趙晨陽,陳昱臻,付曉越,侯芙芳,高友鶴

(北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程藥物及生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國北京 100875)

目前,藥物一致性評(píng)價(jià)采用的是化學(xué)和生物方法:化學(xué)方法是測(cè)定藥物的溶出曲線等;生物方法多是對(duì)健康受試者進(jìn)行藥物的試用,通過空腹服藥和采集靜脈血進(jìn)行檢測(cè),對(duì)比相關(guān)指標(biāo),得出被測(cè)藥物是否具有一致性的結(jié)論。根據(jù)現(xiàn)有的藥物一致性評(píng)價(jià)方法,我們產(chǎn)生了利用尿液蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)的設(shè)計(jì)思路。生物標(biāo)志物最基本的特征是“變化”,合適的生物標(biāo)志物能夠更早、更靈敏地反映身體變化。血液作為常用的檢測(cè)樣本,有著嚴(yán)格的穩(wěn)態(tài)調(diào)控,其中大多數(shù)變化信息會(huì)被機(jī)體的調(diào)節(jié)機(jī)制清除,僅在相當(dāng)短的時(shí)間內(nèi)存在。相比之下,尿液是血液濾過的產(chǎn)物,不受體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)節(jié),可以容納并積累更多、更大的變化[1],而且,尿蛋白可在較長時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定[2],尿液蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性相對(duì)較低,更容易檢測(cè)到低豐度蛋白質(zhì)的變化特征[3],可見尿液是良好的生物標(biāo)志物來源。不過,尿液蛋白質(zhì)組易受多種因素的影響,如飲食、藥物治療、日?；顒?dòng)等,要使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確,關(guān)鍵是采用簡(jiǎn)單且可控制的系統(tǒng)。由于動(dòng)物模型的遺傳和環(huán)境因素可以人為控制,能夠最大程度減少無關(guān)的影響因素,因此采用動(dòng)物模型開展尿液生物標(biāo)志物的研究是一種非常合適的實(shí)驗(yàn)方法。那么對(duì)于最廣泛應(yīng)用的他汀類降脂藥,我們是否可以從尿液的角度對(duì)原研藥和仿制藥進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)呢？

他汀類藥物是一種還原酶抑制劑,是臨床上廣泛使用的降血脂藥物[4]。其降脂作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成的限速酶——羥甲基戊二酰輔酶A還原酶,從而降低細(xì)胞內(nèi)的膽固醇水平;這一機(jī)制也可以上調(diào)患者肝細(xì)胞表面低密度蛋白質(zhì)的受體表達(dá),從而對(duì)患者體內(nèi)的血脂進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。他汀類藥物還有除調(diào)脂以外的多種療效,它的多效性在治療動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、心房顫動(dòng)、室性心律失常及抗心肌肥厚等方面發(fā)揮了重要作用[6]。本研究通過將合適劑量的兩種阿托伐他汀片分別灌胃到大鼠,收集了大鼠灌胃前后的尿液并進(jìn)行了非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析,探究了兩種藥物灌胃后的蛋白質(zhì)組變化并進(jìn)行了比較,創(chuàng)新性地為藥物一致性評(píng)價(jià)提供了新的評(píng)價(jià)方法。

1 材料與方法

1.1 灌胃動(dòng)物模型的建立

健康SD(Sprague Dawley)雄性大鼠,體重(160±20)g,10只,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境[室溫(22±1)℃、濕度65%～70%]中飼養(yǎng)3 d后開始實(shí)驗(yàn),一切實(shí)驗(yàn)操作遵循北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。

采用自身前后對(duì)照的方式,將10只大鼠隨機(jī)均分為A、B兩組,每組5只大鼠。A組用A廠藥物研磨后溶于生理鹽水內(nèi)進(jìn)行灌胃操作,B組用B廠藥物研磨后溶于生理鹽水內(nèi)進(jìn)行灌胃操作,A、B兩種藥物劑型相同,劑量均為10 mg/kg[7],每日1次于同一時(shí)間灌胃,持續(xù)5 d,每天稱取大鼠重量,按大鼠重量給與對(duì)應(yīng)劑量的藥品。

1.2 尿液樣品的收集

大鼠灌胃給藥處理前統(tǒng)一將其置于代謝籠中收集12 h的尿液,然后在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行灌胃給藥,第5天灌胃給藥處理后再將大鼠置于代謝籠中收集12 h的尿液。在尿液收集過程中大鼠禁食禁水,兩次收集的尿液都放入-80℃冰箱保存。

1.3 尿液樣品的處理

尿蛋白提取和定量:將兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集到的大鼠尿液在4℃的條件下以12 000g離心40 min,取上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管中,3倍上清體積加入預(yù)冷乙醇。均勻混合后在-20℃條件下沉淀過夜。第2天,將乙醇上清混合液于4℃條件下以12 000g離心30 min,棄上清,留蛋白質(zhì)沉淀,倒扣于濾紙上,用吹風(fēng)機(jī)冷風(fēng)吹干。將蛋白質(zhì)沉淀重懸于120 μL裂解液[8 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、25 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT,德國Sigma公司)、50 mmol/L Tris],用槍頭反復(fù)吹打,直到無沉淀為止,并于渦旋混合器完全混勻2 h。混合均勻后4℃條件下12 000g離心30 min,取上清蛋白質(zhì)置于新的EP管內(nèi),用Bradford法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。

尿蛋白酶切:取100 μg尿蛋白樣品加入1.5 mL離心管中,加入25 mmol/L NH4HCO3溶液使總體積為200 μL;加入20 mmol/L DTT溶液,渦旋混勻后,金屬浴(97℃)加熱5 min,隨后冷卻至室溫;加入50 mmol/L的碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA,德國Sigma公司),渦旋混勻后,室溫避光反應(yīng)40 min。向10 kD超濾管(美國Pall公司)中加入200 μL UA溶液(8 mol/L尿素、0.1 mol/L Tris-HCl,pH 8.5),按照14 000g、5 min、18℃的條件離心洗滌兩次;加入處理后的蛋白質(zhì)樣品,在14 000g、40 min、18℃條件下進(jìn)行離心,再加入200 μL UA溶液,渦旋混勻,于18℃條件下14 000g離心40 min,棄下層濾過液,重復(fù)兩次;加入25 mmol/L NH4HCO3溶液,渦旋混勻,在18℃條件下14 000g離心40 min,棄下層濾過液,重復(fù)兩次。更換新的套管,加入100 μL 25 mmol/L的NH4HCO3溶液,以胰酶∶蛋白質(zhì)為1∶50的質(zhì)量比加入胰蛋白酶(Trypsin Gold,美國Promega公司)進(jìn)行消化,37℃水浴過夜后收集溶有肽段的溶液[8]。最后通過HLB柱(美國Waters公司)除鹽,用真空干燥儀進(jìn)行抽干,于-80℃條件下保存。

1.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析

酶解后的樣品加入0.1%的甲酸復(fù)溶,使用BCA試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)對(duì)肽段進(jìn)行定量,將肽段稀釋為0.5 μg/μL。取每個(gè)樣品9 μL制備混合多肽樣,按照說明書,使用高pH反相肽分離試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行分離。離心收集10份流出液,使用真空干燥儀抽干后用0.1%甲酸復(fù)溶。以樣品∶iRT(indexed retention time,英國BioGnosis公司)為10∶1的體積比例加入iRT。每個(gè)樣品(單個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品和10個(gè)流出液)取1 μg使用EASY-nLC1200色譜系統(tǒng)(美國Thermo Fisher Scientific公司)和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行質(zhì)譜分析并采集數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

十個(gè)流出液的raw文件通過PD(Proteome Discoverer 2.1,美國Thermo Fisher Scientific公司)軟件進(jìn)行分析,分析結(jié)果用于建立DIA(data independent acquisition)采集方法。新建立的DIA方法用于進(jìn)行單個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的DIA模式采集。采集結(jié)束后使用Spectronaut(英國BiogGnosis公司)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。導(dǎo)入每個(gè)樣本DIA采集的raw文件進(jìn)行搜庫。采用二級(jí)肽段所有碎片離子峰面積進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采取自身對(duì)照的方式,將灌胃前后鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較,篩選差異蛋白質(zhì)。差異蛋白質(zhì)篩選條件為:組間變化倍數(shù)(fold change)≥1.50或≤0.67,配對(duì)t檢驗(yàn)分析的P校正值＜0.05。對(duì)篩選到的差異蛋白質(zhì)使用UniProt網(wǎng)站(https://www.uniprot.org/;2022-03-03)和DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/;2022-03-03)進(jìn)行生物學(xué)分析,并在PubMed數(shù)據(jù)庫(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/;2022-03-03)上對(duì)已報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行檢索。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)分析

在造模前后對(duì)A、B兩組大鼠進(jìn)行行為學(xué)觀察,觀察結(jié)果顯示,兩組大鼠活動(dòng)正常,飲食飲水均正常,且兩組大鼠之間無明顯的行為學(xué)差異。同時(shí),在灌胃給藥處理前及給藥處理的5 d時(shí)間里,兩組大鼠體重均持續(xù)增加(圖1),生長狀況正常。

圖1 A、B組大鼠體重變化Fig.1 Weight changes of rats in groups A and B

2.2 尿液蛋白質(zhì)組變化分析

2.2.1 尿液蛋白質(zhì)鑒定情況

在灌胃給藥處理后,對(duì)所收集到的兩組大鼠共20個(gè)尿液蛋白質(zhì)樣品(灌胃前后)進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析?？偣茶b定到1 261個(gè)蛋白質(zhì),其中特異性多肽≥2個(gè),蛋白質(zhì)水平錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)＜1%。A、B兩組大鼠灌胃前后尿液樣本的比較結(jié)果表明,相對(duì)于灌胃給藥前,灌胃給A藥后鑒定到116個(gè)差異蛋白質(zhì),灌胃給B藥后鑒定到66個(gè)差異蛋白質(zhì),差異蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息列于表1(A組)和表2(B組)。用韋恩圖展示A、B兩種藥物灌胃處理后鑒定到的差異蛋白質(zhì)的重疊情況,發(fā)現(xiàn)有24個(gè)蛋白質(zhì)在兩組大鼠中均被鑒定到(圖2)。同時(shí),我們對(duì)總蛋白質(zhì)進(jìn)行了偏最小二乘法判別分析(partial least squares-discriminant analysis,PLSDA),結(jié)果如圖3所示,橙色區(qū)域和藍(lán)色區(qū)域分別代表灌胃B藥物和A藥物的樣本情況,灰色區(qū)域是灌胃前的樣本情況。從圖中可知,藥物灌胃帶來的差異是十分明顯的,且這兩種藥物的區(qū)別不大。

圖2 A、B兩組大鼠灌胃給藥處理鑒定到的差異蛋白質(zhì)的韋恩圖Fig.2 The Venn diagram of differential proteins identified in urine samples of rats treated with intragastric drug administration in groups A and B

圖3 鑒定到的總蛋白質(zhì)偏最小二乘法判別分析結(jié)果Fig.3 Partial least squares-discriminant analysis of the identified urine proteins

2.2.2 灌胃A組大鼠差異蛋白質(zhì)的功能分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)灌胃A組大鼠鑒定到的差異蛋白質(zhì)從生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能3個(gè)方面進(jìn)行功能富集分析(圖 4,https://www.bioinformatics.com.cn)。從圖中可以看出,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞黏附、底物黏附依賴性細(xì)胞擴(kuò)散、內(nèi)肽酶活性的負(fù)調(diào)控、肽基酪氨酸磷酸化的正向調(diào)控、細(xì)胞遷移、蛋白質(zhì)水解等生物學(xué)過程。在細(xì)胞成分上,這些差異蛋白質(zhì)大多來自胞外和細(xì)胞質(zhì)膜外,而在分子功能中,我們發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白質(zhì)大多具有整合素結(jié)合、水解酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑的活性、胰島素樣生長因子結(jié)合等功能。

2.2.3 灌胃B組大鼠差異蛋白質(zhì)的功能分析

同上,我們通過功能分析發(fā)現(xiàn),灌胃B組大鼠鑒定到的差異蛋白質(zhì)主要參與了蛋白質(zhì)水解、肝細(xì)胞生長因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)、免疫反應(yīng)、半胱氨酸代謝、甲狀腺激素刺激的細(xì)胞反應(yīng)、谷胱甘肽代謝等生物學(xué)過程(圖5,https://www.bioinformatics.com.cn)。在細(xì)胞成分上,這些差異蛋白質(zhì)仍舊是源于胞外區(qū)、分泌體;在分子功能中,差異蛋白質(zhì)主要具有肽酶活性、羧肽酶活性、水解酶活性、肽鏈內(nèi)切酶抑制劑活性、谷氨酰半胱氨酸連接酶活性等功能(圖 5)。

圖4 A組灌胃大鼠差異蛋白質(zhì)功能分析Fig.4 Functional analysis of differential proteins in group A

圖5 B組灌胃大鼠差異蛋白質(zhì)功能分析Fig.5 Functional analysis of differential proteins in group B

3 討論

本研究使用源于兩種藥廠的阿托伐他汀片分別建立了大鼠灌胃模型,通過對(duì)灌胃前后收集的尿液進(jìn)行非標(biāo)記LC-MS/MS鑒定和分析,探究不同藥廠所制藥物對(duì)大鼠尿蛋白的影響。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,將灌胃后的尿液和灌胃前的尿液進(jìn)行對(duì)比,在A組灌胃模型中共鑒定到116個(gè)差異蛋白質(zhì)(表1),在B組灌胃模型中共鑒定到66個(gè)差異蛋白質(zhì)(表2),其中有24個(gè)蛋白質(zhì)在兩組中都被鑒定到(圖 2)。

表1 A組鑒定到的尿液差異蛋白質(zhì)Table 1 The differential proteins identified in group A

表1 (續(xù))

表1 (續(xù))

表2 B組鑒定到的尿液差異蛋白質(zhì)Table 2 The differential proteins identified in group B

表2 (續(xù))

根據(jù)偏最小二乘法判別分析結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn),尿蛋白可以顯示出阿托伐他汀對(duì)機(jī)體的顯著影響,而不同廠家的成分、劑型、劑量一致的藥物對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的差異影響也能被觀測(cè)到,這說明我們能從尿蛋白中看到很細(xì)致的變化。從差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分析結(jié)果上看,我們不能很明顯地區(qū)分出這些影響源自于藥物的藥理作用還是毒理作用,首先我們沒有觀察到和降脂有顯著關(guān)系的生物學(xué)通路,其次如果有他汀類藥物副作用的話,我們可能會(huì)看到和平滑肌細(xì)胞遷移、血小板黏附下調(diào)相關(guān)的生物學(xué)通路[9],而這些在本研究中并沒有觀測(cè)到。從目前的研究階段來看,可能是因?yàn)閯┝康膯栴}讓我們沒有看到顯著的藥理或毒理作用,但在本研究中,即使是很小的劑量,我們依舊可以通過尿液觀測(cè)到機(jī)體受到的影響,這充分說明了尿液的靈敏性,以及其用于藥物一致性評(píng)價(jià)的巨大潛力。

4 結(jié)論

通過建立阿托伐他汀大鼠灌胃模型,我們能從尿液上顯著區(qū)分藥物帶來的影響;針對(duì)產(chǎn)自不同藥廠的阿托伐他汀片,尿蛋白甚至可以檢測(cè)到兩種藥物之間細(xì)致的差別,這充分驗(yàn)證了尿液的靈敏性,同時(shí)提示尿液蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物一致性評(píng)價(jià)上有很大潛力。