抗栓膠囊中黃曲霉毒素的含量測定及安全性評價

薛平，顧崢嶸，劉旻虹，李莉（常州市食品藥品纖維質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇 常州 213000）

抗栓膠囊由當(dāng)歸尾、水蛭、土鱉蟲、丹參、烏梢蛇、麝香、馬錢子、骨碎補(bǔ)、僵蠶、蜈蚣、延胡索、蟾酥等19 味藥材制成，具有活血化瘀、抗栓通脈之功效；一般用于血栓閉塞性脈管炎瘀血阻絡(luò)證，常用于輔助治療腦血栓、心肌梗死、血栓性靜脈炎等疾病[1-3]。

目前抗栓膠囊的質(zhì)量研究主要是針對當(dāng)歸尾、丹參和甘草等藥材的薄層色譜鑒別及丹參酮ⅡA、士的寧等標(biāo)志成分的含量測定，而安全性探索相對較少[1-3]?？顾z囊中含有土鱉蟲生藥粉末，關(guān)于土鱉蟲黃曲霉毒素超標(biāo)的現(xiàn)象時有報道[4-5]。中藥外源性有害物質(zhì)黃曲霉毒素的檢測和控制是藥品質(zhì)量控制的重中之重[6]，目前該藥仍未進(jìn)行過黃曲霉毒素的安全性評估。

黃曲霉毒素（AFT）是公認(rèn)的超級毒性致癌物，其種類較多，黃曲霉毒素的種類主要有黃曲霉毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）、G2（AFG2）、M1（AFM1）和M2（AFM2）等，其中AFB1毒性最強(qiáng)，中藥制劑主要涉及AFB1、AFB2、AFG1和AFG2[5-7]。本文采用免疫親和柱凈化高效液相色譜柱后衍生熒光法（HPLC-FLD）和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）測定抗栓膠囊中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的殘留量。兩種檢測方法互相驗(yàn)證，排除干擾，在符合《中國藥典》2020年版要求的前提下，完善檢測方法[7]。通過測定抗栓膠囊樣品中黃曲霉毒素的殘留量，為該藥的質(zhì)量控制和監(jiān)管提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20A 高效液相色譜儀、RF-20AXS 熒光檢測器（日本島津有限公司）；光化學(xué)衍生器（美國AURA）；LCMS-8060 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津）；XP504 電子天平（萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；IKA T25 分散機(jī)[艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司]；Thermo Scientific Multifuge X4R Pro 臺式冷凍離心機(jī)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。黃曲霉毒素混合對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：610001-202107：AFB1以 1.08 μg·mL－1計(jì)算；AFB2以 0.33μg·mL－1計(jì)算；AFG1以 1.01 μg·mL－1計(jì)算；AFG2以0.30 μg·mL－1計(jì)算]。4 種不同品牌3 mL規(guī)格的免疫親和柱[廠家分別為VICAM（維康）、ROMER、華安麥科和青島普瑞邦（Pribolab）]，甲醇、乙腈和乙酸銨均為色譜純，水為去離子水，氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀和吐溫20 均為分析純?？顾z囊樣品來自全國20 個省級行政區(qū)，涉及9 家生產(chǎn)企業(yè)（編號A～I(xiàn)），共29批次樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7-10]

2.1.1 HPLC-FLD 色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（16∶16∶68）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：40℃；柱后光化學(xué)衍生法：光化學(xué)衍生器（254 nm）；檢測器：熒光檢測器，激發(fā)波長λex：360 nm，發(fā)射波長λem：450 nm。

2.1.2 LC-MS 色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流動相：10 mmol·L－1醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；流速：0.3 mL·min－1，梯度洗脫（0～4.5 min，65%→15%A；4.5～6 min，15%→0%A；6～6.5 min，0%→65%A；6.6～10 min，65%A）；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子源（ESI）；離子源接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：526℃；DL 管溫度：250 ℃；載氣流速：2 L·min－1；加熱器流量：10 L·min－1；加熱塊溫度：400℃；干燥氣流速：10 L·min－1；采集模式為正離子模式；各化合物監(jiān)測離子對和碰撞電壓（CE）見表1。

表1 監(jiān)測離子對、碰撞電壓Tab 1 Monitor ion pair and collision voltage

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液1 mL，置20 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為對照品儲備液。

HPLC-FLD 對照品溶液：精密量取上述對照儲備液1 mL，置25 mL 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得。

LC-MS 系列對照品溶液：精密量取對照儲備液適量，用70%甲醇稀釋成含AFB2、AFG2質(zhì)量濃度為0.03～0.6 ng·mL－1，含AFB1、AFG1質(zhì)量濃度為0.12～2 ng·mL－1的系列對照品溶液，見表2。

表2 系列混合對照品溶液質(zhì)量濃度(ng·mL－1)Tab 2 Concentration of series mixed reference solution (ng·mL－1)

2.2.2 供試品溶液[7-8]取抗栓膠囊樣品內(nèi)容物粉末約5 g，精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，精密加入70%乙腈溶液75 mL，高速攪拌2 min（11 000 r·min－1），4000 r·min－1離心5 min，精密量取上清液7 mL，置50 mL 量瓶中，用緩沖液（稱取8.0 g 氯化鈉、1.2 g 磷酸氫二鈉、0.2 g 磷酸二氫鉀、0.2 g 氯化鉀，加水990 mL 使溶解，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0，加水稀釋至1000 mL，即可）稀釋至刻度，搖勻，離心10 min，過濾（用玻璃纖維濾紙過濾），精密量取上清液20 mL，通過免疫親和柱，流速3 mL·min－1，用10 mL 含1%吐溫20 的水洗脫，再用20 mL 水洗脫，棄去洗脫液，再用1.5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.3.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD 對照品溶液按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL；陰性樣品（未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供試品溶液各進(jìn)樣20 μL 測定，黃曲霉毒素兩個相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，典型色譜圖見圖1。

圖1 陰性樣品（A）、對照品（B）、供試品（C）的液相熒光色譜圖Fig 1 Liquid phase fluorescence chromatogram of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.3.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液、陰性樣品（未檢出AFB1、AFB2、AFG1和AFG2）和供試品溶液按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL 測定，結(jié)果各峰形良好，響應(yīng)高，試驗(yàn)條件滿足測定要求，典型色譜圖見圖2。

圖2 陰性樣品（A）、對照品（B）、供試品（C）質(zhì)譜MRM 的TIC色譜圖Fig 2 TIC chromatogram of mass spectrometry MRM of negative sample（A），reference（B），and sample（C）

2.4 線性關(guān)系考察

2.4.1 HPLC-FLD 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD 對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X，μL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

2.4.2 LC-MS 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下LC-MS系列對照品溶液進(jìn)樣5 μL，測定峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，ng·mL－1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表3。

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下的HPLC-FLD對照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，結(jié)果峰面積RSD，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為1.2%、0.92%、0.75%和0.59%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 LC-MS 取表2中的3 號對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 針，計(jì)算峰面積RSD，結(jié)果AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積RSD分別為6.9%、4.1%、5.1%和2.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取抗栓膠囊樣品（生產(chǎn)企業(yè)F，批號：200510），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL，LC-MS 進(jìn)樣5 μL，平行操作6 份。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為5.2%、5.3%、4.3%和4.1%；LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量的RSD分別為7.9%、5.9%、6.6%和5.9%，RSD均小于10%，表明本方法重復(fù)性良好，兩種檢測方法均可行。

2.7 檢測限與定量限

2.7.1 HPLC-FLD 取“2.2.1”項(xiàng)下HPLC-FLD對照品溶液稀釋至一定的濃度，在 “2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以信噪比為10∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算定量限，以信噪比為3∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算檢測限，定量限與檢測限均折算到試樣中被測物能被檢測出的量，結(jié)果見表3。

2.7.2 LC-MS 取“2.2.1”項(xiàng)下LC-MS 系列對照品溶液中濃度最低的對照品溶液稀釋至一定的濃度，在 “2.1.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。以信噪比為10∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算定量限，以信噪比為3∶1 時相應(yīng)濃度計(jì)算檢測限，結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系、檢測限和定量限Tab 3 Linear，LOD and LOQ

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取抗栓膠囊樣品（生產(chǎn)企業(yè)F，批號：200510），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。在0、2、4、6、10、12、16、24 h 時分別按“2.1”項(xiàng)下兩種色譜條件進(jìn)行分析，HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL，LC-MS進(jìn)樣5 μL，計(jì)算峰面積RSD。HPLC-FLD 法測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為1.5%、0.83%、0.57%和0.56%；LC-MS 測得AFG2、AFG1、AFB2和AFB1峰面積的RSD分別為4.7%、3.3%、6.0%和2.0%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好，檢測方法可行。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取抗栓膠囊空白樣品（不含黃曲霉毒素）5 g，平行6 份，精密稱定，精密加入對照儲備液0.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液后，分別按“2.1”項(xiàng)下兩種色譜條件進(jìn)行分析，HPLC-FLD進(jìn)樣20 μL，LC-MS 進(jìn)樣5 μL，結(jié)果HPLC-FLD法平均加樣回收率（RSD）分別為AFG291.79%（1.3%）、AFG188.29%（2.1%）、AFB298.48%（1.3%）、AFB198.82%（1.1%）；LC-MS 法平均加樣回收率（RSD）分別為AFG291.31%（5.8%）、AFG192.54%（4.1%）、AFB299.62%（4.4%）、AFB194.03%（2.8%），表明本試驗(yàn)準(zhǔn)確度良好。

2.10 樣品測定

取不同生產(chǎn)企業(yè)的抗栓膠囊樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別采用“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，HPLC-FLD 進(jìn)樣20 μL，LC-MS 進(jìn)樣5 μL，計(jì)算樣品中4 種黃曲霉毒素的含量及其總量，結(jié)果見表4。部分超出線性范圍的供試品溶液稀釋后進(jìn)樣測定。

表4 樣品測定結(jié)果(μg·kg－1)Tab 4 Sample determination results (μg·kg－1)

HPLC-FLD 和LC-MS 兩種方法測定結(jié)果相對一致，其中液相色譜光化學(xué)衍生法HPLC-FLD 成本低，可成為生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制方法的首選?！吨袊幍洹?020年版中將LC-MS 作為黃曲霉毒素測定的驗(yàn)證結(jié)果，故以LC-MS 測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)。AFG2的含量為0～28.946 μg·kg－1，AFG1的含量為0～496.11 μg·kg－1，AFB2的含量為0.029～37.751 μg·kg－1，AFB1的含量為1.115～481.879 μg·kg－1；4種黃曲霉毒素的總量為1.442～1044.686 μg·kg－1。29 批次樣品中黃曲霉毒素檢出率極高，其中AFB1檢出率100%。《中國藥典》2020年版中有關(guān)黃曲霉毒素的規(guī)定均為每1000 g 含AFB1不得過5 μg，AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量不得過10 μg。參考此限度，按藥典的數(shù)據(jù)修約規(guī)則，29 批次樣品其中10 個批次樣品AFB1超過5 μg，且AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg；1 批次樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1的總量超過10 μg。29 批次樣品中黃曲霉毒素的不合格率為38%，其中一批次黃曲霉毒素殘留量遠(yuǎn)超參考限度，安全風(fēng)險相對較高。

3 討論

3.1 測定方法的優(yōu)化

本試驗(yàn)測定方法主要參考《中國藥典》2020年版2351 真菌毒素測定法項(xiàng)下的黃曲霉毒素測定法，同時進(jìn)行了部分優(yōu)化。優(yōu)化原因主要是抗栓膠囊基質(zhì)復(fù)雜，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)對待測成分測定干擾較大。免疫親和柱一般要求過柱的作業(yè)溶液pH 值為中性，抗栓膠囊初始提取液pH 值大約為5.3，整體偏酸性；過柱的作業(yè)溶液要求含甲醇量不超過20%，含乙腈不得過10%。作業(yè)溶液pH 值過低或者過高，含有機(jī)相過高均不利于免疫親和柱吸附黃曲霉毒素。

前期試驗(yàn)考察了提取溶劑70%甲醇、80%甲醇、70%乙腈、80%乙腈和1%甲酸的70%甲醇的提取效果，發(fā)現(xiàn)70%乙腈提取效率最高。

考察測定量和取樣量的影響：取混合好的抗栓膠囊內(nèi)容物各5、10、15 g，比較樣品中待測成分的含量，試驗(yàn)總體結(jié)果表明測定稱樣量為5 g 時，已經(jīng)可以達(dá)到測定要求，但每盒樣品中的內(nèi)容物可能會出現(xiàn)不均勻現(xiàn)象。對比了取樣10、50、100、200 g 的試驗(yàn)結(jié)果，建議每個批次樣品內(nèi)容物取樣量不少于100 g。

選擇市場上常見的4 種不同品牌的免疫親和柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明不同品牌的親和柱對測定影響較小，本試驗(yàn)方法兼容性良好。

3.2 建議與存在的不足

黃曲霉毒素毒性極強(qiáng)，目前大多不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無毒作用劑量，限量越低越好[10]?？顾z囊組方復(fù)雜，組方中有大量的原料藥按《中國藥典》2020年版需要進(jìn)行黃曲霉毒素限量檢查，限量檢查的品種包括土鱉蟲、蜈蚣、水蛭、蜂房、地龍、醋延胡索、制馬錢子（藥材及生馬錢子飲片要求檢驗(yàn)）和麩炒僵蠶（藥材及僵蠶飲片要求檢驗(yàn)）。

部分樣品AFG2、AFG1、AFB2和AFB1含量殘留量極高原因跟生產(chǎn)企業(yè)的風(fēng)險意識不強(qiáng)有關(guān)，客觀原因是此次抽檢的樣品生產(chǎn)日期處于2020年版《中國藥典》換版期間，生產(chǎn)企業(yè)原料藥均按《中國藥典》2015年版檢驗(yàn)，這些高危品種大部分在2015年版藥典均未要求進(jìn)行黃曲霉毒素限量檢查，存在一定的安全監(jiān)控的漏洞。

為分析抗栓膠囊黃曲霉毒素含量過高的原因，對收到的生產(chǎn)企業(yè)B 和企業(yè)E 寄送的部分原料和小樣進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)企業(yè)B 提供的原料蜂房AFG2、AFG1、AFB2和AFB1殘留量較高，嚴(yán)重超過了《中國藥典》2020年版蜂房下的標(biāo)準(zhǔn)限度。遺憾的是未能獲得黃曲霉毒素殘留量較高樣品相對應(yīng)的原料藥，生產(chǎn)企業(yè)寄送的部分原料不具有顯著代表性，抗栓膠囊黃曲霉毒素污染的具體原因仍需進(jìn)一步探究。課題組根據(jù)與相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)溝通、日常相關(guān)飲片檢驗(yàn)的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)[9-12]推測抗栓膠囊黃曲霉毒素污染是上述多種高危原料飲片共同導(dǎo)致的結(jié)果，其中土鱉蟲、醋延胡索和蜂房可能是最主要的源頭，蜈蚣、水蛭、地龍、制馬錢子和麩炒僵蠶可能是次要源頭。

抗栓膠囊主要服用人群為老年人，黃曲霉毒素是中藥外源性有害物質(zhì)量控制的重中之重。基于上述試驗(yàn)結(jié)果，抗栓膠囊存在黃曲霉毒素污染的安全風(fēng)險，課題組已向國家藥品監(jiān)督管理局建議增加抗栓膠囊的黃曲霉毒素限量檢查，加大該藥的安全監(jiān)控；但此藥的安全質(zhì)量更需要相關(guān)企業(yè)加強(qiáng)黃曲霉毒素方面的質(zhì)量控制的意識，嚴(yán)格把控原料的質(zhì)量，保證用藥安全。