重樓皂苷抗肺癌作用機制的研究進展

何娜，楊洋，朱婧，張靜媚，陳琴華，楊光義（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第七臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳 518000；.深圳市寶安純中醫(yī)治療醫(yī)院，廣東 深圳 51810）

重樓是百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara 的干燥根莖，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的功效，為中醫(yī)臨床常用的抗肺癌中藥[1]。重樓皂苷為重樓的主要活性成分，具有抗腫瘤、止血、鎮(zhèn)靜止痛、抗菌、抗炎等多種藥理作用，對肺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤均具有抑制效應(yīng)。國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)表明，在所有惡性腫瘤中，肺癌的病死率位居第一，5年生存率僅為30%～60%[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療以及新興的免疫治療和靶向治療，均存在著細胞耐藥及毒性等局限性，新的肺癌治療方案亟待開發(fā)。中醫(yī)藥治療因其辨證論治的獨特理念及天然低毒等優(yōu)勢，已成為肺癌綜合治療中的重要組分。研究表明，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、H，纖細薯蕷皂苷，17-羥基纖細薯蕷皂苷以及重樓總皂苷等（見圖1）均具有抑制肺癌作用[3]。目前尚無關(guān)于重樓皂苷抗肺癌作用機制的系統(tǒng)綜述，鑒于此，本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于重樓皂苷抗肺癌作用及其作用機制方面的相關(guān)研究，以期為臨床更好地利用重樓皂苷治療肺癌，以及抗肺癌新藥的研發(fā)提供理論支持。

圖1 常見的抗肺癌重樓皂苷結(jié)構(gòu)式Fig 1 Common structural formula of polyphyllin with anti-lung cancer effect

1 重樓皂苷抗肺癌作用機制

1.1 抑制腫瘤細胞增殖

重樓皂苷可將不同的腫瘤細胞阻滯在不同的細胞周期，進而抑制腫瘤細胞的增殖。細胞周期蛋白B1（Cyclin B1）是控制G2/M 檢查點的關(guān)鍵因子[4]，腫瘤抑制基因P53能夠調(diào)控細胞周期阻滯、DNA 損傷和細胞凋亡[5]。Lin 等[6]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅵ和Ⅶ能夠顯著抑制肺癌A549 細胞和H1299 細胞的生長，將并細胞周期阻滯在G2/M 期，其機制可能與上調(diào)腫瘤抑制受體P53，死亡受體DR3、DR5、Fas，cleaved PARP，cleaved caspase-3 的表達水平，下調(diào)Cyclin B1 的表達水平有關(guān)。Liu 等[7]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠?qū)⒎伟┘毎募毎芷谧铚贕2/M 期，其作用與下調(diào)Ki-67、PCNA、Cyclin B1、Cyclin D1 的mRNA 及蛋白的表達水平，上調(diào)P15 和P21 的表達水平，提高活性氧（ROS）的水平有關(guān)。同時，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的情況下，重樓皂苷Ⅰ還能夠保護C/EBPt同源蛋白（CHOP）免受GRP78 誘導(dǎo)的泛素化和降解，進而促進細胞死亡。zeste基因增強子同源物2（EZH2）的過表達能促使腫瘤發(fā)生，推動腫瘤的惡性進展[8]。重樓皂苷Ⅰ還能將肺癌細胞系PC-9 細胞的細胞周期阻滯在G0/G1期，其機制可能為重樓皂苷Ⅰ通過促進SAPK/JNK 的磷酸化，下調(diào)P65、DNMT1 的蛋白表達來實現(xiàn)對EZH2的抑制作用，進而抑制非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的生長并誘導(dǎo)細胞周期阻滯[9]。HOTAIR 是一種長鏈非編碼RNA，在各種類型腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著驅(qū)動作用[10]，c-Jun 是第一個發(fā)現(xiàn)的純致癌因子[11]。重樓皂苷Ⅰ作用于PC9、H1650細胞后，通過上調(diào)c-Jun 蛋白的表達，下調(diào)HOTAIR 的表達，從而誘導(dǎo)P21 蛋白的表達，抑制NSCLC 細胞的生長。HOTAIR、c-Jun 和p21調(diào)節(jié)軸之間的相互作用在重樓皂苷Ⅰ的整體抗肺癌作用中趨于一致[12]。郭慧敏等[13]將重樓皂苷Ⅱ與喜樹堿聯(lián)用于H460 細胞、H446 細胞，發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)用能夠協(xié)同激活p38 MAPK 信號通路，抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡。

重樓皂苷主要通過下調(diào)細胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1 的表達來實現(xiàn)對肺癌細胞的周期阻滯。同時，重樓皂苷還能夠通過下調(diào)增殖相關(guān)抗原Ki-67、PCNA、P65、DNMT1、HOTAIR、EZH2的表達；上調(diào)P53、P15、P21、DR3、DR5、Fas、cleaved caspase-3、cleaved PARP、c-Jun 的表達；激活SAPK/JNK、P38 MAPK 通路；增加細胞內(nèi)ROS含量；保護CHOP 等途徑抑制細胞生長，促進細胞死亡。

1.2 誘導(dǎo)腫瘤細胞程序性死亡

細胞程序性死亡的表現(xiàn)形式包括細胞凋亡、細胞焦亡、細胞自噬等，誘導(dǎo)細胞程序性死亡是抗腫瘤的主要手段之一。Nlrp3 炎癥小體的激活和Gsdmd 的裂解是細胞焦亡的兩個核心步驟[14]。Teng 等[15]研究發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅵ能夠激活ROS/NF-κB/Nlrp3/Gsdmd 信號軸，引發(fā)caspase-1 介導(dǎo)的細胞焦亡，最終導(dǎo)致A549 細胞和H1299 細胞死亡。Li 等[16]的研究表明，EZH2 的過度表達顯著增加A549 細胞和NCI-358 細胞中Bcl-2、CDK2 和Cyclin A2 的表達，減少Bax、cleaved caspase-3 的表達，從而促使腫瘤發(fā)生，而重樓皂苷Ⅰ能通過調(diào)節(jié)STAT3/HOTAIR 軸抑制EZH2 的表達，逆轉(zhuǎn)EZH2 的影響。另有研究發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅰ與AMPK 具有良好親和力，可直接結(jié)合AMPK 上的變構(gòu)藥物和代謝物的結(jié)合位點并形成氫鍵，降低mTORC1 復(fù)合物及其靶標的磷酸化水平，可能通過直接靶向激活A(yù)MPK 來誘導(dǎo)NSCLC 細胞發(fā)生自噬，進而抑制NSCLC 細胞生長和增殖[17]。PI3K/Akt 信號通路是調(diào)控細胞生長、遷移、增殖和代謝的重要通路[18]，NF-κB 可通過對其他靶基因的調(diào)控作用抑制細胞凋亡、促使腫瘤發(fā)生[19]。在A549 細胞中，重樓皂苷Ⅶ可通過PI3K/Akt 軸介導(dǎo)的對NF-κB p56 的抑制作用導(dǎo)致線粒體功能障礙，誘導(dǎo)A549 細胞凋亡[20]。王青等[21]發(fā)現(xiàn)重樓總皂苷能夠以劑量依賴的方式抑制A549 細胞的生長，誘導(dǎo)細胞凋亡，其作用機制可能與上調(diào)caspase-3 的表達，下調(diào)Bcl-2 的表達有關(guān)。而游麗嬌等[22]將不同濃度的重樓皂苷Ⅱ作用于A549 細胞48 h，發(fā)現(xiàn)其能夠降低A549 細胞的存活率，機制可能為重樓皂苷Ⅱ降低細胞線粒體膜電位（MMP），提高細胞內(nèi)Ca2＋水平，增加細胞內(nèi)ROS 含量，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 表達，促進A549 細胞凋亡。

大多數(shù)重樓皂苷均可誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡，其中重樓皂苷Ⅵ兼可誘導(dǎo)細胞焦亡，重樓皂苷Ⅰ兼可誘導(dǎo)細胞自噬。重樓皂苷誘導(dǎo)細胞程序性死亡的機制主要為調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達，同時ROS 含量、STAT3/HOTAIR 通路、PI3K/Akt/NF-κB 通路以及MMP 亦與其誘導(dǎo)作用密切相關(guān)。

1.3 逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性

重樓皂苷Ⅰ和Ⅶ可增強耐順鉑細胞系A(chǔ)549/DDP 細胞對順鉑的敏感性，其機制為重樓皂苷Ⅰ和Ⅶ增加P53 和Bax 的表達，減少Bcl-2 的表達，導(dǎo)致PARP 和caspase-3 激活，最終引發(fā)細胞凋亡。此外，重樓皂苷Ⅰ、Ⅶ與順鉑聯(lián)用后，能夠增強順鉑對CIP2A 及其下游Akt/mTOR 信號級聯(lián)的抑制作用，進而逆轉(zhuǎn)A549/DDP 細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[23]。重樓皂苷Ⅱ可通過抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，提高耐藥PC-9 細胞對吉非替尼的敏感性[24]。

在重樓皂苷的耐藥性逆轉(zhuǎn)研究中，重樓皂苷Ⅰ的研究最廣泛。與厄洛替尼聯(lián)用，重樓皂苷Ⅰ可通過抑制IL-6/STAT3 信號通路，逆轉(zhuǎn)厄洛替尼耐藥肺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進而逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對厄洛替尼的EMT 相關(guān)耐藥性[25]；與吉非替尼聯(lián)用，重樓皂苷Ⅰ可通過調(diào)控MALAT1/STAT3 信號通路，減少MALAT1 表達，誘導(dǎo)STAT3 磷酸化，進而抑制吉非替尼耐藥的PC-9ZD 細胞的生長，并誘導(dǎo)其凋亡[26]；與帕博西尼聯(lián)用，重樓皂苷Ⅰ能夠通過調(diào)控P21/CDK2/Rb 信號通路，上調(diào)P21，干擾CDK2 功能，進而抑制NSCLC 細胞的視網(wǎng)膜母細胞瘤腫瘤抑制蛋白Rb，逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對帕博西尼的耐藥性[27]；與奧希替尼聯(lián)用，重樓皂苷Ⅰ可通過抑制PI3K/Akt通路并上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Fas、cleaved caspase-3、cleaved PARP 的表達，在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)耐藥細胞系PC-9/OR、H1975/OR 對奧希替尼的耐藥性[28]。

重樓皂苷可作為多種化療藥物的增敏劑。重樓皂苷Ⅰ可調(diào)控IL-6/STAT3、MALAT1/STAT3、P21/CDK/Rb、PI3K/Akt、CIP2A/Akt/mTOR 信號通路，重樓皂苷Ⅱ可調(diào)控PI3K/Akt/mTOR 信號通路，重樓皂苷Ⅶ可調(diào)控CIP2A/Akt/mTOR 信號通路，進而逆轉(zhuǎn)肺癌細胞對化療藥物的耐藥性。值得注意的是，PI3K/Akt 信號通路為重樓皂苷發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥性作用的關(guān)鍵通路。

1.4 抗腫瘤細胞遷徙、侵襲

S100A8 在NSCLC 患者腫瘤組織中高表達，且其可能參與免疫抑制，促進腫瘤細胞逃逸[29]。羅斌等[30]將重樓皂苷Ⅶ給藥于C57BL/B 小鼠皮下移植瘤模型，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅶ能夠降低肺臟模型中髓源性抑制細胞MDSCs 分泌的吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO）含量以及S100A8 的表達，提示其可能通過影響MDSCs 的免疫抑制作用，進而抑制轉(zhuǎn)移前微環(huán)境（PMN）形成，預(yù)防腫瘤肺轉(zhuǎn)移，但具體機制仍待進一步研究?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類細胞外基質(zhì)降解酶，參與腫瘤細胞生長、遷移、侵襲、腫瘤血管新生等過程[31]。重樓皂苷Ⅰ能夠劑量依賴性地抑制A549細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其機制可能與降低MMP-9的表達[32]，或上調(diào)E-cad 的表達有關(guān)[33]，且重樓皂苷Ⅰ聯(lián)合順鉑對誘導(dǎo)人肺腺癌細胞凋亡及降低其遷徙轉(zhuǎn)移有協(xié)同作用[34]。何昊等[35]的研究進一步發(fā)現(xiàn)，重樓皂苷Ⅶ作用于H460 細胞后，能夠顯著下調(diào)MMP-2 和MMP-9 的表達，同時，上調(diào)cleaved caspase-3、Bax 表達，下調(diào)ICAD、Bcl-2 表達，表明重樓皂苷Ⅶ在體外可能通過調(diào)節(jié)MMPs 抑制H460 細胞的遷移和侵襲，促使凋亡發(fā)生。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是最具代表性的促血管生長因子，能刺激血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移、侵襲，增加血管通透性[36]。重樓皂苷Ⅰ在缺氧條件下能抑制VEGF 的表達[37]。鄧日強等[38]將重樓皂苷Ⅲ和順鉑聯(lián)用于小鼠肺癌皮下移植瘤，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅲ可通過下調(diào)VEGF 的表達，減慢新生腫瘤的生成速度，抑制肺癌生長及轉(zhuǎn)移。而王青等[39]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ能夠劑量依賴性地誘導(dǎo)肺循環(huán)腫瘤細胞CTC 凋亡，將CTC 細胞周期阻滯在G0/G1期。這提示重樓皂苷Ⅰ可能通過抑制CTC，進而抑制肺腫瘤的遷移和侵襲，但其分子機制仍有待進一步揭示。

重樓皂苷主要通過影響腫瘤微環(huán)境的形成來抑制肺癌細胞的遷移侵襲，能夠調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、IDO、S100A8、VEGF 以及E-cad 的表達，進而發(fā)揮遷移抑制作用。

1.5 協(xié)同抗腫瘤

協(xié)同用藥即不同藥物通過作用于不同靶點或提高成分溶解度等方式發(fā)揮不對稱作用，達到協(xié)同增效的目的。重樓皂苷的協(xié)同用藥方式主要包括：

① 重樓皂苷與化療手段聯(lián)用：如重樓皂苷Ⅲ與順鉑聯(lián)用后對Lewis 皮下移植肺癌瘤的生長和轉(zhuǎn)移抑制作用增強；順鉑、重樓皂苷Ⅰ聯(lián)合應(yīng)用于A549 細胞，誘導(dǎo)凋亡及抗遷徙作用優(yōu)于兩者單獨應(yīng)用[40]；重樓皂苷Ⅱ與喜樹堿（CPT）聯(lián)合用于H460、H446 細胞系，能夠增加H460、H446的晚期凋亡率，且顯著降低H446 的早期凋亡率。

② 重樓皂苷單體間聯(lián)用：如Formosanin C 和重樓皂苷Ⅱ聯(lián)用后，通過激活Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-8 和cleaved caspase-9，進而觸發(fā)Beclin1 的裂解以抑制Formosanie C 誘導(dǎo)的自噬并促進凋亡，兩者聯(lián)用具有協(xié)同抗腫瘤作用[41]。

③ 重樓皂苷與其他中藥單體聯(lián)用：張麗麗[42]的研究表明，0.125～2 μmol·L－1的重樓皂苷單體Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H 和15 μmol·L－1姜黃素進行非等比聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抗肺癌作用。其中，實驗濃度的重樓皂苷Ⅱ與姜黃素聯(lián)合能夠促進姜黃素的細胞吸收，其機制可能是通過MAPK/PI3K/Akt途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，進而發(fā)揮協(xié)同抗肺癌作用。

腫瘤免疫逃逸是惡性腫瘤的重要特征，重樓皂苷能通過調(diào)節(jié)機體免疫發(fā)揮抗肺癌作用。STING/IRF3 通路可通過上調(diào)Ⅰ型干擾素刺激基因表達來啟動細胞毒性T 細胞，進而發(fā)揮腫瘤抑制作用[43]。重樓皂苷Ⅶ能夠使巨噬細胞轉(zhuǎn)化為STING 控制的M1 型免疫激活巨噬細胞，促進M1 巨噬細胞分泌的促炎細胞因子，招募顆粒酶B＋、CD8＋T 淋巴細胞進行腫瘤內(nèi)浸潤，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫逃逸的作用；同時能夠抑制STAT3激活的巨噬細胞分泌的IL-10 和TGF-β，進而抑制STAT3 激活，以旁分泌方式抑制A549 及LLC 腫瘤細胞的增殖和侵襲。這些過程均依賴于STING 通路，且伴隨PD-L1 升高，提示重樓皂苷Ⅶ還可能有利于免疫檢查點阻斷治療[44]。

2 小結(jié)

綜上所述，重樓皂苷能夠以劑量或時間依賴的方式，通過多種作用機制發(fā)揮抗肺癌作用。需要注意的是，重樓皂苷作用于不同細胞能夠發(fā)揮不同的效應(yīng)，在同一細胞中亦能夠同時產(chǎn)生多種效應(yīng)與機制，如增殖抑制常伴隨著侵襲抑制等；然而目前重樓皂苷的抗肺癌作用機制研究大多將重點放在單個成分作用后產(chǎn)生的某一作用機制或信號通路上，鮮有人探討重樓皂苷在腫瘤細胞中產(chǎn)生不同機制的根本原因。重樓皂苷是否通過作用濃度、作用時間或作用方式等因素產(chǎn)生不同的效應(yīng)，還需要進一步探討。目前大多數(shù)研究并未進行重樓皂苷作用的直接靶點確證，其作用是直接或是間接、作用的具體環(huán)節(jié)等仍有待考量。因缺乏臨床研究，使得單一成分作用于人體后是否能發(fā)揮預(yù)期的作用仍然存疑。因此，筆者認為，在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，利用信息學(xué)手段、蛋白水平靶點確證技術(shù)、基因水平靶點確證技術(shù)等進行藥物直接靶點確證，并進行重樓皂苷的成分群研究、關(guān)聯(lián)機制研究、臨床研究具有重要意義。同時，重樓皂苷具有一定的肝、腎、心血管毒性，且其毒性機制與作用機制存在重合[45]；而大多數(shù)研究均表明重樓皂苷無明顯的肝腎毒性，這提示重樓皂苷量效毒關(guān)系的研究仍存在空缺，有待進一步補充。

相較于化療藥物，重樓皂苷的作用優(yōu)勢在于其能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細胞死亡，而無明顯耐藥性及毒副作用。重樓皂苷可通過誘導(dǎo)細胞凋亡、焦亡、自噬等方式導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，還能夠調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對上述細胞死亡方式具有重要調(diào)控作用且其與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能為重樓皂苷發(fā)揮抗肺癌作用的關(guān)鍵節(jié)點；因此，未來針對于重樓皂苷調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其對下游細胞死亡方式誘導(dǎo)的機制研究對于重樓皂苷的療效闡明及肺癌治療具有重要意義。綜合現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt 通路與STAT3 通路在重樓皂苷抗肺癌的作用機制網(wǎng)絡(luò)中占有關(guān)鍵地位，且兩個通路之間存在串?dāng)_作用，而目前尚無相關(guān)研究；未來或可進一步探討重樓皂苷單體或重樓皂苷成分群作用于肺癌模型后，PI3K/Akt 通路與STAT3 通路之間的串?dāng)_作用以及單體與成分群的作用差異，進一步完善重樓皂苷的抗肺癌作用機制網(wǎng)絡(luò)。