黃柏主要成分及其鑒定技術(shù)研究進(jìn)展

喬路蘋, 劉偲, 康良, 孟長來

1. 成都體育學(xué)院 a. 經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院, b. 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與健康研究所，四川 成都 610041,2. 四川省林業(yè)和草原科學(xué)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610081,3. 森林和濕地生態(tài)恢復(fù)與保育四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省林業(yè)科學(xué)研究院，四川 成都 610081

以黃柏為代表的黃檗屬植物具有重要的科學(xué)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因棲身植被喪失和過度利用,相關(guān)野生種群急劇減少，目前已被列為國家二級(jí)保護(hù)樹種[1-2]。在研究與開發(fā)方面，雖然成分含量及GAP標(biāo)準(zhǔn)已建立，但野生資源減少、成材周期較長、市場(chǎng)需求增多等供需矛盾仍然導(dǎo)致市售藥材質(zhì)量參差不齊；加之監(jiān)管力度和手段不完善，使得偽、仿、劣質(zhì)品混雜其中[3]。因此，需在明確既有主要成分及其含量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用簡便、廉驗(yàn)、快速的技術(shù)手段繼續(xù)開展對(duì)市售黃柏及其制品的鑒定與質(zhì)控工作。另一方面，與其它大多數(shù)來源于天然產(chǎn)物的中藥材情況相似[4]，黃柏藥材及其炮制品的成分較為復(fù)雜；僅圍繞一兩種主要成分作為標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)、進(jìn)行含量檢測(cè)，將面臨有效性和特異性不足的問題。因此，借助新興技術(shù)手段、獲取更豐富的成分特征信息，對(duì)黃檗屬植物的鑒定工作也具有科研和應(yīng)用價(jià)值[5]。

1 黃柏資源分布與成分規(guī)定

1.1 資源分布

黃檗屬（Phellodendron）植物是我國重要的經(jīng)濟(jì)、藥用樹種之一，屬于蕓香科闊葉喬木。據(jù)2020版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《藥典》）記載，黃皮樹（P.chinense Schneid.）和黃檗（P.amurense Rupr.）的干燥樹皮，作為常用的中藥材，分別被稱為“黃柏（川黃柏）”和“關(guān)黃柏”[6]。

黃檗屬植物在中國的地理分布具有一定規(guī)律。有研究者通過GMPGIS系統(tǒng)進(jìn)行生態(tài)因子分析發(fā)現(xiàn)，川黃柏集中分布在亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，屬于亞熱帶常綠闊葉林區(qū)，零星分布在熱帶季風(fēng)和暖溫帶；關(guān)黃柏集中分布在溫帶季風(fēng)氣候區(qū)，屬針闊葉混交林、溫帶落葉闊葉林、溫帶草原區(qū)，部分分布在溫帶大陸性氣候區(qū)域。其中，我國川黃柏的生態(tài)適宜面積最大，主要集中在南方省市，如四川、云南、貴州、重慶、湖南、湖北等地，其中四川占據(jù)全國川黃柏總產(chǎn)量的60—70%；關(guān)黃柏生長適宜區(qū)則主要集中在我國北方，如黑龍江、河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西等地，其中黑龍江占據(jù)全國關(guān)黃柏生態(tài)適宜面積的30%[7]。目前，關(guān)于野生黃檗屬植物種群結(jié)構(gòu)及空間分布的研究仍相對(duì)較少。故有學(xué)者提出，應(yīng)重視對(duì)不同地理黃檗種群群落特征的研究及比較分析，加強(qiáng)黃檗天然林遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、種質(zhì)鑒定評(píng)價(jià)等研究，促進(jìn)種質(zhì)資源的保護(hù)利用和良種選育工作[8]。另有研究者認(rèn)為，應(yīng)盡快建立黃檗專門保護(hù)區(qū)，確保遺傳多樣性；加強(qiáng)黃檗繁殖生物學(xué)研究，建立人工繁育基地，擴(kuò)大黃檗種群規(guī)模[1]。

黃檗種群的產(chǎn)地差異直接影響藥材成分。有學(xué)者對(duì)不同產(chǎn)地來源的30份黃柏樣品進(jìn)行了主要成分含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地樣本的生物堿含量差異較大，部分地區(qū)不含或僅含少量藥根堿和巴馬汀，四川產(chǎn)區(qū)黃柏的小檗堿和黃柏堿含量高于其他產(chǎn)區(qū)；而在同一樣品中，木蘭花堿、黃柏堿、藥根堿、巴馬汀、小檗堿含量也差異較大，其中小檗堿含量最高[9]。后繼不同產(chǎn)地研究也確認(rèn)，川黃柏的鹽酸小檗堿含量最高，藥根堿和巴馬汀含量較低，關(guān)黃柏的鹽酸小檗堿含量低于川黃柏[10]。與采收期有關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，花果期雌株黃柏小檗堿含量顯著下降，提示在不同生長發(fā)育期中，碳和能源物質(zhì)的分配變化也影響著黃柏成分含量。有關(guān)采收年限的研究表明，采收年限越晚、小檗堿含量越高[11]。針對(duì)川黃柏不同部位的研究發(fā)現(xiàn)，樹皮的鹽酸小檗堿含量顯著高于幼葉和老葉[12]，推測(cè)這可能是川黃柏以樹皮入藥的重要依據(jù)[13]?？梢?，在不同產(chǎn)地、品種、采收期、年限乃至部位的黃檗屬藥材中，小檗堿的成分含量差別較大[14]，這可能是導(dǎo)致相應(yīng)藥材質(zhì)量和功效存在差異的重要原因。因此，有必要在明確黃檗屬藥材主要成分的基礎(chǔ)上，運(yùn)用有效的技術(shù)手段開展藥材及其制品的鑒定工作。

1.2 成分規(guī)定

2005版《藥典》將“關(guān)黃柏”從“黃柏”中分出、列為兩種藥材以免混淆，并對(duì)二者的主要成分鹽酸小檗堿含量進(jìn)行了明確規(guī)定，川黃柏含量的最低標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)黃柏的五倍[15]。2010版《藥典》則修訂了“關(guān)黃柏”“川黃柏”主要成分及含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，分別將鹽酸巴馬汀、鹽酸黃柏堿納入二者的成分含量規(guī)定中；同時(shí)，炮制方法的不同會(huì)導(dǎo)致成分含量與藥效產(chǎn)生較大差異，故該版《藥典》也將黃柏的相應(yīng)炮制品單列，分別制定了標(biāo)準(zhǔn)[16]。2015、2020版《藥典》則一直沿用了該標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。作為道地藥材來源地，四川滎經(jīng)地區(qū)的川黃柏產(chǎn)量和鹽酸小檗堿含量均明顯高于四川其它地區(qū)，并已建立川黃柏規(guī)范化種植（GAP）基地[17]。因鹽酸小檗堿含量遠(yuǎn)高于關(guān)黃柏，川黃柏的成分鑒定與相關(guān)技術(shù)研究一直是該領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。

表 1 《中國藥典》對(duì)黃柏成分規(guī)定變化一覽表Tab. 1 Component standard changes of Phellodendron herbs regulated by Chinese Pharmacopoeia

2 黃柏成分鑒定方法

2020版《藥典》中，對(duì)多成分進(jìn)行測(cè)定、質(zhì)控的中藥品種已逾百種，中藥鑒定與質(zhì)控工作已逐漸由單一化學(xué)指標(biāo)向多成分整體模式轉(zhuǎn)變。中藥指紋圖譜技術(shù)作為公認(rèn)的藥材質(zhì)控手段之一，是鑒別真?zhèn)?、區(qū)分物種、評(píng)價(jià)優(yōu)劣、確保中藥材一致性和穩(wěn)定性的有效方法[18]，主要技術(shù)手段包括了色譜、電化學(xué)、光譜和DNA、基因組學(xué)等多種測(cè)定方法。近年來，國內(nèi)先后單獨(dú)或聯(lián)合運(yùn)用薄層色譜法（TLC）、高效毛細(xì)管電泳法（HPCE）、DNA條形碼、高效液相色譜法（HPLC）、光譜法等技術(shù)，圍繞川黃柏、關(guān)黃柏的指紋圖譜特征進(jìn)行了相關(guān)研究，取得了系列成果[19-24]。

2.1 薄層色譜技術(shù)（TLC）

有研究者開展了復(fù)方黃柏凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，先通過高效液相色譜法建立了復(fù)方黃柏凝膠指紋圖譜，后采用TLC法對(duì)黃柏及鹽酸小檗堿進(jìn)行定性鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃柏凝膠比復(fù)方黃柏液涂劑質(zhì)量更優(yōu)[25]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TLC法可用于鑒別健脾利濕和胃膏中的黃柏，并認(rèn)為該方法的準(zhǔn)確性、專屬性和重現(xiàn)性均較好[26]。TLC法作為一種快速分離和定性分析少量物質(zhì)的技術(shù)，常用于鑒別藥品、測(cè)定含量或檢查雜質(zhì)，也可用于跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。但是，TLC法僅靠單一成分評(píng)價(jià)模糊了中藥整體特征，且對(duì)點(diǎn)樣過程和展開均有較高的技術(shù)和條件要求，某種程度上影響了該技術(shù)的推廣，其在黃柏領(lǐng)域的應(yīng)用研究也相對(duì)缺乏[27-28]。

2.2 高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE）

有學(xué)者采用HPCE法、以黃連堿為內(nèi)標(biāo)測(cè)定了黃柏干皮和枝皮中鹽酸小檗堿的含量，發(fā)現(xiàn)黃柏不同部位的鹽酸小檗堿含量有明顯區(qū)別，其中干皮為4.06%、枝皮為3.41%[29]。有研究者借助非水毛細(xì)管電泳法，測(cè)定了不同產(chǎn)地川黃柏和關(guān)黃柏飲片中的鹽酸小檗堿、藥根堿、木蘭堿和鹽酸巴馬汀含量[30]；另有學(xué)者采用NACE-DAD指紋圖譜對(duì)不同產(chǎn)地黃柏進(jìn)行了質(zhì)控分析[31]。兩項(xiàng)產(chǎn)地研究均發(fā)現(xiàn)，相關(guān)技術(shù)可對(duì)不同產(chǎn)地黃柏進(jìn)行質(zhì)控，但電泳條件較高、需重復(fù)優(yōu)化，且實(shí)驗(yàn)過程較繁瑣。

HPCE作為一種高效分離分析技術(shù)，具有分離模式多、量微、快速、溶劑消耗少、成本低、易清洗等優(yōu)點(diǎn)，尤適于生產(chǎn)和保存過程中無機(jī)離子和小分子有機(jī)酸的含量測(cè)定；但使用時(shí)需嚴(yán)格控制緩沖液pH值和電泳溫度，對(duì)實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，否則進(jìn)樣時(shí)容易引發(fā)誤差，這在一定程度上影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和重復(fù)性[32-34]。

2.3 DNA條形碼技術(shù)

圍繞黃柏類藥材的DNA條形碼鑒定領(lǐng)域，有研究人員應(yīng)用ITS2序列，鑒定了市售黃柏藥材及其混偽品,發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可準(zhǔn)確有效地將川、關(guān)黃柏與其各自混偽品進(jìn)行區(qū)分；但無法將川、關(guān)黃柏兩種藥材進(jìn)行區(qū)分[35]。另有研究者將ITS、psbA-trnH序列作為候選基因片段，發(fā)現(xiàn)psbA-trnH比ITS具有更好的鑒定效能；psbA-trnH和ITS+psbA-trnH均能將關(guān)黃柏從川黃柏、禿葉黃皮樹中區(qū)分開，但無法區(qū)分川黃柏和禿葉黃皮樹，提示關(guān)黃柏的DNA條形碼特征差異性可能更為明顯；同時(shí)，利用ITS序列的第173位點(diǎn)和psbA-trnH序列的第206位點(diǎn)、第397位點(diǎn)等三個(gè)SNP位點(diǎn)，可以快速準(zhǔn)確地鑒別黃柏類藥材的三個(gè)基源植物。該研究進(jìn)一步指出，黃柏類藥材DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫的建立，至少需滿足在整個(gè)分布區(qū)內(nèi)隨機(jī)采集12個(gè)種群、每個(gè)種群取1—2個(gè)樣本，方可代表關(guān)黃柏的遺傳多樣性水平，從而保證DNA條形碼數(shù)據(jù)庫的應(yīng)用可靠性[36]。另有科研人員分析了不同產(chǎn)地關(guān)黃柏的DNA多態(tài)性，并據(jù)此構(gòu)建了關(guān)黃柏DNA植物圖譜，建立了優(yōu)化的關(guān)黃柏總DNA提取及AFLP分析體系，該體系適用于關(guān)黃柏遺傳多態(tài)性分析、結(jié)果重現(xiàn)性好；該研究還從64對(duì)引物組合中、篩選得到了多態(tài)性高的10對(duì)，針對(duì)其他來源的道地與非道地關(guān)黃柏樣本，可直接開展分析[37]。

上述研究為黃檗屬藥材的產(chǎn)地鑒別、資源保護(hù)工作提供了重要參考依據(jù)。同時(shí)，既有成果報(bào)道多集中于關(guān)黃柏領(lǐng)域，川黃柏的相關(guān)技術(shù)研究仍有待進(jìn)一步探索和發(fā)展。DNA條形碼是基于基因芯片、高通量測(cè)序等現(xiàn)代生物技術(shù)的衍生產(chǎn)物，被視為前景廣闊的新興技術(shù)，目前尚需要配套的技術(shù)條件（如較完備的分子生物實(shí)驗(yàn)平臺(tái)）；另一方面，樣本的快速制備和快速分析是多數(shù)生物技術(shù)的主要瓶頸，這也有望成為DNA條形碼技術(shù)未來著力解決的重要方向[38-40]。

2.4 高效液相色譜技術(shù)（HPLC）

有研究者采用HPLC法分別測(cè)定了關(guān)黃柏和川黃柏中的黃酮含量，以流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定了關(guān)黃柏和川黃柏的抗氧化性，并進(jìn)行了兩種藥材的比較。發(fā)現(xiàn)關(guān)黃柏和川黃柏中的黃酮含量變異系數(shù)相同；川黃柏的回收率、黃酮含量均高于關(guān)黃柏；川黃柏抗氧化性的IC50（抑制率為50%時(shí)的溶液的濃度）則低于關(guān)黃柏，說明川黃柏中黃酮化合物含量和抗氧化性均高于關(guān)黃柏[41]。另有研究人員采用超高效液相色譜法、同時(shí)測(cè)定了川黃柏和關(guān)黃柏中小檗堿、黃柏堿、巴馬汀、木蘭花堿的含量。通過計(jì)算峰面積比值R1（木蘭花堿/黃柏堿）、R2（巴馬汀/小檗堿），認(rèn)為R1＜1、R2＜0.05可視為川黃柏的判定特征；R1＞1、R2＞0.05則為關(guān)黃柏的特征。提出該方法可用于黃柏、關(guān)黃柏的鑒別以及相關(guān)中成藥的定性鑒別[42]。有團(tuán)隊(duì)采用HPLC法，對(duì)川黃柏不同炮制品中的鹽酸小檗堿進(jìn)行了含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)該方法簡單易行、結(jié)果準(zhǔn)確；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，川黃柏經(jīng)清炒后、小檗堿含量可達(dá)10.989 mg，高于其它炮制品，相關(guān)研究有望為川黃柏炮制品的臨床應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和參考[43]。此前，有學(xué)者對(duì)不同購買地的十批黃柏生品、鹽炙品、酒炙品、蜜炙品進(jìn)行了顯微及TLC法鑒別，并結(jié)合HPLC法進(jìn)行了含量測(cè)定。發(fā)現(xiàn)結(jié)果重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，可較好用于黃柏及其不同炮制品的質(zhì)控[44]。有學(xué)者則對(duì)HPLC進(jìn)行了優(yōu)化，旨在更好測(cè)定川黃柏結(jié)晶物中的鹽酸小檗堿含量。結(jié)果表明，優(yōu)化條件后的精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.49%、重復(fù)性為1.23%、穩(wěn)定性為0.29%；平均加樣回收率為97.84%～98.06%，RSD為0.44%～1.00%。認(rèn)為該優(yōu)化方法安全、快速、精確、有效[45]。還有研究人員用HPLC法檢測(cè)了黃柏藥材中非法染色劑的添加情況，在30批樣品中、檢測(cè)出2批含有非法添加劑金胺O，體現(xiàn)了該方法簡便準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，尤適于藥材質(zhì)量監(jiān)測(cè)工作[46]。

HPLC是構(gòu)建中藥指紋圖譜的經(jīng)典技術(shù)手段，在黃柏產(chǎn)地和成分含量研究中取得了大量成果。但其分析時(shí)間長、只能檢測(cè)幾種有限的主要成分。因此，對(duì)于以黃柏為代表的、成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和質(zhì)控，仍需結(jié)合快速、靈敏度高的方法[47-50]。

2.5 光譜法

我國05版《藥典》即對(duì)光譜技術(shù)在藥材質(zhì)量鑒定等方面的應(yīng)用作出了指導(dǎo)。目前，已有研究人員利用近紅外光譜，開展了黃柏主要成分及含量的相關(guān)研究。有學(xué)者以HPLC所測(cè)川黃柏樣品中的小檗堿和黃柏堿含量為參考值、并與樣品的近紅外光譜進(jìn)行關(guān)聯(lián),經(jīng)偏最小二乘法（PLS）建立了川黃柏中小檗堿和黃柏堿的定量分析模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所建立的小檗堿定量分析模型性能指數(shù)PI為95.6；黃柏堿為93.5，說明該方法能同時(shí)無損快速測(cè)定川黃柏中的小檗堿和黃柏堿含量[51]。另有研究者圍繞川黃柏中3個(gè)成分（木蘭花堿、黃柏堿、小檗堿）、以HPLC測(cè)定的黃柏生物堿含量作為參照值，結(jié)合采集到的49批不同產(chǎn)地川黃柏樣品的近紅外漫反射光譜，經(jīng)PLS建立校正模型，比較了不同預(yù)處理方法及不同波段對(duì)建模的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以MSC+2D2為預(yù)處理方法、建立的小檗堿、黃柏堿、木蘭花堿近紅外光譜模型穩(wěn)定準(zhǔn)確可靠，相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.9995、0.9760、0.9306，適用于快速檢測(cè)[52]。有研究者通過獲取不同產(chǎn)地黃柏及其偽品的近紅外漫反射光譜，用模式識(shí)別方法進(jìn)行了聚類分析，建立判別模型后，用三重交叉驗(yàn)證模型穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)同產(chǎn)地、不同批次的樣品聚類效果較好，為光譜技術(shù)鑒別黃柏產(chǎn)地提供了新方法[53]。另有學(xué)者用傅里葉變換紅外光譜儀，獲取6個(gè)產(chǎn)地黃柏的紅外光譜并結(jié)合主成分分析模型，發(fā)現(xiàn)可基本有效區(qū)分不同產(chǎn)地來源的樣本，并在一定程度上能分析樣本的親緣關(guān)系[54]。

作為中藥指紋圖譜技術(shù)中鑒定、評(píng)價(jià)與質(zhì)控的關(guān)鍵手段，光譜技術(shù)具有快速高效、無污染、樣品用量小、靈敏度高等特點(diǎn)。作為經(jīng)典光譜手段之一，近紅外光譜常用于表征含氫原子的官能團(tuán)，如醇、酚、胺和碳?xì)浠衔锏?，適合對(duì)較復(fù)雜的化合物進(jìn)行分析。近紅外光譜技術(shù)已在中藥領(lǐng)域廣泛應(yīng)用并在黃柏研究領(lǐng)域嶄露頭角[5,55-56]，如與其它新興技術(shù)結(jié)合，則有望為黃柏產(chǎn)地鑒定與成分測(cè)定研究提供更多成果。

3 展望

作為臨床常用中藥，黃柏主要含有蛋白質(zhì)、糖類、脂類、生物堿類、黃柏酮、甾醇類等多種物質(zhì)，這些物質(zhì)直接影響著黃柏的質(zhì)量和藥效。在前述成分鑒定技術(shù)中，光譜法在黃柏領(lǐng)域應(yīng)用相對(duì)較少，但其可提供不同波段中藥物質(zhì)分子的轉(zhuǎn)動(dòng)或振動(dòng)信息；且屬于快速低耗、樣本用量少、操作簡便、靈敏度高、有效性好的鑒定技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

具體光譜技術(shù)中，紅外、紫外等方法在中藥領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛。通常情況下，有機(jī)分子內(nèi)化學(xué)鍵的振動(dòng)吸收頻率主要在紅外波段。在紅外光譜中，近紅外區(qū)在研究含氫原子的官能團(tuán)，如醇、酚、胺和碳?xì)浠衔锏葧r(shí)比較重要[57]；中紅外區(qū)是紅外光譜中應(yīng)用最早和最廣的一個(gè)區(qū)，也是鑒定化合物和確定分子結(jié)構(gòu)的常用譜段[58]；遠(yuǎn)紅外區(qū)則有利于觀察重原子之間的伸縮和彎曲振動(dòng)、晶格振動(dòng)、分子間氫鍵振動(dòng)、有機(jī)分子較弱的相互作用等[59]；太赫茲區(qū)則對(duì)于物質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解具有重要意義。故理論上，絕大部分中藥均可能存在特征性的多譜段指紋光譜[60]。

因此，如著眼于黃柏成分研究與市場(chǎng)需求，將實(shí)地采樣與以光譜法為代表的新興鑒定技術(shù)相結(jié)合、豐富和改進(jìn)現(xiàn)有成分鑒定技術(shù)，對(duì)于完善黃柏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、產(chǎn)地保護(hù)和規(guī)范化種植都將具有推動(dòng)作用。