康藝齡 綜述 趙少貞 審校

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能和疾病重點實驗室，天津 300384

外泌體是細胞分泌的膜性囊泡，膜上的突起是膜蛋白，與靶向結(jié)合有關(guān)，內(nèi)容物主要是脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸[1]。探索不同細胞來源的外泌體功能和特點對不同疾病的診斷和治療有研究價值。目前，對不同細胞分泌的外泌體作用于眼表疾病的認識還不全面，本文就不同細胞分泌外泌體的特點及其作用于眼表疾病的研究進行綜述。

1 外泌體的生物學(xué)特點

細胞分泌體不僅含有可溶性蛋白，還含有胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)，如外泌體。細胞膜內(nèi)陷形成胞內(nèi)小泡，隨后發(fā)育成早期內(nèi)吞小體、晚期內(nèi)吞小體，向內(nèi)出芽形成多囊泡體，多囊泡體的腔內(nèi)小泡被分選以供貨物降解，或以外泌體的形式分泌到細胞外環(huán)境中[2]。由于沒有完美的方法僅能分離外泌體，因此，在本綜述中提到的術(shù)語EVs用于描述富含外泌體的囊泡。

2 不同細胞來源外泌體的特點與眼表疾病

幾乎機體所有細胞均可產(chǎn)生外泌體，種類不同的細胞或處于不同狀態(tài)下的細胞所釋放的外泌體不同。與眼表疾病相關(guān)的常見外泌體的細胞來源有間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)、未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cell，imDC)、髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)等。

2.1 MSC及其外泌體

眼表疾病的研究中，MSC來源的外泌體(mesenchymal stem cell derived exosome，MSC-exo)研究較多，特別是從骨髓、脂肪、臍帶、角膜中分離出的MSC。MSC是起源于中胚層，具有多向分化、自我復(fù)制和抗炎、免疫調(diào)控等特點的多能干細胞，易于從多種易獲得的組織中分離，可大規(guī)模體外培養(yǎng)，免疫原性低。MSC的性能因不同組織來源而異。骨髓來源的MSC(bone marrow derived MSC，BM-MSC)數(shù)量及其分化潛能隨著年齡的增長而急劇下降，分離過程具有侵入性且受試者感受痛苦[3]。從獲取難易程度來看，脂肪來源的MSC(adipose-derived stem cell，ADSC)比BM-MSC更有優(yōu)勢，因為皮下脂肪組織來源廣泛，可方便、重復(fù)獲取，分離過程簡單且為微創(chuàng)[4]。與BM-MSC和ADSC相比，人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC)具有培養(yǎng)時間更長、增生能力強、延遲衰老以及抗炎作用更強的特點[5]，其含量較高，增生和免疫調(diào)節(jié)能力強，且取材方便，無倫理、配型、排斥反應(yīng)等問題。近年發(fā)現(xiàn)角膜也可分離出MSC。角膜中央分離的角膜基質(zhì)來源的MSC(corneal stroma-derived mesenchymal stem-like cell，CSMSC)可表達MSC相關(guān)的表面標志物。CSMSC在體外可以分化為脂肪、骨和軟骨，其基因表達譜更接近BM-MSC，而不是角膜緣上皮干細胞[6]。角膜緣基質(zhì)的角膜基質(zhì)干細胞(corneal stromal stem cell，CSSC)也表現(xiàn)出與MSC相似的特性，保持MSC標記陽性染色[7-8]。角膜上皮、角膜成纖維細胞也可分泌外泌體作用于眼表。大量的實驗和臨床研究表明，大部分MSC介導(dǎo)的有益效應(yīng)歸因于MSC-exo作用，MSC-exo的治療潛力依賴于生物活性分子，包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和微小RNA(microRNA，miRNA)。MSC-exo能有效抑制炎性M1巨噬細胞的效應(yīng)功能，減輕DC的抗原提呈特性，抑制炎性CD4+Th1和Th17淋巴細胞的產(chǎn)生，誘導(dǎo)Treg、耐受性DC和交替激活的巨噬細胞擴增，有助于減輕持續(xù)的炎癥反應(yīng)[9]，并促進組織修復(fù)和再生。

2.1.1角膜損傷 當角膜受到熱力、化學(xué)傷害、外傷等刺激時，角膜緣上皮干細胞分化為上皮細胞，并向角膜中央遷移恢復(fù)角膜透明性。角膜基質(zhì)由細胞外基質(zhì)和膠原組成，基質(zhì)細胞位于細胞外基質(zhì)中，膠原纖維的規(guī)則排列對維持角膜透明性有重要作用。殘存的角膜基質(zhì)細胞分化為角膜成纖維細胞或肌成纖維細胞，膠原纖維排列失去規(guī)則性，導(dǎo)致角膜瘢痕。

MSC促進組織修復(fù)的作用來源于產(chǎn)生外泌體的旁分泌途徑而非直接轉(zhuǎn)分化逐漸被認識到。不同來源的MSC-exo可促進角膜損傷修復(fù)。人角膜緣基質(zhì)來源的MSC外泌體促進角膜上皮傷口愈合，與角膜中傷口愈合相關(guān)信號分子p-Akt的上調(diào)有關(guān)[10-11]。外泌體來源細胞所處的不同病理生理狀態(tài)影響著其分泌外泌體的內(nèi)容物和生物功能。糖尿病和正常人角膜緣基質(zhì)細胞的外泌體(DM-exo和N-exo)中小RNA差異表達，經(jīng)N-exo處理后的角膜上皮傷口愈合和增生率顯著增加，而DM-exo處理后無明顯變化[11]，說明外泌體中小RNA的差異可能與疾病狀態(tài)有關(guān)。ADSC-exo調(diào)節(jié)角膜中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)和膠原蛋白以恢復(fù)角膜基質(zhì)并重塑細胞外基質(zhì)[12]。ADSC-exo分泌的miR-19a抑制HIPK2表達，而HIPK2的下調(diào)抑制了轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad3和p53通路，導(dǎo)致纖維化前標志物和細胞外基質(zhì)成分的表達降低，從而抑制角膜基質(zhì)細胞分化為成肌纖維細胞[13]。越來越多的研究一致認為，MSC促進角膜損傷修復(fù)不是通過直接分化為角膜上皮細胞，而是通過減少新生血管和炎癥反應(yīng)，培育了一個微環(huán)境，從而上調(diào)常駐干細胞的增生和分化[14]。CSSC來源的EVs可與角膜細胞融合，將miRNA轉(zhuǎn)移到角膜細胞內(nèi)，降低纖維化基因Col3a1和Acta2的表達，阻斷中性粒細胞浸潤，從而減輕小鼠角膜損傷后瘢痕[15]，這些結(jié)果提示EVs遞送的miRNA在CSSC的再生功能中發(fā)揮作用。

角膜透明性有賴于無血管結(jié)構(gòu)，在角膜損傷修復(fù)過程中往往伴隨著新生血管的生成。MSC有促血管生成和抗血管生成作用，取決于微環(huán)境變化。MSC及其條件培養(yǎng)液通過上調(diào)基質(zhì)細胞蛋白凝血酶敏感蛋白-1，減輕損傷角膜的炎癥和新生血管[16]。MSC在缺血組織中可促血管生成，通過促進血管內(nèi)皮細胞增生、遷移，促進血管形成，改善氧供[17]。缺氧條件下激活低氧誘導(dǎo)因子-1α可增強MSC活性和遷移能力，低氧誘導(dǎo)因子-1α過表達的MSC-exo增加了血管生成和血管通透性[17]。角膜成纖維細胞分泌的外泌體可以將包括MMP14在內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運到血管內(nèi)皮細胞[18]，MMP14降解VEGFR1以促進VEGFR2與VEGFA結(jié)合從而促進更多的VEGFR2激活和血管生成[19]。所以抑制MMP14和調(diào)節(jié)含有MMP14的外泌體可能是抑制角膜新生血管的潛在機制。小鼠角膜上皮細胞分泌的外泌體在體外能與角膜基質(zhì)細胞融合，誘導(dǎo)肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，還可誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞增生[20-21]，這表明上皮細胞來源的外泌體在角膜上皮細胞與角膜基質(zhì)細胞、血管內(nèi)皮細胞之間起著中介作用，亦可能參與新生血管形成和角膜損傷修復(fù)過程[21]。

2.1.2角膜移植排斥反應(yīng) 角膜雖有免疫赦免特性，但移植術(shù)后排斥反應(yīng)仍可能導(dǎo)致手術(shù)不成功。CD4+T細胞、細胞因子、CD8+T細胞和效應(yīng)B細胞參與角膜移植排斥反應(yīng)。細胞療法(MSC、Treg、imDC、MDSC)對角膜移植排斥有治療作用[22]。給動物注射EVs，包括來自同種異體MSC、imDC或Treg的外泌體，可延長同種異體移植物的存活時間。BM-MSC通過減少CD4+T細胞和CD68+巨噬細胞，增強Treg表達，促進同種異體角膜移植的存活[23]。BM-MSC誘導(dǎo)的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4、蛋白酪氨酸磷酸酶C型受體、C-X-C基序趨化因子配體9基因上調(diào)和熱休克蛋白家族A成員8基因的下調(diào)可能有助于BM-MSC的保護作用，并保留潛在的介入角膜移植排斥反應(yīng)的靶點，BM-MSC可能通過調(diào)節(jié)上述抗原靶點來抑制T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[23]。聯(lián)合應(yīng)用促炎因子TNF-α和白介素(interleukin，IL)-1β可進一步增強BM-MSC的免疫調(diào)節(jié)能力，促進角膜移植物存活[24]。角膜移植排斥模型大鼠結(jié)膜下注射BM-MSC來源外泌體，可通過調(diào)節(jié)細胞因子，如上調(diào)IL-10/干擾素γ水平，降低IL-17水平，調(diào)控Th細胞分化，抑制T細胞增生和CD4+T細胞的表達以及上調(diào)Treg，延長角膜植片存活時間[25-27]。該研究還通過標記外泌體，觀察到結(jié)膜下注射BM-MSC來源外泌體可到達角膜和前房，說明外泌體可跨越生物屏障發(fā)揮作用[27]。

2.1.3黏多糖貯積癥 黏多糖貯積癥Ⅶ(mucopolysaccharidosis Ⅶ，MPS Ⅶ)是一種代謝貯積病，歸因于編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的GUSB基因突變。這種溶酶體酶的缺乏會損害人體分解糖胺聚糖的能力。角膜混濁在MPS Ⅶ中很常見。hUC-MSC來源外泌體能與角膜細胞內(nèi)的溶酶體融合，從而遞送活性β-葡糖醛酸糖苷酶并隨后分解累積的糖胺聚糖[28]，這提示外泌體對MPS Ⅶ所致角膜混濁有治療潛力。

2.1.4干眼 干眼是以淚膜穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征并伴有眼部不適癥狀的多因素眼表疾病，眼表炎癥與損傷是其病理機制之一[29]。與免疫相關(guān)的干眼發(fā)病機制為自身淚腺組織的免疫炎癥反應(yīng)，MSC及其外泌體具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎和組織修復(fù)能力，故用于干眼的治療有廣闊前景。hUC-MSC來源外泌體升高抗炎因子TGF-β、IL-10等的表達，抑制炎性因子TNF-α、IL-1β的表達，促進巨噬細胞表型轉(zhuǎn)化，減輕干眼角膜上皮的損傷，對干眼有治療作用[30-31]。淚腺來源MSC的分泌體包含Lcn2、prosaposin、Rac1和STAT1等蛋白，這些蛋白對淚腺上皮細胞存活產(chǎn)生積極影響，并可能誘導(dǎo)淚腺再生[32]。在苯扎氯銨誘導(dǎo)的小鼠干眼模型中，ADSC-exo上調(diào)抗炎因子IL-10水平，逆轉(zhuǎn)激活的NLRP3炎性小體和上調(diào)的caspase-1、IL-1β、IL-18水平，從而減輕眼表炎癥[33]。

2.1.5干燥綜合征 干燥綜合征(Sj?gren syndrome，SS)是一種表現(xiàn)為眼干和口干的自身免疫性疾病，以唾液腺和淚腺的淋巴細胞浸潤和多種自身抗體存在為特征。SS患者體外培養(yǎng)的唾液腺上皮細胞釋放的外泌體中存在自身抗原Ro/SS-A、La/SS-B以及Sm-RNPs，表明細胞內(nèi)自身抗原可以通過外泌體進行轉(zhuǎn)運[34]。由于EB病毒主要感染B細胞，EBV-miRBART13-3p通過外泌體從B細胞轉(zhuǎn)移到唾液腺上皮細胞，這種功能性miRNA針對水通道蛋白5和基質(zhì)相互作用分子1影響唾液分泌[35]。

2.1.6眼部移植物抗宿主病 移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是異基因造血干細胞移植后發(fā)生的一種疾病，眼部GVHD主要累及眼表。MSC通過減少CD3+T細胞、Pax6的表達，有效減輕眼部GVHD的角膜炎癥和鱗狀化生[36]。BM-MSC來源外泌體通過抑制Th17細胞并誘導(dǎo)Treg，保存外周幼稚T細胞來提高GVHD小鼠的存活率并減輕其病理損傷[37-38]。

2.2 Treg及其外泌體

Treg是T細胞的一類亞群，根據(jù)其發(fā)育來源，可分為直接從胸腺中分化而來的自然Treg和在外周活化過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性Treg。Treg可誘導(dǎo)免疫耐受，直接通過細胞間接觸或間接通過分泌毒性分子和IL-10、TGF-β等免疫抑制性細胞因子發(fā)揮免疫抑制作用。高表達Foxp3的Treg具有更強的免疫抑制作用。但機體中Treg數(shù)量少，難獲得，穩(wěn)定性、效能、純度等問題待明確。Treg分泌的外泌體中含有多種成分，如膜表面蛋白質(zhì)分子、RNA和細胞因子等，可與靶細胞高效作用，抑制T細胞增生，發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[39]。

通過直接注射Treg或刺激體內(nèi)Treg分泌增生可增加體內(nèi)總Treg數(shù)量從而提高角膜移植成功率[40]。Treg可通過釋放的高濃度EVs抑制CD8+細胞毒性T淋巴細胞以誘導(dǎo)移植物免疫耐受[41]。Treg分泌外泌體內(nèi)的miRNA(miR-503、miR-330和miR-9)和誘導(dǎo)型NO合成酶通過干擾細胞周期進程，誘導(dǎo)凋亡和其他T細胞分化為Treg表型，抑制T細胞的同種異體排斥反應(yīng)[42]。Treg分泌的外泌體對角膜植片亦可能誘導(dǎo)免疫耐受，但尚未見報道。

2.3 imDC及其外泌體

DC是專職抗原提呈細胞，其成熟過程中可分泌外泌體。DC不同的成熟狀態(tài)有不同的免疫功能。imDC表達低水平的共刺激分子和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類(major histocompatibility complex class Ⅱ，MHC-Ⅱ)，發(fā)揮免疫抑制作用，而成熟DC表達高水平共刺激分子和MHC-Ⅱ，發(fā)揮免疫刺激作用。IL-10修飾的供體來源imDC利于角膜植片存活，誘導(dǎo)角膜移植免疫耐受，且比單純imDC注射時角膜植片存活時間更長[43]。來自imDC的外泌體分泌的miR-682經(jīng)負調(diào)節(jié)CD4+T細胞中的ROCK2基因促進Treg分化，誘導(dǎo)模型小鼠移植腎的免疫耐受[44]，其中ROCK2是miR-682的靶標。來自imDC的外泌體亦可能誘導(dǎo)角膜植片的免疫耐受，但尚未見報道。

2.4 MDSC及其外泌體

MDSC是一種異質(zhì)性的未成熟髓系細胞群體，可產(chǎn)生免疫抑制因子，從而發(fā)揮免疫抑制活性，MDSC可用于誘導(dǎo)免疫耐受并延長同種異體移植物存活時間，已經(jīng)成為移植免疫學(xué)研究的重點[45]。角膜移植手術(shù)后立即向模型鼠眼眶后注射炎癥、腫瘤誘導(dǎo)的MDSC均能抑制CD4+T細胞增生、角膜植片新生血管和炎癥細胞浸潤，延長同種異體角膜移植物存活時間[46-47]。MDSC來源的外泌體在體外促進Treg擴增，體內(nèi)則更為明顯，可抑制活化的T細胞增生和細胞毒性反應(yīng)[48]。人類MDSC來源的外泌體在體外過度表達miR-29a-3p和miR-93-5p，可抑制Th1和Th17細胞分化[49]。MDSC來源的外泌體在腫瘤、自身免疫性疾病等方面的作用已有文獻報道，但尚無對角膜移植排斥反應(yīng)的報道。因此MDSC來源的外泌體誘導(dǎo)角膜移植排斥反應(yīng)的免疫耐受有研究價值。

3 小結(jié)

MSC、Treg、imDC、MDSC都可調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，其外泌體通過傳遞蛋白質(zhì)、核酸等內(nèi)容物可發(fā)揮其來源細胞的生物學(xué)作用。通過抑制T細胞增生、轉(zhuǎn)換巨噬細胞表型、調(diào)控Th細胞分化、上調(diào)Treg表達等機制發(fā)揮抗炎和免疫抑制作用，外泌體對眼表免疫相關(guān)疾病如角膜移植排斥反應(yīng)、干眼、SS、眼部GVHD有治療潛力。外泌體參與角膜損傷的修復(fù)，遞送活性β-葡糖醛酸糖苷酶并隨后分解MPS Ⅶ中累積的糖胺聚糖，減輕患者角膜混濁[14,28]。在眾多的外泌體來源中，MSC被認為最有臨床應(yīng)用潛力，且研究最多。不同來源的MSC抗炎、免疫抑制和促進組織修復(fù)作用相似，但分離難易程度有所不同。外泌體來源細胞的生理病理狀態(tài)影響著外泌體功能[11]。不依賴活細胞的外泌體比活細胞更穩(wěn)定，無免疫排斥、惡變和細胞治療相關(guān)小血管堵塞的風(fēng)險，從而提高了治療的有效性和安全性。不同的miRNA、蛋白質(zhì)由外泌體傳遞到相應(yīng)組織發(fā)揮作用逐漸被認識到，可為每種眼病定義與外泌體治療效果相關(guān)的精確因子，使其應(yīng)用于患者之前在外泌體中過表達，從而最大限度發(fā)揮療效。盡管有實驗研究顯示了外泌體的治療潛力，但轉(zhuǎn)化到臨床仍有很多工作要做，比如如何高效分離純化外泌體等。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突