液體活檢在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的臨床研究進(jìn)展

劉思楊 綜述 文飛球 審校

（中國醫(yī)科大學(xué)深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科，廣東深圳 518000）

神經(jīng)母細(xì)胞瘤（neuroblastoma，NB）是兒童最常見的顱外實(shí)體瘤，診斷時約50%為高?；颊?，長期生存率低于40%［1］。NB的診斷、療效的評估和復(fù)發(fā)的監(jiān)測通常是通過腫瘤組織活檢，但連續(xù)性的侵入性檢查不易實(shí)施，而且腫瘤組織取樣過程中可能導(dǎo)致局部轉(zhuǎn)移。由于NB具有高度異質(zhì)性，原發(fā)性腫瘤及其轉(zhuǎn)移性病變的分子特征并不總是一致的。液體活檢在廣義上是指以血液為主的體液標(biāo)本中細(xì)胞及核酸的檢測，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）及外泌體等。與傳統(tǒng)組織活檢相比，液體活檢可以大幅縮短癌癥確診時間，對癌癥患者的治療情況進(jìn)行動態(tài)跟蹤，真正實(shí)現(xiàn)“個性化精準(zhǔn)治療”。本文對液體活檢在NB中應(yīng)用的最新臨床研究進(jìn)展綜述如下。

1 CTC

1.1 CTC的概述

CTC是一種腫瘤轉(zhuǎn)移的中間產(chǎn)物，與骨髓（bone marrow，BM）中的播散性腫瘤細(xì)胞一起，作為微小殘留病（minimal residual disease，MRD）的標(biāo)志物。MRD指的是緩解期患者在治療后仍有少量腫瘤細(xì)胞存在，是NB患者復(fù)發(fā)的主要原因［2］。CTC是目前研究最廣泛的液體活檢標(biāo)記物，已被廣泛用于提供關(guān)于原發(fā)性腫瘤或轉(zhuǎn)移瘤特征的信息，跟蹤腫瘤的動態(tài)變化和異質(zhì)性，并用于檢測治療耐藥性和監(jiān)測復(fù)發(fā)［3］。CTC在外周血（peripheral blood，PB）中的數(shù)量極低，約占PB細(xì)胞的百萬分之一。因此，對CTC的有效富集與檢測是對CTC研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。目前，多種CTC的分離富集方法主要依據(jù)CTC的物理特征（大小、密度、電荷等）與免疫學(xué)特性。后者采用免疫親和分離技術(shù)，包括以下兩種方法：一是通過腫瘤特異性標(biāo)記物來陽性選擇CTCs；二是陰性選擇，這種方法是通過去除正常血液成分（包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板），最終富集CTC。微過濾技術(shù)的發(fā)展使得通過直徑大小捕獲CTC的靈敏度提高，包括微孔或微流體，還可以專門用于捕獲CTC團(tuán)［4］。除此之外，還有根據(jù)腫瘤細(xì)胞和血細(xì)胞的電荷不同來分離出CTC的介質(zhì)電泳。富集后的細(xì)胞需要進(jìn)行CTC的識別，主要包括免疫細(xì)胞化學(xué)法、熒光原位雜交、流式細(xì)胞術(shù)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）及酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)等。

1.2 CTC在NB的應(yīng)用情況

Merugu等［5］應(yīng)用成像流式細(xì)胞技術(shù)，以GD2+/CD45-作為標(biāo)記物，對41例NB患者的血漿及BM樣本分別進(jìn)行CTC及播散性腫瘤細(xì)胞檢測，其中24例有BM浸潤的患者中19例在血漿中檢測到CTC，沒有BM浸潤的17例患者中6例檢測到CTC，因此CTC的存在或CTC的數(shù)量與BM受累相關(guān)。重要的是，對19例有BM浸潤的新診斷高危NB患者進(jìn)行一線誘導(dǎo)治療后，未達(dá)到BM完全緩解（complete response，CR）的患者與達(dá)到BM CR的患者相比在診斷時血漿中具有更高數(shù)量的CTC，因此CTC計(jì)數(shù)可能有助于評估療效，以及決定高危NB患者誘導(dǎo)化療的時間長度，從而指導(dǎo)治療。同時該研究首次證明了用成像流式細(xì)胞技術(shù)檢測NB患者CTC可以作為早期臨床試驗(yàn)中新療法的非侵入性藥效學(xué)方面的生物標(biāo)志物。

Batth等［6］對93例緩解期NB患者進(jìn)行前瞻性研究，選用細(xì)胞表面波形蛋白（cell surface vimentin，CSV）作為PB CTC的篩選標(biāo)記，在基線（即開始治療前）和開始治療后3～4個月的PB樣本中均無CSV+CTC的20例患者中，只有1例復(fù)發(fā)，其余19例無復(fù)發(fā)，證明了CSV+CTC可以作為判斷早期復(fù)發(fā)（2個月至2年）的重要指標(biāo)，并且PB無基線CSV+CTC聯(lián)合BM無MYCN擴(kuò)增對無復(fù)發(fā)生存期進(jìn)行預(yù)測的敏感性達(dá)到100%。

也有一項(xiàng)隨機(jī)Ⅲ期試驗(yàn)中，對CTCs進(jìn)行免疫清除后，高危NB患兒的存活率并未提高［7］。目前NB患者CTC檢測所用的標(biāo)記物及檢測技術(shù)尚未統(tǒng)一，正在積極探索更為靈敏及準(zhǔn)確的檢測方法。

2 NB相關(guān)mRNA

2.1 檢測方法

早期在液體活檢中對NB進(jìn)行基因組鑒定主要依賴于RT-PCR，該方法識別可能由CTC脫落的mRNA。實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）的應(yīng)用，使NB相關(guān)mRNA得以量化，可確定NB細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的臨界值。早期研究大多通過單一標(biāo)志物對NB相關(guān)mRNA進(jìn)行識別，如酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和paired-like homeobox 2B（PHOX2B）。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)同時對多個NB相關(guān)mRNA進(jìn)行RT-qPCR克服了NB的異質(zhì)性，從而實(shí)現(xiàn)更敏感的MRD檢測。除此之外，與RT-qPCR相比，微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是測定特異性核酸豐度更為靈敏的方法，可以提供更準(zhǔn)確、更具有可重復(fù)性的低水平mRNA檢測。

2.2 臨床應(yīng)用

在診斷方面，高危和晚期轉(zhuǎn)移的患者通常PB中具有更高的TH mRNA水平［8］。除了可以作為一種診斷性生物標(biāo)志物，還有大量研究提出了NB特異性mRNA的預(yù)后價值。Viprey等［8］應(yīng)用RT-qPCR對290例4期NB患兒在診斷時或誘導(dǎo)治療后BM和PB樣本中雙皮質(zhì)素（doublecortin，DCX）、PHOX2B或TH mRNA進(jìn)行檢測，證實(shí)了診斷時PB高水平DCX、PHOX2B或TH mRNA與4期NB患兒的不良預(yù)后相關(guān)。Marachelian等［9］應(yīng)用RT-qPCR對101例NB患者的BM和PB樣本中ACHGA、DCX、DDC、PHOX2B和TH的mRNA進(jìn)行定量檢測，證明了此組標(biāo)志物在BM和PB中的表達(dá)與復(fù)發(fā)/難治性NB的無進(jìn)展生存期相關(guān)。最新的一項(xiàng)研究結(jié)果表明，通過ddPCR測定7種NB相關(guān)mRNA（CRMP1、DBH、DDC、GAP43、ISL1、PHOX2B和TH）與高危NB患者腫瘤復(fù)發(fā)/再生長顯著相關(guān)，并且證實(shí)了在低水平NB相關(guān)mRNA的檢測方面，ddPCR優(yōu)于RT-qPCR［10］。

3 ctDNA和cfDNA

血漿中的cfDNA是高度碎片化的DNA，主要來自凋亡細(xì)胞，以游離雙鏈DNA片段或核小體的形式存在。腫瘤細(xì)胞（包括CTC、原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性病變的腫瘤細(xì)胞）凋亡或壞死時釋放到血流中的cfDNA被稱為ctDNA。ctDNA可以替代腫瘤活檢標(biāo)本的原因在于具有高特異性和敏感性的準(zhǔn)確檢測方法，用極少量cfDNA分析單核苷酸變異（singlenucleotide variants，SNVs）和拷貝數(shù)改變成為可能。目前主要有兩種方法來檢測癌癥患者血漿樣本中的ctDNA［11］。第一種方法主要應(yīng)用靶向DNA測序技術(shù)，如數(shù)字PCR、磁珠乳液擴(kuò)增技術(shù)、安全測序系統(tǒng)、深度測序腫瘤個體化建檔法和標(biāo)記擴(kuò)增子深度測序。其優(yōu)勢在于成本低、耗時短和敏感性高，并且可以評估多重突變，但需要已知突變信息。第二種方法是應(yīng)用非靶向二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)，如全基因組測序或全外顯子測序。

3.1 協(xié)助NB的臨床診斷

PB中cfDNA水平與腫瘤負(fù)荷具有相關(guān)性，與健康個體相比，NB患者血漿中cfDNA明顯增加［12］。Wang等［13］應(yīng)用RT-qPCR的方法對79例初診及79例穩(wěn)定期的NB患者血漿cfDNA水平分別進(jìn)行檢測，初診患者血漿總cfDNA濃度中位數(shù)是穩(wěn)定期NB患者的18.6倍，4期患者cfDNA是早期患者的6倍，證實(shí)了cfDNA的絕對濃度可以作為NB診斷的生物標(biāo)志物，并且有助于臨床分期。血漿cfDNA總量提供的診斷信息有限，應(yīng)用NGS技術(shù)，配對的腫瘤/正常DNA測序信息可以通過Sequenza軟件進(jìn)行分析，Sequenza軟件是一種用于評估cfDNA或原發(fā)腫瘤中腫瘤細(xì)胞數(shù)量的軟件包［14］。將ctDNA片段中的腫瘤特異性生物標(biāo)志物的評估與cfDNA或ctDNA的絕對水平相結(jié)合，可以為臨床診斷提供更多幫助。

3.2 協(xié)助危險(xiǎn)分層與指導(dǎo)治療

Van Roy等［12］應(yīng)用低深度全基因組測序?qū)?7例NB患者PB的ctDNA進(jìn)行染色體拷貝數(shù)分析，其結(jié)果與來自原發(fā)腫瘤組織活檢的微陣列比較基因組雜交結(jié)果高度一致。并且該研究還證實(shí)了在3、4期轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中可以檢測到更高數(shù)量cfDNA，更易獲得cfDNA的拷貝數(shù)譜，這在Chicard等［15］的研究中也得到證實(shí)。Cimmino等［16］應(yīng)用識別靶向基因組合的NGS方法，對11例原發(fā)性NB患者（其中9例為4期，2例為2期）PB中ctDNA的特異性突變進(jìn)行識別，其中有9例（81.8%）攜帶至少1種致病性突變，同時識別出在診斷時未在組織活檢中發(fā)現(xiàn)的ALK F1174L熱點(diǎn)突變，證實(shí)了該方法在識別特異性突變方面的潛力，可以為靶向治療提供依據(jù)，從而促進(jìn)個性化治療，同時為診斷提供重要依據(jù)。

Iehara等［17］應(yīng)用ddPCR，以NAGK作為參考基因，MYCN和NAGK比值（M/N）作為評價指標(biāo)，評估43例初次診斷的NB患者血清及腫瘤ctDNA的MYCN基因擴(kuò)增狀態(tài)，其靈敏度及特異度均為100%。因此，對于難以獲得腫瘤組織標(biāo)本的患者，可以通過ctDNA檢測評估MYCN基因擴(kuò)增狀態(tài)，對其危險(xiǎn)分層的預(yù)測具有重要臨床價值。最新的研究應(yīng)用四重ddPCR方法對ctDNA中的拷貝數(shù)變化和熱點(diǎn)突變進(jìn)行評估，該方法具有更高的靈敏度并且成本更低［18］。除了MYCN，其他染色體改變也被認(rèn)為具有預(yù)測不良預(yù)后的價值，包括1p缺失（30%）、11q缺失（45%）和17q不平衡增益（60%）［19］，這些染色體畸變也可應(yīng)用ctDNA進(jìn)行識別。

3.3 評估治療反應(yīng)

ctDNA半衰期短，并且可以檢測到比原發(fā)腫瘤更多的SNVs，因此克服了NB顯著的時間及空間異質(zhì)性，作為疾病監(jiān)測的動態(tài)生物標(biāo)志物實(shí)時評估治療反應(yīng)，以及進(jìn)行前瞻性的克隆評估。Chicard等［14］用全外顯子測序及靶向測序技術(shù)對19例NB患者在診斷、治療前或復(fù)發(fā)時進(jìn)行PB的cfDNA檢測，發(fā)現(xiàn)在CR或部分緩解患者中cfDNA/ctDNA比值明顯低于進(jìn)展期患者，比值分別為33%和67%。說明cfDNA/ctDNA可用于評估治療反應(yīng)。同時該研究報(bào)道，在復(fù)發(fā)時發(fā)現(xiàn)cfDNA中的17個SNVs在初診時并未發(fā)現(xiàn)，而利用覆蓋率更高的靶向測序技術(shù)對原發(fā)腫瘤進(jìn)行檢測后可以發(fā)現(xiàn)這些基因，因此認(rèn)為這17個突變與不良預(yù)后相關(guān)［14］。因此通過對PB的cfDNA進(jìn)行靶向測序可以早期識別具有復(fù)發(fā)特異性的基因，將有助于監(jiān)測疾病進(jìn)展和發(fā)展靶向治療策略。

Kahana-Edwin等［20］應(yīng)用ddPCR對3名僅應(yīng)用ALK抑制劑治療的患者在治療前及治療6～8周后檢測PB的cfDNA，疾病進(jìn)展的患者ALK突變增加5倍，對治療有反應(yīng)的患者ALK突變均減少，結(jié)果表明PB cfDNA中ALK突變可以反映患者對治療的反應(yīng)，為實(shí)時監(jiān)測靶向治療的療效提供了生物標(biāo)志物。

3.4 表觀遺傳學(xué)分析

有研究認(rèn)為，NB的發(fā)生發(fā)展在很大程度上由表觀遺傳修飾驅(qū)動，因此，有研究通過應(yīng)用深度測序技術(shù)對NB的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析來評估治療反應(yīng)。Applebaum等［21］應(yīng)用Nano-hmC-Seal測序技術(shù)對34名健康兒童和32名NB患者（27名高風(fēng)險(xiǎn)、2名中風(fēng)險(xiǎn)、3名低風(fēng)險(xiǎn)）在其疾病過程中的不同時間點(diǎn)（診斷、治療期間和隨訪）的5-羥甲基胞嘧啶譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明NB患兒的cfDNA中5-羥甲基胞嘧啶增加與轉(zhuǎn)移相關(guān)，可以作為治療反應(yīng)和預(yù)后的預(yù)測指標(biāo)，由21例患者組成的驗(yàn)證隊(duì)列也證實(shí)此結(jié)論。van Zogchel等［22］應(yīng)用ddPCR對47例高危NB患者在治療和隨訪期間血漿樣本的cfDNA中高度甲基化RASSF1A基因進(jìn)行檢測，復(fù)發(fā)患者在診斷時的高度甲基化RASSF1A絕對水平和相對水平均顯著升高，在兩個化療周期后PB高度甲基化RASSF1A與BM mRNA均陽性與不良結(jié)局相關(guān)，結(jié)果表明高度甲基化RASSF1A可以作為檢測NB的ctDNA標(biāo)記物，并且與BM mRNA聯(lián)合分析可用于監(jiān)測治療反應(yīng)和早期復(fù)發(fā)，該結(jié)論也通過RT-qPCR檢測方法得到證實(shí)［23］。

在不同腫瘤的不同階段，ctDNA的侵襲性和代謝程度不同，目前沒有固定的標(biāo)準(zhǔn)來評估ctDNA水平，無法保證可靠性及可重復(fù)性，因此NB血漿ctDNA的水平和動態(tài)變化的檢測方法仍需要進(jìn)一步提高。

4 外泌體

循環(huán)外泌體，即參與細(xì)胞通信的小泡，直徑約40～160 nm，起源于細(xì)胞多泡體內(nèi)的腔內(nèi)囊泡［24］。在循環(huán)中穩(wěn)定且其內(nèi)容物不被降解，是細(xì)胞通信的動態(tài)中介。外泌體的成分包括蛋白質(zhì)、DNA、信使RNA、microRNA（miRNA）、其他非編碼RNA和反映細(xì)胞或組織起源的脂質(zhì)等。外泌體在維持細(xì)胞正確的生理狀態(tài)方面發(fā)揮重要作用，并且在病理?xiàng)l件下促進(jìn)腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［25］。許多類型細(xì)胞都可以釋放外泌體，包括腫瘤細(xì)胞。在病理?xiàng)l件下會有更多的外泌體分泌。外泌體及其成分可以反映親代腫瘤細(xì)胞的特征，并且參與腫瘤的生長與侵襲，是一種有價值的循環(huán)生物標(biāo)記物來源［26］。

4.1 外泌體來源的miRNA——預(yù)測化療反應(yīng)

miRNA已被廣泛描述為不同病理狀態(tài)的生物標(biāo)志物。有研究表明，高危NB患者血清樣本中特異性miRNA水平與疾病負(fù)荷和治療反應(yīng)相關(guān)［27］。一項(xiàng)研究顯示在誘導(dǎo)化療前后收集52例高危NB患者的血液樣本，以CD9作為血漿中總外泌體的標(biāo)記，以GD2作為NB來源外泌體的標(biāo)記，結(jié)果顯示PB中GD2+的外泌體占總外泌體的比例由治療前的50%下降到27%，這說明高危NB患者的NB細(xì)胞來源外泌體在誘導(dǎo)化療后減少［28］。通過RT-qPCR測量每個PB樣本中381個基因的表達(dá)，對比發(fā)現(xiàn)在治療前外泌體來源的miRNA（exosomal mircoRNA，exo-miRNA）的數(shù)量高于治療結(jié)束后，其中62個exo-miRNAs在治療后顯著下調(diào)，表明誘導(dǎo)化療對exo-miRNAs的表達(dá)有顯著的抑制作用。同時該研究比較了微小反應(yīng)（minor response，MR）患者（n=6）和較好部分反應(yīng)（very good partial response，VGPR）患者（n=8）的exo-miRNAs表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)3種exo-miRNAs（miR-29c、miR-342-3p和let-7b）在MR患者治療后顯著下調(diào)，而在VGPR患者中幾乎保持不變，說明這3種exo-miRNAs可以有效區(qū)分MR和VGPR患者。除此之外，該研究還提出了化療耐藥指數(shù)（即患者體內(nèi)參與調(diào)節(jié)的exo-miRNAs的數(shù)量除以與特定化療藥物應(yīng)答相關(guān)的exo-miRNAs的總數(shù)）與無事件生存具有顯著的相關(guān)性，因此exo-miRNAs可以作為預(yù)測NB化療反應(yīng)的循環(huán)生物標(biāo)志物［28］。

4.2 外泌體的蛋白質(zhì)組學(xué)分析——預(yù)測PB轉(zhuǎn)移

Colletti等［29］對來自原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的NB細(xì)胞系的外泌體進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析，鑒定出15種蛋白只存在于原發(fā)性腫瘤的外泌體中，這些蛋白均參與神經(jīng)元發(fā)育。相反，僅存在于BM轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的外泌體中的蛋白參與了細(xì)胞存活、增殖和癌癥進(jìn)展。這提示外泌體可能是檢測NB的PB轉(zhuǎn)移疾病有前景的生物標(biāo)志物。

4.3 外泌體來源的雙鏈DNA——分析腫瘤體細(xì)胞突變

DegliEsposti等［30］通過全外顯子測序證明了從NB患者血漿樣本中提取的外泌體來源的DNA（exosomal DNA，exo-DNA）代表了原發(fā)腫瘤DNA。exo-DNA中檢測到的NB癌基因和抑癌基因突變，在原發(fā)腫瘤中也檢測到；在發(fā)病時腫瘤DNA中不存在的體細(xì)胞突變被發(fā)現(xiàn)存在于exo-DNA中，特別是ALK、ATRX、NF1和TERT基因的變異，這表明exo-DNA可用于分析NB的空間異質(zhì)性。exo-DNA也可以用于早期識別獲得性耐藥，如復(fù)發(fā)患者中的ALK、TP53和RAS/MAPK基因突變。exo-DNA是NB分子診斷和預(yù)后評估的1個有潛力的循環(huán)生物標(biāo)志物。為制訂個性化化療方案提供依據(jù)，并可用于開發(fā)靶向治療方法。

目前大多數(shù)NB外泌體相關(guān)研究在細(xì)胞系中進(jìn)行，在患者中進(jìn)行的研究相對較少。除此之外，在分離富集技術(shù)方面，超速離心法仍然是提取exo-DNA的最佳方法，這種方法是非常復(fù)雜的，無法實(shí)現(xiàn)高通量，目前難以轉(zhuǎn)化為常規(guī)臨床診斷［31］。

5 結(jié)語

液體活檢已成為NB診斷研究的新熱點(diǎn)。CTC反映腫瘤負(fù)荷，可以作為CTC診斷及預(yù)后評估的重要工具。ctDNA可追溯NB細(xì)胞的異質(zhì)性，更全面地評估NB的遺傳信息以進(jìn)行更精準(zhǔn)的危險(xiǎn)分層與預(yù)后的評估。外泌體在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用并與化療耐藥的發(fā)生有關(guān)，可以更直觀地評估NB患者對化療的反應(yīng)，exo-miRNA的檢測結(jié)果也為優(yōu)化靶向治療方案提供參考。因此，這些新型液體活檢生物標(biāo)志物在NB診斷、治療及預(yù)后評估等方面均有臨床應(yīng)用潛力。但目前各種液體活檢技術(shù)尚不完善，在臨床應(yīng)用液體活檢前必須建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程并進(jìn)行大規(guī)模前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證［32］。