過(guò)平衡茶樹(shù)葉片中活性氧自由基的產(chǎn)生與清除，最終有效緩解低溫脅迫對(duì)茶樹(shù)的傷害，增強(qiáng)茶樹(shù)對(duì)低溫脅迫的耐受性。