基于RAPD分子標(biāo)記的藜蒿種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

王宇航，魏清瑩，薛天源，何思曉，陳偉達(dá)，董元火，曾長立

(江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056)

藜蒿(Artemisiaselengensis)，又名蔞蒿、蘆蒿、水蒿，是菊科蒿屬的一種多年生草本植物。蒿屬(Artemisia Linn)全屬約300余種，常見植物有黃花蒿、青蒿、艾蒿和冷蒿等，主要分布于亞洲、歐洲、北美洲的溫帶和亞熱帶地區(qū)等。其中，我國蒿屬植物有180余種，主要分布在東北、華北、西北和西南[1]。藜蒿嫩莖為青綠色或紫紅色；嫩葉多為青綠色，老葉為深綠色；具有大量側(cè)根和纖維狀須根，有匍匐的地下莖，整株直立生長[2]。藜蒿含有多種藥理活性物質(zhì)如黃酮、綠原酸和多酚等，具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]等作用；同時也富含粗纖維、多糖和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，作為蔬菜的同時兼具保健功能。藜蒿種質(zhì)資源分布范圍廣泛、分化復(fù)雜且物種間差異小，形態(tài)學(xué)等常規(guī)方法難以有效鑒定和區(qū)分不同種質(zhì)資源。目前，已知的藜蒿基因組信息較少且不夠完整，不便于采用基因或基因組學(xué)方法加以鑒別和區(qū)分。

采用DNA分子標(biāo)記進(jìn)行物種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等工作，與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記不受季節(jié)、環(huán)境限制，在揭示物種多樣性的變化程度和分布方面具有無可比擬的優(yōu)勢[5]。張淑艷[6]利用ISSR和RAPD分子標(biāo)記對3個近緣種沙蒿的15個種群進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，兩種標(biāo)記結(jié)果均顯示3種蒿大部分遺傳變異存在于種群內(nèi)，3個近緣種種群間遺傳分化較小。Pandey等[7]通過形態(tài)學(xué)表征和RAPD標(biāo)記進(jìn)行建樹聚類，并開發(fā)出與青蒿素含量連鎖的標(biāo)記，為鹽漬地種植青蒿變種提供了可能。Younsi等[8]對8個野生種群共80個白蒿個體進(jìn)行RAPD和ISSR標(biāo)記分析，結(jié)果顯示其群體內(nèi)存在高水平的遺傳多樣性，對于該藥用物種的資源保護(hù)具有重要意義。Nganthoi等[9]利用RAPD、ISSR、IRAP三種分子標(biāo)記評估了4個蒿屬分類群之間的遺傳關(guān)系，觀察到了高水平多態(tài)性，并通過進(jìn)化樹的分析將4個分類群歸為2個組群。Huong Thi Nguyen[10]利用RAPD和ISSR標(biāo)記對9份艾草資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果證實(shí)艾草種內(nèi)變異性很大。Elmeer等[11]利用RAPD和SRAP對3個不同海拔的18個白蒿個體的遺傳變異進(jìn)行了研究，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示其可分為2個主要類群，結(jié)果表明遺傳關(guān)系與植物的地理位置分布相關(guān)；Oyundelger等[12]利用全基因組測序技術(shù)開發(fā)了新的物種特異性簡單序列重復(fù)(SSR)標(biāo)記，對沿蒙古大氣候梯度分布的11個冷蒿種群分析發(fā)現(xiàn)，整個蒙古草原的冷蒿種群中存在著大量的基因流。

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(RAPD)是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的分子標(biāo)記技術(shù)，操作簡單、快速、成本低，被廣泛用于物種分類、種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析[13]。目前，鮮有應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)對藜蒿種質(zhì)資源進(jìn)行分類鑒定和遺傳多樣性分析的研究報道。因此，本研究采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對國內(nèi)收集到的102份藜蒿種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)分類和遺傳多樣性分析，以明晰不同品系藜蒿資源的親緣關(guān)系，為藜蒿種質(zhì)資源的遺傳多樣性保護(hù)和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的102份藜蒿材料收集于全國6個省份，后種植于湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心漢南基地藜蒿種質(zhì)資源圃。因試驗材料均為未登記品種，所以本文以序號代表(表1)。試驗所用材料均為健康生長且無病蟲害污染的新鮮植物葉片。

表1 102份藜蒿材料信息Table 1 Information of 102 Artemisia selengensis

1.2 藜蒿基因組DNA提取與檢測

剪取各品系幼嫩葉片用液氮研磨成粉末，采用改良的CTAB方法提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；使用超微量分光光度計測定各樣品DNA濃度，然后用ddH2O稀釋至30 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RAPD引物合成及篩選

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[14-18]，最終選取18條RAPD引物交由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司進(jìn)行合成(表2)。首先，從各種群中分別選取1個代表性樣品DNA進(jìn)行引物初篩，再根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行復(fù)篩，對于條帶清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好和擴(kuò)增效率高的引物，將用于后續(xù)實(shí)驗。

1.4 RAPD擴(kuò)增體系及程序

反應(yīng)總體積(20 μL)為：模板DNA 1.5 μL(25 ng/μL)；引物0.8 μL(35 ng/μL)；2×Es Taq Master Mix(含有Es Taq DNA Polymerase，3 mM MgCl2和400 μM每種dNTP)9 μL；ddH2O補(bǔ)足至20 μL。

擴(kuò)增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，34 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)果在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

表2 RAPD-PCR引物列表Table 2 List of Primers for RAPD-PCR

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

選擇擴(kuò)增結(jié)果清晰、可重復(fù)的條帶進(jìn)行統(tǒng)計，在同一位點(diǎn)出現(xiàn)條帶的記為“1”，條帶不清晰或無條帶則記為“0”，使用Excel表格記錄統(tǒng)計結(jié)果，最后生成二元的“0”、“1”矩陣，利用R軟件進(jìn)行遺傳距離計算和進(jìn)化樹構(gòu)建，使用POPGENE32軟件進(jìn)行遺傳多樣性分析，利用STRUCTURE v2.3.4軟件進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜蒿樣本基因組DNA提取結(jié)果

供試材料的DNA使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶清晰完整(圖1)，使用超微量分光光度計測定基因組DNA濃度在200～600 ng/μL，OD260/OD280值在1.8～2.0左右，可以用于后續(xù)的RAPD-PCR試驗分析。

圖1 藜蒿DNA檢測電泳圖Figure 1 Electrophoresis of Artemisia selengensis DNA detection注：1～15表示供試材料1～15號，M為2 000 bp DNA marker

2.2 藜蒿擴(kuò)增多態(tài)性分析

從18條設(shè)計的RAPD引物中共篩選出11條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性高和重復(fù)性好的引物(表3)，對6個省份的102個藜蒿樣本進(jìn)行RAPD-PCR擴(kuò)增，引物AG擴(kuò)增結(jié)果如(圖2)。結(jié)果共獲得95個條帶，每條引物平均擴(kuò)增出8.6個條帶，擴(kuò)增條帶最多的引物為OPC-8，擴(kuò)增出13條，引物AL擴(kuò)增條帶最少，僅7條，所有引物擴(kuò)增的片段大小范圍在200～2 000 bp，其中多態(tài)性位點(diǎn)93個，多態(tài)性位點(diǎn)比率為97.89%，表明本研究所用的RAPD引物具有高的多態(tài)性，種群間Nei遺傳多樣性指數(shù)(H)標(biāo)準(zhǔn)差為0.152 3，均值為0.288 3，Shannon遺傳多樣性指數(shù)(I)標(biāo)準(zhǔn)差為0.196 9，均值為0.444 5，表明收集的藜蒿種質(zhì)資源具有豐富的的遺傳多樣性。(表4)。

表3 試驗所用的RAPD引物Table 3 RAPD primers used in the experiment

表4 102份藜蒿樣品遺傳多樣性信息Table 4 102 genetic diversity information of Artemisia selengensis samples

圖2 引物AG對102份藜蒿材料的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 Electrophoresis of the amplification products of primers AG to 102 samples of Artemisia selengensis

2.3 遺傳分化分析

對藜蒿6個種群的總基因多樣性(Ht)和種群內(nèi)基因多樣性(Hs)分析發(fā)現(xiàn)，Ht值為0.249 3，Hs值為0.146 9表明遺傳變異主要是由于種群內(nèi)部變異引起的；藜蒿種群間基因分化系數(shù)為41.09%，種群內(nèi)為58.91%，基因流(Nm)為0.717 0，表明種群之間基因交流程度低(表5)。

表5 藜蒿遺傳分化分析

2.4 藜蒿種群間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分析

利用POPGENE32軟件對藜蒿6個種群的遺傳距離和遺傳相似系數(shù)進(jìn)行計算，結(jié)果表明，POP1和POP5、POP2的遺傳距離顯著小于其它種群，其中POP1和POP5最近，為0.044 0，表明這2個種群之間存在頻繁的基因交流，具有相似的遺傳信息。POP1與POP2遺傳距離為0.061 5，表明POP1與POP5、POP2有著密切的親緣關(guān)系；而POP4和POP6兩個種群之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.274 9，表明這2個種群之間基因流動較少(表6)。遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果和遺傳距離分析結(jié)果趨于一致，6個種群聚類如(圖3)，在遺傳距離為0.1時，分為兩個組，第一組中湖北先和江西聚在一起，然后依次與湖南、江蘇和安徽聚為一支，種群之間存在基因交流，第二組云南單獨(dú)為一支，與其他種群遺傳距離較遠(yuǎn)。

表6 藜蒿6個種群遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 6 Genetic similarity coefficient and genetic distance of 6 populations of Artemisia selengensis

圖3 6個藜蒿種群聚類圖Figure 3 Chuster diagram of 6 Artemisia selengensis populations

2.5 RAPD分子標(biāo)記聚類分析

使用R軟件將RAPD標(biāo)記矩陣進(jìn)行分析并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，基于遺傳距離的UPGMA聚類分析顯示，102個藜蒿個體的遺傳相似系數(shù)在0.61～0.98之間(見圖4)。當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.62時，102份材料可分為三大組。第1組包含96份藜蒿樣本，第2組包含5個藜蒿樣本，均來自于湖北，第三組來自于湖南的19號藜蒿樣本單獨(dú)分為一支。當(dāng)相似系數(shù)在0.68時，第一大組又分為五個亞組，第一個亞組數(shù)量最多包含90個樣本，江蘇的2個樣本21和62聚為第二亞組，湖北的樣本71、樣本72聚為一個分支組成第三亞組，樣本52單獨(dú)分支為第四亞組，樣本61單獨(dú)聚為一支為第五亞組。其中第一個亞組中，6個種群的樣本并未按照各自種群分別聚為一類，而是隨機(jī)分布在所在樣本的小分支。通過對6個省份102份藜蒿資源的聚類分析，結(jié)果表明樣本之間遺傳距離較小，親緣關(guān)系密切，藜蒿不同群體之間存在不同程度的基因流動。

2.6 群體結(jié)構(gòu)分析

藜蒿多為無性繁殖，但是群體內(nèi)單株也會產(chǎn)生遺傳突變。為進(jìn)一步揭示藜蒿單株種質(zhì)的遺傳組分，研究利用STRUCTURE2.3.4軟件對102份藜蒿材料的RAPD標(biāo)記位點(diǎn)信息進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析?；贓vanno[19]的ΔK方法進(jìn)行貝葉斯聚類分析的結(jié)果顯示，ΔK值最高且K=3，根據(jù)具有不同遺傳結(jié)構(gòu)的每個樣本百分比，可以將藜蒿材料分為3個亞群。在K=3時產(chǎn)生RAPD的最高峰值，表明試驗材料中有三個可能的信息亞群(圖5)。因此，供試的102份藜蒿材料被分為3個大組，紅色(第1組)、綠色(第2組)和藍(lán)色(第3組)。

群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中三個大組，第1組包含40個樣本，4份來源于湖南，安徽和云南各1份，其余來源于湖北；第2組包含41個樣本，2份來源于江西，安徽和江蘇各1份，剩余為湖北樣本；第3組包含10個樣本，1份來自于湖南，其余來自于湖北；另外11個樣本遺傳結(jié)構(gòu)來源復(fù)雜，無法明確歸屬類群。6個種群102份材料在劃分的3個組中交叉分散分布，存在一定的基因流動。模型聚類結(jié)果在一定程度上與距離聚類表現(xiàn)出一致性，更直觀的展現(xiàn)了各個樣本之間的親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記技術(shù)由于其操作簡單、快速，成本低，是研究種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性以及群體結(jié)構(gòu)分析的常用方法[20]。本研究從18條RAPD引物中共篩選出11個條帶清晰、多態(tài)性高和穩(wěn)定性好的引物，并用其對102份藜蒿種質(zhì)資源進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，擴(kuò)增出的多態(tài)性位點(diǎn)百分比為97.89%，徐彪等[21]利用RAPD分子標(biāo)記研究向日葵自育恢復(fù)系遺傳多樣性，多態(tài)性百分比為73.68%，相比之下，多態(tài)性低于本試驗。

通過遺傳分化分析來預(yù)估物種的遺傳變異在種群內(nèi)部和種群之間的分布程度，可為之后的種質(zhì)資源多樣性保護(hù)和遺傳改良提供參考[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，6個藜蒿種群Gst為41.09%，表明大多數(shù)遺傳變異發(fā)生在種群內(nèi)部，而石麗敏[23]通過形態(tài)學(xué)、同工酶和RAPD鑒定收集到的4份不同的蘆蒿資源，遺傳多樣性結(jié)果顯示蘆蒿種內(nèi)遺傳變異不高。基因流(Nm)為0.717 0(<1)，也表明種群之間基因流動較少，藜蒿6個種群之間的遺傳分化程度較高。

聚類分析是根據(jù)供試材料的多個數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行歸類，包括距離聚類和模型聚類等，是研究種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的重要手段[24]。聚類分析可以直觀的反應(yīng)出物種之間和種群之間的遺傳關(guān)系和遺傳一致度。本研究在RAPD分析基礎(chǔ)上對102份藜蒿資源進(jìn)行UPGMA聚類和基于貝葉斯模型聚類，初步將102份藜蒿資源分為3個大類。由于6個種群的采樣不均，種群結(jié)構(gòu)分析結(jié)果中安徽和江蘇的種群樣本聚類結(jié)果較為分散，并且有11份來源不同的資源遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但總體距離聚類結(jié)果與模型聚類分析結(jié)果較為一致。

本研究對藜蒿材料進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，然而，由于RAPD分子標(biāo)記重復(fù)性和穩(wěn)定性差，具有一定的局限性[25]，并且本次試驗各個種群采樣不均，部分地區(qū)收集的藜蒿樣品材料不夠豐富，僅用1～2個樣本作為種群代表進(jìn)行分析難免會造成數(shù)據(jù)結(jié)果的偏差[26]，不能完全概括藜蒿種群間的遺傳關(guān)系。因此，之后的研究中需要增加不同種群的樣本豐富度和均一度，采用多種分子標(biāo)記技術(shù)，設(shè)計特異性引物，結(jié)合藜蒿的一些表型性狀、生物學(xué)特性，在分子水平上進(jìn)行綜合鑒定親緣關(guān)系，探索不同種群材料的遺傳變異模式、遺傳多樣性和親緣關(guān)系等信息，這樣相比單一的分子標(biāo)記信息更豐富[27]。