吳茱萸堿通過(guò)Stat3信號(hào)通路增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的輻射敏感性

王桂華，王妮拉，陽(yáng)帆帆，宋穎輝，柴琴*（.南華大學(xué)附屬長(zhǎng)沙中心醫(yī)院，長(zhǎng)沙 40004；.福州肺科醫(yī)院，福州 50008；.湖南省人民醫(yī)院，長(zhǎng)沙 40000）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma） 主要見(jiàn)于北非、中東和亞洲，尤其是我國(guó)的華南地區(qū)[1]。在臨床上，大多數(shù)鼻咽癌都是低分化鱗狀細(xì)胞癌或未分化癌[2]。鼻咽癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且鼻咽部結(jié)構(gòu)復(fù)雜難以手術(shù)，因此化學(xué)治療和放射治療已成為鼻咽癌治療的主要方法，且放射治療是首選[3]。近年來(lái)隨著免疫治療的出現(xiàn)和發(fā)展，其逐漸成為復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的一種可選治療手段。此外，放射治療已經(jīng)被證實(shí)能通過(guò)DNA 損傷和旁路效應(yīng)激活免疫系統(tǒng)，從而提高免疫治療療效[4-5]。放射治療可以單獨(dú)應(yīng)用、聯(lián)合化療、聯(lián)合靶向治療以及聯(lián)合免疫治療等手段抗腫瘤，表明放射治療在鼻咽癌的治療中起著至關(guān)重要的作用。雖然放射治療技術(shù)在最近幾年得到了極大的改善，特別是調(diào)強(qiáng)放射治療（intensity-modulated radiation therapy，IMRT）技術(shù)的應(yīng)用[6]，但仍然存在一定的瓶頸，腫瘤細(xì)胞的輻射抗性是造成鼻咽癌局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的主要原因[7]。因此，迫切需要探索提高放射治療敏感性的新藥物，從而提高患者的生存期。

引起鼻咽癌輻射抗性的機(jī)制非常復(fù)雜，其中最主要的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的異常激活。已證實(shí)Stat3 信號(hào)通路的持續(xù)激活涉及腫瘤促進(jìn)活動(dòng)中的細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成、宿主免疫逃避和對(duì)細(xì)胞凋亡的抵抗[8-9]。Stat3被持續(xù)激活并在鼻咽癌細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)[10]。最近，有報(bào)道稱Stat3 抑制劑Stattic 增強(qiáng)了鼻咽癌的輻射敏感性[11]。Stat3 抑制劑似乎是鼻咽癌細(xì)胞輻射敏感性的一種重要靶向抑制劑。

吳茱萸堿（evodiamine，EVO）是從蕓香科植物吳茱萸中提取出的活性生物堿，具有多重藥理作用，包括抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛、抗過(guò)敏等[12]。同時(shí)，EVO 具有抗前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤和結(jié)腸癌等活性[13]。然而，EVO 在鼻咽癌中對(duì)輻射敏感性的影響和潛在機(jī)制仍不清楚。本研究以鼻咽癌細(xì)胞5-8F 和6-10B 為對(duì)象，探討EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的輻射敏感性影響及其作用機(jī)制，從而為鼻咽癌放射治療提供新的增敏藥物。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

鼻咽癌細(xì)胞系5-8F 和6-10B 從湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)獲得[14]。鼻咽癌細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS）的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所有培養(yǎng)基均添加100 U·mL－1青霉素/鏈霉素，細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試藥

EVO（上海愛(ài)必信生物科技有限公司），CCK-8 試劑盒（日本熊本同仁化學(xué)研究所），AnnexinV/FITC 檢測(cè)試劑盒（北京佳美生物科技有限公司）。

1.3 細(xì)胞照射

細(xì)胞按分組在6 MV X 線（Varian Accelerator 600 C）室溫下在0～8 Gy 內(nèi)分別照射，受照射的細(xì)胞與其他實(shí)驗(yàn)組平行運(yùn)輸，劑量率：250 MU·min－1，照射射野：15 cm×15 cm，源皮距：100 cm。所有平板在再次照射時(shí)均涂上一層補(bǔ)償膠。

1.4 CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞增殖

將指數(shù)生長(zhǎng)期收集的鼻咽癌細(xì)胞接種在96孔板中，每孔密度為5000 個(gè)細(xì)胞，分為對(duì)照組（0.1%DMSO）或EVO 組（不同濃度），每組設(shè)置5 個(gè)孔。EVO 組用EVO 處理細(xì)胞24 h、48 h 或72 h 每孔加入10 μL CCK-8 試劑，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀在450 nm 處測(cè)量吸光度（A）值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率

將細(xì)胞重新計(jì)數(shù)、接種到6 孔板上，密度為每孔500 個(gè)細(xì)胞，加2 mL 培養(yǎng)基培養(yǎng)，待培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行分組，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、EVO 組（5 μmol·L－1）、照射組（2、4、6、8 Gy）以及EVO 聯(lián)合照射組。培養(yǎng)48 h 后棄去培養(yǎng)基，加入不含藥物的新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12 d 后，用甲醇固定細(xì)胞、Giemsa 染色，計(jì)算細(xì)胞數(shù)超過(guò)50 個(gè)的集落視為克隆存活。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡

對(duì)照組、EVO 組（5 μmol·L－1）、照射組（6 Gy）及EVO 聯(lián)合照射組培養(yǎng)24 h 后，收集并固定在70%乙醇中，4 ℃保存24 h。移去固定液后，細(xì)胞用含5 μmol·L－1PI 和50 μmol·L－1RNase 溶液（Sigma Aldrich 試劑）染色，在室溫條件下避光固定30 min。然后使用FACSuite 分析軟件（BD 生物科學(xué)）對(duì)細(xì)胞周期分布進(jìn)行精確分析，對(duì)細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和比較。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。細(xì)胞分組及處理方法同前，然后用0.25%胰蛋白酶消化、收集，冰PBS 洗滌2 次，用300 μL Binding Buffer 重懸，加入5 μL Annexin-V 和5 μL PI 避光染色15 min，在上機(jī)分析前加入200 μL Binding Buffer 重懸，使用FACSuite 分析軟件對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧

使用活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞ROS 水平，使用FACSuite分析軟件分析ROS 水平，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.8 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)程度

首先加入細(xì)胞裂解液提取所有細(xì)胞蛋白，然后使用Micro BCA 蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，將總蛋白質(zhì)（20 μg）上樣到每個(gè)樣孔中。使用以下抗體和稀釋液用作上樣對(duì)照：抗stat3 抗體（1∶1000）、抗磷酸化stat3 抗體（1∶1000），抗GAPDH 抗體（1∶2000）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組數(shù)據(jù)均經(jīng)過(guò)3 次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)后得出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。采用單因素方差分析對(duì)各組之間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性檢驗(yàn)，P≤0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖表使用GraphPad Prism 5 軟件生成，放射生物學(xué)參數(shù)用Sigmaplot 10.0 軟件線性二次方程計(jì)算模型，輻療增敏比（SER）D0/Dq由照射的細(xì)胞與EVO 聯(lián)合照射的細(xì)胞計(jì)算得出。

2 結(jié)果

2.1 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用

用不同濃度的EVO（0～20 μmol·L－1）處理5-8F 和6-10B 細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48 和72 h，用CCK-8 測(cè)定細(xì)胞活力，結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，該藥物對(duì)5-8F 和6-10B 細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，且呈時(shí)間依賴性。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)，EVO 濃度為5 μmol·L－1、培養(yǎng)48 h 的細(xì)胞更接近IC20值，選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證EVO對(duì)鼻咽癌細(xì)胞輻射敏感性的影響和機(jī)制。5-8F 細(xì)胞24、48、72 h 的IC50值分別為（49.648±8.394）、（9.378±2.569）、（5.297±1.476）μmol·L－1；6-10B細(xì)胞24、48、72 h 的IC50值分別為（73.667±10.285）、（15.289±3.648）、（7.676±2.574）μmol·L－1。

圖1 不同濃度EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的抑制率Fig 1 Inhibitory rate of different concentrations of EVO on NPC cells

2.2 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞輻射敏感性的影響

與對(duì)照組相比，5-8F 細(xì)胞照射組的存活率有所下降（見(jiàn)圖2A）。此外，在該細(xì)胞系中，EVO 聯(lián)合照射組較照射組細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.05）。在6-10B 細(xì)胞系也顯示出同樣的下降趨勢(shì)（見(jiàn)圖2B）。這些結(jié)果表明，EVO 可以增強(qiáng)對(duì)照射引起的細(xì)胞克隆形成的抑制作用，導(dǎo)致5-8F 和6-10B 細(xì)胞的輻射敏感性增加。5 μmol·L－1EVO 在5-8F 和6-10B 細(xì)胞上的D0計(jì)算的SER 分別為1.24 和1.35，5 μmol·L－1EVO在5-8F 和6-10B 細(xì)胞上的Dq計(jì)算的SER 分別為2.26 和1.60。

圖2 不同照射劑量對(duì)鼻咽癌細(xì)胞存活率的影響Fig 2 Effect of different irradiation doses on the survival rate of NPC cells

2.3 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期分布的影響

一般認(rèn)為細(xì)胞周期分布會(huì)影響細(xì)胞的輻射敏感性，而G2/M 期是對(duì)照射最敏感的細(xì)胞周期[15]。PI染色結(jié)果表明，與照射組相比，EVO 可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞抑制在G2/M 期、EVO 聯(lián)合照射可能會(huì)將更多鼻咽癌細(xì)胞阻滯在G2/M 期（P＜0.05）（見(jiàn)圖3）。

圖3 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞周期分布的影響（*P＜0.05）Fig 3 Effect of EVO on the distribution of NPC cell cycle（*P＜0.05）

2.4 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡是照射后引起細(xì)胞死亡的主要形式，暴露于照射后的細(xì)胞凋亡是評(píng)估輻射敏感性的重要指標(biāo)[16]。PI/FITC-Annexin V 染色對(duì)細(xì)胞凋亡的分析表明，與EVO 組及照射組相比，EVO 可誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡，而EVO 聯(lián)合照射可誘導(dǎo)更多細(xì)胞凋亡（P＜0.05）（見(jiàn)圖4）。

圖4 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞凋亡的影響（*P＜0.05）Fig 4 Effect of EVO on apoptosis of NPC cells（*P＜0.05）

2.5 EVO 對(duì)鼻咽癌細(xì)胞ROS 水平的影響

照射通過(guò)誘導(dǎo)ROS 激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]，ROS 的量可以部分反映照射引起的細(xì)胞死亡程度。ROS 水平檢測(cè)顯示EVO 可以增加ROS 的產(chǎn)生，EVO 聯(lián)合照射較EVO 組或照射組增加更多的ROS 產(chǎn)生（P＜0.05）（見(jiàn)圖5）。這些結(jié)果表明EVO 和照射對(duì)ROS 的產(chǎn)生具有協(xié)同作用。

圖5 EVO 增強(qiáng)X 線照射誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞ROS 的表達(dá)水平（*P＜0.05）Fig 5 EVO enhances the expression level of ROS in NPC cells induced by X-ray irradiation（*P＜0.05）

2.6 EVO 對(duì)X 線照射后Stast3 的活化程度的影響

采用Western blot 分析EVO 聯(lián)合照射后鼻咽癌細(xì)胞信號(hào)通路分子的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Stat3 在24 h 后被單劑量6 Gy 照射激活。EVO 可以下調(diào)5-8F 細(xì)胞和6-10B 細(xì)胞中的磷酸化-Stat3 的表達(dá)。此外，EVO 可以降低鼻咽癌細(xì)胞中X 線照射后Stat3 的活化程度（見(jiàn)圖6）。

圖6 X 線照射后鼻咽癌細(xì)胞Stast3 的活化程度（*P＜0.05）Fig 6 Activation of Stat3 in NPC cells after X-ray irradiation（*P＜0.05）

3 討論

輻射抗性是晚期鼻咽癌預(yù)后不良的主要原因[2]，輻射增敏劑已被廣泛探索以證明其在臨床鼻咽癌中的應(yīng)用價(jià)值。在本研究中，EVO 可抑制5-8F 和6-10B 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，EVO 增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的輻射敏感性。

評(píng)估細(xì)胞存活最可靠方法之一是克隆集落形成實(shí)驗(yàn)，這是檢測(cè)輻射敏感性的金標(biāo)準(zhǔn)[17]。本研究顯示，EVO 聯(lián)合照射組較照射組的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)顯著降低，因此，EVO 可能會(huì)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有輻射增敏作用。多項(xiàng)研究表明EVO 可以增強(qiáng)各種腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性[18-19]。EVO 通過(guò)下調(diào)Her-2/AKT/Bcl-2 信號(hào)增強(qiáng)食管鱗狀細(xì)胞癌Eca-109 細(xì)胞和胃癌BGC-823 細(xì)胞的輻射敏感性[20]，這表明EVO 的放射增敏作用可能在許多類(lèi)型的癌癥中普遍存在，其在包括鼻咽癌在內(nèi)的癌癥中的機(jī)制值得廣泛研究。腫瘤輻射敏感性與許多因素有關(guān)，包括腫瘤微環(huán)境、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控和DNA 修復(fù)功能障礙[21]。細(xì)胞凋亡是照射后細(xì)胞死亡的重要機(jī)制，并且凋亡與腫瘤輻射敏感性成顯著正相關(guān)[16]。本研究中，EVO 聯(lián)合照射組細(xì)胞的凋亡率較單純照射組顯著增加，說(shuō)明其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞具有潛在的放射增敏作用，具體相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。G2/M 期細(xì)胞對(duì)放射最敏感，而S 期細(xì)胞則具有放射抗性[15]。本研究表明，小劑量單獨(dú)照射可以誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)入G2/M 期，且EVO 聯(lián)合照射可誘導(dǎo)更多鼻咽癌細(xì)胞阻滯于G2/M 期，這可能是另一個(gè)潛在放射增敏作用機(jī)制。此外，ROS 也是公認(rèn)的輻射敏感性指標(biāo)。一般認(rèn)為，照射誘導(dǎo)的ROS 的產(chǎn)生與照射后細(xì)胞的損傷直接相關(guān)[22]。關(guān)于EVO 與ROS 的關(guān)系的研究較多，但EVO 是增加還是減少ROS，目前還沒(méi)有一致的結(jié)論[23-24]。在本研究中，與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用EVO 可以顯著增加ROS 的產(chǎn)生，與照射組或EVO 組相比，EVO 預(yù)處理后照射組使鼻咽癌細(xì)胞ROS 的產(chǎn)生顯著增加。

值得注意的是，照射后會(huì)觸發(fā)一系列促生存信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞輻射抗性。以往的研究已明確了照射可以激活肺癌細(xì)胞中的NF-κB 和P38/MAPK 信號(hào)通路[25]。此外，我們?cè)诒茄拾┘?xì)胞中發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的現(xiàn)象，即P-Stat3 在照射后表達(dá)上調(diào)。有大量研究表明EVO 可以減少Stat3 的激活[26-27]，因此，本研究探討了EVO 聯(lián)合照射治療是否可以減少照射對(duì)信號(hào)通路的激活，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用EVO 可以顯著降低P-Stat3 的表達(dá)，聯(lián)合照射可以抵消照射對(duì)Stat3 的激活，這與其他研究一致。推測(cè)EVO 可能通過(guò)減少照射后促生存信號(hào)通路的激活來(lái)發(fā)揮放射增敏作用。

總之，EVO 可抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G2/M 期，且EVO 增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的輻射敏感性?；诒狙芯康陌l(fā)現(xiàn)，EVO 有望開(kāi)發(fā)成為放射增敏劑的重要藥物之一。但本研究仍存在不足之處，具體EVO 的放射增敏機(jī)制還有待進(jìn)一步探討，包括其相關(guān)分子機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)通路等。