基于HPLC-CAD指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法分析不同產(chǎn)地北柴胡藥材質(zhì)量

周麗娟，楊曉寧*，王雅芝，張超，王玉龍，孫欣光*（.北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 00085；.山西振東道地藥材開(kāi)發(fā)有限公司，山西 長(zhǎng)治 04700）

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumwilld.的干燥根，前者習(xí)稱(chēng)北柴胡，春秋二季采挖，除去莖葉和泥沙，干燥。柴胡具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽(yáng)氣等功效，臨床用于感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、胸脅脹痛、月經(jīng)不調(diào)、子宮脫垂、脫肛等[1]。藥理學(xué)研究表明，柴胡具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[2-4]。我國(guó)柴胡資源豐富，分布廣泛，人工栽種主要以北柴胡為主，且在山西和甘肅等地的栽種面積最大。

柴胡藥材含有皂苷、黃酮、揮發(fā)油、多糖等多種活性成分[2，5-6]，目前多以柴胡皂苷來(lái)評(píng)價(jià)柴胡的質(zhì)量，2020年版《中國(guó)藥典》一部“柴胡”藥材項(xiàng)下，僅以柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 作為質(zhì)控指標(biāo)[1]。中藥成分復(fù)雜多樣，其臨床藥效的發(fā)揮是所含化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，因此，單一或幾個(gè)成分的含量測(cè)定很難全面地評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，而中藥指紋圖譜可以從整體上對(duì)中藥的成分進(jìn)行分析，能較全面地反映中藥質(zhì)量，體現(xiàn)中藥材質(zhì)量的整體性[7-8]，因此本研究建立了柴胡藥材的指紋圖譜，并對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡藥材進(jìn)行了研究。

目前關(guān)于柴胡藥材指紋圖譜的研究大多采用紫外檢測(cè)器（UV）或蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）[9-12]。UV 靈敏度高、噪聲低、線(xiàn)性范圍寬，但是不適用于無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收化合物的分析；ELSD 為通用檢測(cè)器，但其靈敏度低、重現(xiàn)性較差。電噴霧檢測(cè)器（CAD）作為一種通用型檢測(cè)器，其檢測(cè)不依賴(lài)于分析物的分子結(jié)構(gòu)，尤其適用于皂苷類(lèi)、糖類(lèi)、生物堿類(lèi)、脂類(lèi)化合物等無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析[13-14]。同時(shí)CAD 是一個(gè)質(zhì)量敏感型檢測(cè)器，其檢測(cè)的響應(yīng)值與進(jìn)樣成分的含量相關(guān)，且具有較高的靈敏度和較低的檢測(cè)限[15-16]，特別適合中藥指紋圖譜的全面成分分析，可定量化表征其中的化學(xué)成分，在中藥成分檢測(cè)及質(zhì)量研究方面得到廣泛應(yīng)用[17-21]。柴胡皂苷類(lèi)成分具有較弱的紫外吸收，不適合采用UV 檢測(cè)，與ELSD 相比CAD 具有更高的靈敏度和更低的檢測(cè)限，因此選擇HPLC-CAD 法建立柴胡藥材的指紋圖譜。

本研究建立了北柴胡HPLC-CAD 藥材指紋圖譜方法，標(biāo)定共有峰，并結(jié)合相似度分析、聚類(lèi)分析（CA）、主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）對(duì)不同產(chǎn)地北柴胡成分進(jìn)行成分表征及質(zhì)量差異研究，為北柴胡藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

Uitimate 3000 型高效液相色譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；ME204/02 型萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；MSA36S-0CE-DH 型百萬(wàn)分之一電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；Milli-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）。

色譜乙腈、甲醇（FEPRUE）；分析純甲酸（MREDA）；純水（MiLLi-Q 制備）。柴胡皂苷a（批號(hào)：110777-201912，純度：94.8%）、柴胡皂苷d（批號(hào)：110778-201912，純度：96.3%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；柴胡皂苷c（批號(hào)：PS000193，純度：99.65%）、柴胡皂苷e（批號(hào)：PS200702-15，純度：99.94%）（成都普思生物科技股份有限公司）；柴胡皂苷f(shuō)（批號(hào)：6131，純度：99.7%，上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司）。北柴胡藥材均購(gòu)自安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)高建平教授鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm× 4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，10%～30%B；20～35 min，30%～35%B；35～60 min，35%～40%B；60～65 min，40%～45%B；65～70 min，45%B；70～85 min，45%～65%B；85～90 min，65%～85%B；90～100 min，85%～90%B；100～105 min，90%～95%B）；柱溫40℃；流速1.4 mL·min－1；進(jìn)樣量20 μL，CAD 霧化室溫度50℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷e、柴胡皂苷f(shuō) 對(duì)照品，分別精密稱(chēng)定，加80%甲醇制成每1 mL 分別含0.10 mg、50 μg、0.15 mg、20 μg、50 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取柴胡藥材粉末（過(guò)3 號(hào)篩），約1.0 g，精密稱(chēng)定，加80%甲醇25 mL，稱(chēng)重，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，取出，放冷，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取柴胡藥材（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次。以柴胡皂苷d（13 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取柴胡藥材（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液。進(jìn)樣檢測(cè)。以柴胡皂苷d（13 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取柴胡藥材（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、20、30、48 h 進(jìn)樣檢測(cè)。以柴胡皂苷d（13 號(hào)峰）的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算22 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各共有峰的相對(duì)峰面積RSD均小于5.0%，相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于1.0%，表明室溫放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 柴胡指紋樣品圖譜的建立

取16 批不同產(chǎn)地的北柴胡藥材，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)。將指紋圖譜依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012.0 版本）中，以S1 為參考圖譜，手動(dòng)匹配16 批指紋圖譜，見(jiàn)圖1，根據(jù)匹配結(jié)果確定22 個(gè)共有峰，并生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了其中的5 個(gè)峰，其中13 號(hào)峰（柴胡皂苷d）峰形好，峰面積穩(wěn)定，分離度較好，選定為指紋圖譜的參照峰（S），見(jiàn)圖3。

圖1 16 批北柴胡藥材的指紋圖譜Fig 1 Fingerprints for 16 batches of Bupleurum chinense

圖2 北柴胡藥材對(duì)照指紋圖譜Fig 2 Reference fingerprint of Bupleurum chinense

圖3 空白溶劑（A）、對(duì)照品（B）和樣品（C）的色譜圖Fig 3 Reference chromatogram of blank solvent（A），control（B）and sample（C）

2.6 化學(xué)模式識(shí)別分析

2.6.1 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》計(jì)算16 批北柴胡藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表1。16 批北柴胡藥材與對(duì)照指紋圖譜的相似度均大于0.90，除樣品S8 和S9 外（產(chǎn)地均為陜西），其他14 批樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度在0.919～0.991，可見(jiàn)不同產(chǎn)地的柴胡藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

表1 16 批北柴胡樣品相似度結(jié)果Tab 1 Similarity evaluation of 16 batches of Bupleurum chinense

2.6.2 CA 將16 批樣品的22 個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 軟件進(jìn)行CA，采用組間連接法結(jié)合歐氏距離的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，16 批柴胡藥材大致可以被分成兩大類(lèi)（山西一類(lèi)，陜西、河北和甘肅為一類(lèi)），其中陜西、河北和甘肅3 個(gè)產(chǎn)地的藥材中陜西的藥材可以單獨(dú)分成一小類(lèi)，甘肅和河北的藥材沒(méi)有明顯區(qū)分。不同產(chǎn)地的北柴胡藥材雖然相似度較高，但不同產(chǎn)地的北柴胡藥材化學(xué)成分仍存在一定差異，從熱圖可知，22 個(gè)指紋特征峰在不同柴胡藥材中存在一定差異（見(jiàn)圖5）。

圖4 16 批北柴胡藥材的聚類(lèi)分析Fig 4 Cluster analysis based on 16 batches Bupleurum chinense

圖5 16 批北柴胡藥材的22 個(gè)指紋特征峰熱圖Fig 5 Heat-map of 22 comment peaks in 16 batches Bupleurum chinense

2.6.3 PCA、PLS-DA 為尋找不同產(chǎn)地柴胡的質(zhì)量差異成分，將16 批北柴胡樣品的22 個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA-P14.1 軟件進(jìn)行PCA，得到PCA 得分圖，再進(jìn)行監(jiān)督模式識(shí)別方法PLSDA 建模分析，獲得相應(yīng)的模型[22-24]，如圖6所示。4 個(gè)產(chǎn)地的16 批北柴胡藥材聚類(lèi)趨勢(shì)明顯，可以分為三類(lèi)，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7分為一類(lèi)（產(chǎn)地均為山西）、S8、S9、S10 分為一類(lèi)（產(chǎn)地均為陜西）、其余樣品分為一類(lèi)（產(chǎn)地為甘肅和河北），與聚類(lèi)分析結(jié)果基本一致。

圖6 16 批北柴胡藥材的PCA（A）和OPLS-DA（B）得分圖Fig 6 PCA（A）and OPLS-DA（B）scores plots from principle components analysis of Bupleurum chinense

為進(jìn)一步說(shuō)明各個(gè)共有峰變量差異大小，采用變量重要性投影（VIP）法篩選導(dǎo)致樣品分類(lèi)差異較大的成分，各成分的VIP 值見(jiàn)圖7。VIP是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP 值越高，對(duì)組間差異的影響越大。以VIP ＞1 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對(duì)樣品分類(lèi)起關(guān)鍵性作用的9 個(gè)成分，按照VIP 大小依次為色譜峰6（柴胡皂苷c）、色譜峰16、色譜峰3、色譜峰18、色譜峰14、色譜峰7（柴胡皂苷f(shuō)）、色譜峰8（柴胡皂苷a）、色譜峰1、色譜峰5，這些成分初步擬訂為不同產(chǎn)地柴胡藥材質(zhì)量差異的主要化學(xué)標(biāo)志物。

圖7 北柴胡PLS-DA 的VIP 值Fig 7 PLS-DA VIP value diagram of Bupleurum chinense

3 討論

建立藥材系統(tǒng)、全面的指紋圖譜是進(jìn)行藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效辦法之一[25-26]。本研究建立了基于HPLC-CAD 的柴胡指紋圖譜方法，對(duì)收集于具有代表性地域的北柴胡藥材進(jìn)行全面成分表征及質(zhì)量評(píng)價(jià)，能夠表征出柴胡藥材更加全面的色譜峰信息，特別是具有弱紫外吸收的皂苷類(lèi)成分在CAD 檢測(cè)器下得到了良好的檢測(cè)和分離。近年來(lái)，CAD 檢測(cè)器因其自身特點(diǎn)，在中藥皂苷類(lèi)檢測(cè)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)而被廣泛使用[27-29]。

本研究采用指紋圖譜結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、CA、PCA 和PLS-DA 等多元統(tǒng)計(jì)分析方法，對(duì)不同產(chǎn)地的柴胡藥材進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，結(jié)果具有良好的一致性，說(shuō)明此方法能夠?qū)λ幉馁|(zhì)量進(jìn)行全面反映，可以用作中藥整體質(zhì)量控制的有效方法[24]。

北柴胡藥材之間的相似度較高，但不同產(chǎn)地的北柴胡藥材在成分含量上仍存在差異[30-31]。本研究建立的HPLC-CAD 指紋圖譜結(jié)合PCA 分析表明不同產(chǎn)地北柴胡藥材化學(xué)成分存在差異，同時(shí)利用PLS-DA 分析篩選出造成不同產(chǎn)地北柴胡差異性的9 個(gè)成分，其中包括2020年版《中國(guó)藥典》一部項(xiàng)下柴胡藥材的含量檢測(cè)指標(biāo)柴胡皂苷a。后續(xù)還需對(duì)不同產(chǎn)地北柴胡藥材成分含量差異進(jìn)行更深入的研究，以期為北柴胡的質(zhì)量控制以及資源利用提供依據(jù)。

綜上所述，本文建立了一種簡(jiǎn)便、高效的HPLC-CAD 指紋圖譜方法，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可用于北柴胡藥材差異分析及質(zhì)量評(píng)價(jià)。所建立的HPLC-CAD 指紋圖譜可全面科學(xué)地為北柴胡藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系建立提供參考。