吳妙鴻，方 靈，司瑞茹，傅建煒*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所， 福建 漳州 363005； 2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所/福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室， 福建 福州 350003)

姜黃CurcumaLongaL.是姜科姜黃屬Curcuma植物根莖的統(tǒng)稱，盛產(chǎn)于亞洲國家(如中國、孟加拉國、泰國、柬埔寨、馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓等)和南美國家(如秘魯、玻利維亞)[1-2]，姜黃素類化合物是姜黃中一類重要的次級代謝產(chǎn)物，屬于多酚類物質(zhì)，根據(jù)其苯環(huán)側(cè)鏈取代基不同，姜黃素類化合物可進(jìn)一步分為姜黃素(curcumin, CurI )、脫甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin, CurII)、雙脫甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin, CurIII)等[3]。姜黃素在中國和印度等國家的利用已有數(shù)千年的歷史[4]，大量研究表明姜黃素具有抗炎、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗瘧疾、抑菌、保肝、保護(hù)神經(jīng)、抗腫瘤等生物活性[5-9]，因此近年來姜黃素在醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料等行業(yè)的利用受到極大的關(guān)注[10]。姜黃素還具有很好的著色性，有研究表明姜黃素的著色效果優(yōu)于其他天然黃色素，如胡蘿卜素、梔子黃和玉米黃[11]，在GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中，姜黃和姜黃素被列為食品添加劑，可作為著色劑用于食品中。隨著人們健康意識的逐步提升，人工色素由于其潛在的危害性為消費者所詬病，姜黃素產(chǎn)品作為著色性好、無毒副作用，且具有較強(qiáng)生物活性的天然色素[12]，已成為國內(nèi)外重要食品添加劑。

當(dāng)前我國已開發(fā)出水溶性和油溶性姜黃色素產(chǎn)品，根據(jù)性狀可分為粉狀、液體和晶體，還可通過多種復(fù)配調(diào)配出不同顏色[13]，市面上的姜黃素產(chǎn)品種類繁多，但由于原料選用和生產(chǎn)工藝的不同，質(zhì)量良莠不齊，影響了其在食品中的使用效果和產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前，關(guān)于市售姜黃素產(chǎn)品品質(zhì)的研究還鮮見報道，本研究采用UPLC法測定5種市售姜黃素產(chǎn)品中姜黃素類化合物含量，分析對比其DPPH、ABTS、超氧陰離子自由基清除能力、總抗氧化能力和脂質(zhì)過氧化抑制能力，并將其與實驗室自制姜黃素進(jìn)行對比，以期對不同姜黃素產(chǎn)品的品質(zhì)有初步了解，為姜黃素產(chǎn)品的品質(zhì)評價和加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試樣品：5種姜黃素產(chǎn)品均為食品級，購自佛山市康能生物科技有限公司、優(yōu)寶嘉食品旗艦店、美味滋食品配料商城、山東中天生物科技有限公司和河南祥意商貿(mào)有限公司，簡稱樣品C1～C5，實驗室自制姜黃素為對照，簡稱樣品EC。姜黃藥材購自江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司。

試劑：抑制超氧陰離子自由基(O2-·)測試盒、總抗氧化能力測試盒(南京建成生物工程研究所)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(美國Sigma公司)；冰醋酸、無水乙醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、EDTA-Na2、VC(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；三氯乙酸、卵磷脂、FeSO4·4H2O、2-硫代巴比妥酸、二丁基羥基甲苯(butylatedhydroxy toluene,BHT)(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；乙腈(HPLC級，德國Merck公司)；姜黃素(CurI)、脫甲氧基姜黃素(CurII)和雙脫甲氧基姜黃素(CurIII)標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)。

1.2 主要儀器設(shè)備

SPD-M40超高效液相色譜儀(日本島津公司)；BS110S分析天平(德國Sartorius集團(tuán))；PC650超聲波細(xì)胞破碎儀(上海皓莊儀器有限公司)；CR22N高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；UPW-20N超純水機(jī)(北京歷元電子儀器有限公司)；GZX- 9246MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司)；L5S紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；iMark酶標(biāo)儀(美國Biorad公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1實驗室自制姜黃素(EC)提取制備 用研磨機(jī)將姜黃粉碎，過80目篩，在姜黃粉末中按1∶80(g∶mL)的料液比加入70%乙醇溶液，以240 W的功率超聲破碎30 min，于搖床中以300 r·min-1振搖提取1 h，隨后以4 000 r·min-1離心15 min，收集上清液，重復(fù)提取2次，合并上清液，提取液在50℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無乙醇味，再將除去乙醇的提取液冷凍干燥即得姜黃素提取物(EC)。

1.3.2姜黃素類化合物含量測定 色譜條件[14]為色譜柱：SunFire C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm，美國沃特世公司)；柱溫：30℃；流動相：(A)乙腈，(B)0.5%乙酸水；等度洗脫：50% A+50% B；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：425 nm。

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備和測定。分別精確稱取10 mg姜黃素(CurI)、脫甲氧基姜黃素(CurII)和雙脫甲氧基姜黃素(CurIII)標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜純甲醇定容至10 mL，配制成1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精確量取儲備液，用甲醇將CurI稀釋成濃度梯度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 μg·mL-1，將CurII、CurIII稀釋成濃度梯度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，利用上述色譜條件進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x，單位：μg·mL-1)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，3個標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程、R2和保留時間見表1。

表1 姜黃素類化合物回歸方程

供試品溶液制備與測定。稱取5種市售姜黃素產(chǎn)品、實驗室自制姜黃素EC各10 mg，甲醇定容至100 mL，配制成0.1 mg·mL-1溶液，用0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，取濾液待測。

1.3.3抗氧化活性測定 DPPH、ABTS自由基清除能力測定參照文獻(xiàn)[15-16]的方法。自由基清除能力以清除率為50%時樣品的質(zhì)量濃度(IC50)評價，以VC作為陽性對照。

O2-·自由基清除能力的測定參考周麗娟等[17]的方法，采用抑制O2-·自由基測試盒測定，將1 mgVC清除O2-·自由基的能力定義為1個活力單位(U)，以每克樣品清除自由基的活力單位(U·g-1)評價樣品的O2-·自由基清除能力，以VC作為陽性對照。

總抗氧化能力測定采用鐵離子還原能力(ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)法，用總抗氧化能力測試盒(FRAP法)測定，總抗氧化能力以每克樣品將Fe3+還原成Fe2+的量計，單位為mmol·g-1，以VC作為陽性對照。

脂質(zhì)過氧化(LPO)抑制活性測定參考韋會平等[18]的方法稍做修改。在150 mL磷酸鹽緩沖液(10 mmol·L-1，pH 7.0，提前冷凍至4℃)中加入1 g卵磷脂，漩渦振蕩至完全溶解。取0.5 mL卵磷脂溶液，依次加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液、0.5 mL樣品溶液和1.0 mL 2.5 mmol·L-1EDTA Na2-Fe2+溶液，充分混勻后在37℃下水浴反應(yīng)45 min，隨后依次加入2.0 mL濃度為28%的三氯乙酸溶液和1.0 mL濃度為1%的2-硫代巴比妥酸溶液，充分混勻后置于沸水浴中反應(yīng)10 min，由于體系中的油脂使溶液呈渾濁狀態(tài)，因此反應(yīng)液冷卻后需以8 000 r·min-1離心4 min，最后取上清液在532 nm下測定吸光值，以磷酸鹽緩沖液調(diào)零。LPO抑制活性計算公式如下：

式中，A0為空白組，即磷酸鹽緩沖液代替樣品溶液的吸光值；Ab為本底組，即磷酸鹽緩沖液代替2-硫代巴比妥酸溶液的吸光值；As為樣品組或陽性對照組的吸光值，以BHT作為陽性對照。

1.3.4數(shù)據(jù)處理 所有試驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進(jìn)行回歸分析，顯著性采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件通過Duncan法分析，雙變量相關(guān)性采用SPSS 22.0軟件通過Pearson法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)品的姜黃素類化合物含量比較

姜黃素類化合物混標(biāo)和不同姜黃素產(chǎn)品的色譜圖見圖1，在該色譜條件下，3種姜黃素類化合物分離理想，峰形好、無其他物質(zhì)干擾，6個樣品的色譜圖中姜黃素類化合物的相對峰面積均有所差異。

注：姜黃素類化合物混標(biāo)上機(jī)濃度為0.5 μg·mL-1，姜黃素產(chǎn)品上機(jī)濃度為0.1 mg·mL-1

由表2可知，5種市售姜黃素中，CurI含量以樣品C5的最高，其余4個樣品無顯著差異；CurII含量均無顯著差異；CurIII含量以樣品C1和C4較高，其余樣品無顯著差異；總姜黃素含量排序為：C5>C1>C4>C2>C3，C5與C1、C4、C2無顯著差異，但顯著高于C3。不同姜黃素產(chǎn)品中CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ的含量比例有較大差異，C2、C3、EC均表現(xiàn)為CurⅠ>CurⅡ>CurⅢ，C1、C4均表現(xiàn)為CurⅠ=CurⅢ>CurⅡ，C5則表現(xiàn)為CurⅠ>CurⅡ>CurⅢ，這可能是姜黃原料不同所導(dǎo)致的。市售姜黃素中總姜黃素類化合物含量為1.278～2.188 g·hg-1，方恩華等[19]研究了食品級商業(yè)姜黃素添加劑中的姜黃素類化合物含量，發(fā)現(xiàn)粉末狀和油溶姜黃色素的總姜黃素含量分別為1.33、2.96 g·hg-1，本研究結(jié)果與其接近。EC中3種姜黃素類化合物和總姜黃素含量均顯著高于市售姜黃素(P<0.05)。

表2 不同產(chǎn)品姜黃素類化合物含量及比例

2.2 不同產(chǎn)品的抗氧化活性比較

2.2.1DPPH自由基清除能力 DPPH自由基是一種穩(wěn)定自由基，其結(jié)構(gòu)中心氮橋一側(cè)氮原子上有一個未成對電子，自由基清除劑可與未成對電子配對，從而達(dá)到清除自由基的效果。姜黃素產(chǎn)品對DPPH自由基具有顯著清除能力，其質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈線性正相關(guān)關(guān)系(表3)，對比IC50值可知，市售姜黃素的清除能力大小排序為C5>C3>C2>C4>C1，其中C5與C3、C2間無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于C4和C1。EC的DPPH自由基清除能力顯著高于市售姜黃素，為其7～15倍。所有姜黃素產(chǎn)品清除DPPH自由基的能力均顯著低于陽性對照VC(P<0.05)。

表3 不同姜黃素產(chǎn)品的抗氧化活性比較

2.2.2ABTS自由基清除能力 不同姜黃素產(chǎn)品對ABTS自由基均有顯著清除能力，且與其質(zhì)量濃度呈對數(shù)函數(shù)關(guān)系(表3)。對比IC50值可知，市售姜黃素清除能力大小表現(xiàn)為C5>C2>C3>C4>C1，其中C5與C2、C3間無顯著差異，但顯著高于C4和C1，這與其DPPH自由基清除能力的情況相一致。EC的ABTS自由基清除能力顯著高于市售姜黃素，為其13～24倍。陽性對照VC清除ABTS自由基的能力顯著高于所有姜黃素產(chǎn)品。

2.2.3LPO抑制活性 脂質(zhì)過氧化(LPO)是指脂類的多不飽和脂肪酸與自由基通過一系列鏈?zhǔn)椒磻?yīng)形成脂質(zhì)過氧化自由基的反應(yīng)過程[20]，姜黃素的LPO抑制活性，表征了其抑制油脂氧化的能力，對于研究姜黃素產(chǎn)品在肉制品中的應(yīng)用價值具有一定指導(dǎo)意義。姜黃素產(chǎn)品均具有一定的LPO抑制活性，且與其質(zhì)量濃度呈對數(shù)函數(shù)關(guān)系，不同產(chǎn)品抑制LPO的IC50見表3，市售姜黃素活性大小表現(xiàn)為C5>C3>C2>C4>C1，排序與其DPPH自由基清除能力的情況一致，與ABTS自由基清除能力接近。EC的LPO抑制活性顯著高于市售姜黃素，是其12～21倍。陽性對照BHT的LPO抑制活性高于所有姜黃素產(chǎn)品。

2.2.4O2-·自由基清除能力 O2-·自由基是基態(tài)氧接受一個電子形成的氧自由基，作為生物體代謝過程中產(chǎn)生的自由基，可以攻擊核酸、蛋白、脂質(zhì)等生物大分子，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，與機(jī)體的組織損傷有密切聯(lián)系[21]。由表3可知，姜黃素產(chǎn)品具有一定的O2-·自由基清除能力，但均比較弱，顯著低于陽性對照VC(P<0.05)。C1、C4、C5的清除能力無顯著差異，而C2和C3沒有清除O2-·自由基的能力，EC的清除能力則顯著大于5種市售姜黃素(P<0.05)。

2.2.5總抗氧化能力 樣品的總抗氧化能力是指將Fe3+還原成Fe2+的能力，反映了抗氧化劑的電子轉(zhuǎn)移能力。由表3可知，市售姜黃素產(chǎn)品均具有一定的總抗氧化能力，表現(xiàn)為C2>C5>C3>C4>C1，5種市售姜黃素的總抗氧化能力差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于EC(P<0.05)，陽性對照VC的總抗氧化能力顯著高于所有姜黃素產(chǎn)品。

2.3 姜黃素類化合物含量與抗氧化活性的相關(guān)分析

由表4可知，3種姜黃素類化合物和總姜黃素的含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、LPO抑制活性、O2-·自由基清除能力、總抗氧化能力均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01,0.976≤r≤0.999)，說明樣品中姜黃素類化合物含量對其抗氧化能力強(qiáng)弱具有重要影響。

表4 姜黃素類化合物含量與抗氧化活性的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

本研究對比了不同姜黃素產(chǎn)品的功能成分含量和抗氧化活性，結(jié)果表明5種市售姜黃素的總姜黃素類化合物含量范圍為1.278～2.188 g·hg-1，而實驗室自制姜黃素EC的總姜黃素含量則為16.655 g·hg-1，顯著高于市售姜黃素，原因一方面是因為工業(yè)化生產(chǎn)市售姜黃素時姜黃素類化合物提取率低、純度不高；另一方面是為使姜黃素在食品中能形成穩(wěn)定的體系、改善姜黃素的性狀或降低生產(chǎn)成本，大部分姜黃素產(chǎn)品是將姜黃素與乳化劑、麥芽糊精等物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配的二次加工品，因此市售姜黃素產(chǎn)品中姜黃素類化合物含量偏低。不同姜黃素產(chǎn)品均具有顯著的抗氧化活性，但存在一定差異。5種市售姜黃素中，DPPH、ABTS自由基清除能力和LPO抑制活性以C5最強(qiáng)，O2-·自由基清除能力以C1最強(qiáng)，總抗氧化能力以C2最強(qiáng)，EC的抗氧化活性均顯著高于5種市售姜黃素。

為研究姜黃素產(chǎn)品的姜黃素類化合物含量與抗氧化活性之間的關(guān)系，本試驗對二者的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明3種姜黃素類化合物的含量與DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、LPO抑制活性、O2-·自由基清除能力、總抗氧化能力均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01, 0.976≤r≤0.999)。已有許多研究表明姜黃素類化合物具有顯著的抗氧化活性，張艷等[22]研究發(fā)現(xiàn)CurⅠ、CurⅡ和CurⅢ三者清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分別為4～7、1.5～7 μg·mL-1；孫鵬堯[23]測得姜黃提取純化液清除DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分別為18.18、28.89 μg·mL-1；Jayaprakasha等[24]研究發(fā)現(xiàn)CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ能顯著抑制亞油酸過氧化，其抑制率分別達(dá)到81.98%、81.77%和73%。唐傳核等[25]認(rèn)為姜黃素清除自由基的過程分為捕獲自由基和中止自由基兩個階段，和大多數(shù)酚類物質(zhì)一樣，姜黃素的鄰-二羥基基團(tuán)使其能夠捕獲自由基，隨后吸附了自由基的姜黃素經(jīng)氧化反應(yīng)可生成具有穩(wěn)定二氫呋喃結(jié)構(gòu)的非自由基物質(zhì)，從而發(fā)揮抗氧化的作用。綜合上述研究結(jié)果，市售姜黃素的抗氧化活性和姜黃素類化合物含量，均顯著低于實驗室自制姜黃素，CurⅠ、CurⅡ、CurⅢ是姜黃素產(chǎn)品抗氧化活性的主要貢獻(xiàn)物質(zhì)。