蔣雨晴，趙小艷，張 鑫，盧群文，蘇程果，朱 俊△

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院/第三附屬醫(yī)院，四川 成都 610072；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川 成都 610075）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一種致殘率極高的系統(tǒng)性、進(jìn)行性、自身免疫性疾病，是目前臨床最常見(jiàn)的免疫性疾病之一，其主要病理特征為滑膜炎性細(xì)胞及炎性因子浸潤(rùn)、滑膜細(xì)胞“腫瘤樣”異常過(guò)度增殖、新生血管形成及軟骨和骨質(zhì)不可逆破壞[1-2]。研究證實(shí)，RA 關(guān)節(jié)腔存在低氧微環(huán)境。RA 關(guān)節(jié)腔內(nèi)由于大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)和滑膜成纖維樣細(xì)胞（Fibroblastlike synoviocyte, FLS）的類似“腫瘤樣”異常過(guò)度增殖，造成RA 關(guān)節(jié)內(nèi)部毛細(xì)血管之間氧氣彌散距離增加，導(dǎo)致滑膜組織低氧[3-4]。研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HⅠF-1）是組織參與缺氧調(diào)控的重要核轉(zhuǎn)錄因子[5-6]。低氧導(dǎo)致RA滑膜細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1表達(dá)上調(diào)，繼而HⅠF-1 可通過(guò)調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活化從而促進(jìn)FLS的增殖存活、誘導(dǎo)滑膜血管新生、促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌等，影響RA 的發(fā)病和病情進(jìn)展[7-8]。鑒于低氧在RA 發(fā)病中的重要作用，本文擬綜述HⅠF-1及其在RA發(fā)病機(jī)制中的相關(guān)作用。

1 低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）

1.1 HⅠF-1的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及活性調(diào)節(jié)

HⅠF-1 是1992 年由Semenza GL 等在人肝癌細(xì)胞株Hep3B 細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子[9]，其屬于缺氧誘導(dǎo)因子蛋白家族（HⅠFs）。HⅠF-1 是由α（120 KD）和β（91～94KD）兩個(gè)亞基（同屬于bHLH-PAS蛋白超家族）構(gòu)成的異源二聚體蛋白，其中β亞基為組成性表達(dá)，常氧和低氧狀態(tài)下在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)；α 亞基為功能性亞基，其表達(dá)受細(xì)胞氧濃度的嚴(yán)密調(diào)控；HⅠF-1的活性主要由HⅠF-1α 決定[10]。人類HⅠF-1α 基因定位于14 號(hào)染色體（14q21～24），其cDNA 全長(zhǎng)3720bp，編碼826個(gè)氨基酸。α亞基包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中一個(gè)是氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（Oxygen dependent degradation domain,ODDD），調(diào)控HⅠF-1a常氧條件下α亞基的泛素化降解；其N端由bHLH與PAS 兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，與β 亞基形成異源二聚體并與低氧應(yīng)答DNA 的低氧應(yīng)答元件（Hypoxia response element,HREs）區(qū)域進(jìn)行結(jié)合；其C 端包括2 個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transcriptional activation domain,TAD：N-TAD 與C-TAD）決定了蛋白的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性；另外，N-TAD 與C-TAD 之間是抑制結(jié)構(gòu)域（inhibition domain, ⅠD），抑制HⅠF-1α常氧條件下的轉(zhuǎn)錄活性[11-12]。

常氧條件下，HⅠF-1α 的半衰期不足5min，基本檢測(cè)不到其表達(dá)，HⅠF-1α 蛋白通過(guò)脯氨酰羥化酶蛋白（prolyl hydroxylase domain proteins,PHDs）的羥基化作用，使HⅠF-1α 的ODDD 結(jié)構(gòu)域上的兩個(gè)關(guān)鍵位置發(fā)生羥基化，最后經(jīng)泛素化-蛋白酶體途徑被降解[13-14]。PHD 的羥基化需要有O2、Fe2+及酮戊二酸等的參與才能實(shí)現(xiàn)，因此該過(guò)程是氧依賴性的。除此之外，天門冬氨酸羥基化酶（factor inhibiting HⅠF, FⅠH）通過(guò)對(duì)HⅠF-1α 的C端結(jié)構(gòu)域上天冬酰胺殘基的羥基化修飾來(lái)調(diào)節(jié)其活性。FⅠH 可降低HⅠF-1α 與其轉(zhuǎn)錄輔助因子P300/CBP 的結(jié)合能力，降低HⅠF-1α 對(duì)其靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。FⅠH 與PHD 家族類似，其酶活性受氧濃度的直接調(diào)控[15]。

低氧條件下，PHDs 的活性降低，HⅠF-1α 的泛素化和降解過(guò)程受抑制，HⅠF-1α 無(wú)法被正常識(shí)別、結(jié)合及降解，HⅠF-1α 蛋白穩(wěn)定表達(dá)，導(dǎo)致大量HⅠF-1α 蛋白在胞內(nèi)積聚，從胞漿進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與由胞漿轉(zhuǎn)移到胞核的HⅠF-lβ 結(jié)合，聚合成HⅠF-1 分子，識(shí)別并結(jié)合至缺氧反應(yīng)基因的HRE上，以啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄[16]。另外，低氧條件下HⅠF-1α 乙酰化減少其表達(dá)增加。研究表明，氧濃度＜6%時(shí)，HⅠF-1α 含量呈指數(shù)級(jí)上升，氧濃度＜0.5%時(shí)，HⅠF-1α 含量達(dá)最高峰[17]。目前認(rèn)為，低氧狀態(tài)下HⅠF-1α 表達(dá)量的調(diào)節(jié)并不取決于HⅠF-1α mRNA 水平，而取決于HⅠF-1α 蛋白翻譯后水平，即通過(guò)增加HⅠF-1α 蛋白穩(wěn)定性，抑制其降解來(lái)實(shí)現(xiàn)[18]。

此外，低氧并非誘導(dǎo)和激活HⅠF-1α穩(wěn)定及轉(zhuǎn)錄的唯一因素，其他因素如機(jī)械應(yīng)力、激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和低PH 值等也可以誘發(fā)和激活HⅠF-1α[19-21]。有研究報(bào)道，細(xì)菌脂多糖通過(guò)NFκB/MAPK 通路誘導(dǎo)人巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞HⅠF-1α 活化[22]。另 外，常氧條件下，ⅠL-1β、TNF-α、PDGF、ⅠGF 等生長(zhǎng)或細(xì)胞因子亦可上調(diào)HⅠF-1α的表達(dá)水平[23-24]。

1.2 HⅠF-1對(duì)下游靶基因的調(diào)控

研究報(bào)道，作為缺氧調(diào)控的主要的核轉(zhuǎn)錄因子，HⅠF-1α具有廣泛的靶基因譜，可調(diào)控人類大約1%的所有基因，具體包括如下：（1）與血管生成相關(guān)的基因，包括VEGF 及其血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）的編碼基因；（2）與細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)的基因，包括胰島素樣生長(zhǎng)因子-2（ⅠGF2）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（TGF-α）、p42/p44 促有絲分裂原活化蛋白激酶、P13K、p53、MDM2 等的編碼基因；（3）葡萄糖代謝：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT 1 和GLUT 3、跨膜碳酸氫酶等；（4）鐵代謝相關(guān)的基因：轉(zhuǎn)移受體、銅藍(lán)蛋白（即鐵氧化物酶）等[25]。

VEGF 是促進(jìn)新生血管生成最重要的調(diào)節(jié)因子，低氧條件下HⅠF-1α 在基因水平上直接激活調(diào)控其下游靶基因VEGF，進(jìn)而誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，增加微血管通透性，促進(jìn)血管生成和腫瘤間質(zhì)形成等機(jī)制參與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[26-27]。RA 主要的病理特點(diǎn)為血管翳的形成，有賴于新生血管的生成，VEGF 是調(diào)控血管生成的主要因素，在RA 血管翳的形成中起著極為重要的作用[28-29]。不僅在RA 中，更多地在許多腫瘤如膽囊癌、肺癌、宮頸癌等均證實(shí)VEGF參與其發(fā)生及發(fā)展[30]。

p53 基因是細(xì)胞內(nèi)一種重要的抑癌基因，有野生型（wt p53）和突變型（mt p53）兩種形式[31]。正常細(xì)胞周期中的野生型p53基因參與細(xì)胞周期調(diào)控，抑制細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)凋亡，對(duì)凋亡起促進(jìn)作用；而突變型p53 基因可滅活野生型p53的功能，抑制凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖，促進(jìn)RA病情進(jìn)展及引起腫瘤的形成[32-33]。當(dāng)缺氧等應(yīng)激因素引起細(xì)胞DNA 損傷時(shí)，wt p53 蛋白迅速高表達(dá)，使損傷的細(xì)胞停滯在G期進(jìn)行修復(fù)DNA損傷，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，預(yù)防腫瘤發(fā)生[34]。

MDM2 作為一種癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤形成中起著關(guān)鍵作用，在許多人類惡性腫瘤（如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等）的細(xì)胞中呈現(xiàn)出高度擴(kuò)增表達(dá)；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MDM2 過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞異常癌性增殖，也可增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤發(fā)生傾向[35-36]。近年來(lái)研究報(bào)道，MDM2 在急性腎損傷、自身免疫性疾?。ㄈ缦到y(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎）等疾病中發(fā)揮致炎的作用[37]。MDM2作為p53 關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)因子，MDM2 與p53 之間存在自動(dòng)調(diào)節(jié)的負(fù)反饋環(huán)，MDM2 與p53 之間存在嚴(yán)密的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而抑制p53的功能發(fā)揮，抑制細(xì)胞凋亡[37]。同時(shí)作為HⅠF-1a 下游靶基因，MDM2 還具有與p53 無(wú)關(guān)的作用，MDM2 可通過(guò)激活MAPK 和NF-KB 途徑促進(jìn)RA 炎癥反應(yīng)[38]。Zhang L等研究發(fā)現(xiàn)，MDM2在RA 成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于OA-FLS，MDM2 蛋白表達(dá)與RA疾病活性呈正相關(guān)，抑制MDM2 可有效控制RA炎癥反應(yīng)[38]。

GLUT-1 是一種機(jī)體細(xì)胞被動(dòng)運(yùn)載葡萄糖的蛋白，使葡萄糖分子易穿過(guò)細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層，從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，供給正常細(xì)胞的部分能量攝取，其參與如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。腫瘤迅速生長(zhǎng)需要葡萄糖提供能量，癌細(xì)胞消耗大量能量呈低氧狀態(tài)，一方面糖代謝途徑由原來(lái)的有氧氧化變成糖酵解途徑，能量不足，需要GLUT-1 表達(dá)增加來(lái)滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求；另一方面，缺氧狀態(tài)下HⅠF-1α 被誘導(dǎo)激活，作用于下游靶基因GLUT-1，使其表達(dá)增加，加速癌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)[26-27]。

2 HIF-1與RA

RA 關(guān)節(jié)腔為缺氧微環(huán)境[39-40]。缺氧狀態(tài)下，HⅠF-1α 是組織參與缺氧調(diào)控的重要核轉(zhuǎn)錄因子。在RA關(guān)節(jié)腔缺氧條件下，HⅠF-1α在調(diào)節(jié)RA病理過(guò)程如炎癥、新生血管生成、細(xì)胞增殖與存活中起重要作用。

2.1 HⅠF-1與RA滑膜炎癥

滑膜炎是RA 病理特征之一。低氧條件下，HⅠF-1α 蛋白在胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并大量積聚，啟動(dòng)相關(guān)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而上調(diào)細(xì)胞因子（ⅠL-1、ⅠL-6、ⅠL-8、ⅠL-15、ⅠL-17、ⅠL-33、TNF-α、ⅠFN-γ）、血小板反應(yīng)蛋白-1、趨化因子（CXCL12、CXCL8、CCL20）、基質(zhì)金屬蛋白酶（如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9）等的表達(dá)[41]，從而促進(jìn)RA 的滑膜炎癥等病理反應(yīng)[42]。有學(xué)者觀察了HⅠF-1α 基因敲除小鼠的炎癥反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)HⅠF-1α 基因敲除（即lysm-cre/hif-1α）小鼠幾乎沒(méi)有浸潤(rùn)或水腫的跡象，炎癥反應(yīng)明顯改善[43]。

2.2 HⅠF-1與RA滑膜血管生成

大量新生血管形成是RA 病理特征之一，大量的新生血管形成具有侵蝕性血管翳，侵蝕破壞關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨及周圍的軟組織，導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形。VEGF 是促進(jìn)血管新生重要的調(diào)節(jié)因子，其在RA 中表達(dá)升高，并且與RA 病情呈正相關(guān)。RA 關(guān)節(jié)腔內(nèi)缺氧導(dǎo)致滑膜細(xì)胞內(nèi)HⅠF-1α 表達(dá)上調(diào)，繼而HⅠF-1α 可通過(guò)調(diào)控下游靶基因VEGF 的轉(zhuǎn)錄活化從而促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌、誘導(dǎo)滑膜血管新生，參與并調(diào)節(jié)RA滑膜血管翳的形成。

Tang N 等[44]對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，敲除腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞HⅠF-1α 基因后，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化性、細(xì)胞外基質(zhì)滲透和傷口愈合等功能受到抑制，并且VEGF 的表達(dá)及實(shí)體瘤血管的生長(zhǎng)也受到抑制，這些結(jié)果證實(shí)了HⅠF-1α 對(duì)血管的調(diào)控功能。Park SY 等[45]證實(shí)HMGB1 通過(guò)調(diào)控HⅠF-1α 的表達(dá)，上調(diào)VEGF 的表達(dá)，促進(jìn)RA 滑膜的血管新生。一些學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，HⅠF-1a 可以誘導(dǎo)VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)新生血管形成，增加血管密度；同時(shí)，VEGF 可以使HⅠF-1a 對(duì)血管張力靶基因的作用加強(qiáng)，使炎癥或腫瘤的局部血流增加，從而有利于其生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[46]。

2.3 HⅠF-1與RA滑膜細(xì)胞凋亡

研究表明[34]，缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以通過(guò)HⅠF-1α 介導(dǎo)的p53 依賴性途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)，而HⅠF-1α可以抑制野生型p53結(jié)合蛋白的降解并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。有學(xué)者在實(shí)體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，p53 的缺失可顯著降低缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的發(fā)生[47]。

在常氧環(huán)境下，由于MDM2 對(duì)p53 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，野生型p53 在細(xì)胞中呈低水平表達(dá)。在缺氧條件下，缺氧可以通過(guò)HⅠF-1α 信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)p53 穩(wěn)定表達(dá)，并且可以通過(guò)結(jié)合p53 蛋白與MDM2 競(jìng)爭(zhēng)，從而阻止p53 被MDM2 途徑降解，進(jìn)而導(dǎo)致p53 途徑的激活并促進(jìn)p53-依賴性的細(xì)胞凋亡[34,48]。

3 研究展望

在缺氧環(huán)境下，HⅠF-1α 信號(hào)通路激活可能通過(guò)影響滑膜炎癥、滑膜血管生成和滑膜細(xì)胞凋亡等機(jī)制在RA 的發(fā)病及病情進(jìn)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用。調(diào)控HⅠF-1α 及其下游靶基因的表達(dá)，可控制RA 病情的發(fā)展，若挖掘針對(duì)HⅠF-1α 及其相關(guān)信號(hào)通路的研究可能為進(jìn)一步了解RA 的發(fā)病機(jī)制和新的治療策略提供新的視角和思路。