郝芳 單春光 賈巧靜 尹曉妍 岳麗艷

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉科，河北 石家莊 050004)

喉癌是僅次于肺癌的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤。我國每年新發(fā)患者數(shù)達(dá)2.6萬例，死亡患者達(dá)1.5萬例[1]。以鱗癌最為常見，占所有病理類型的95%以上。其起病隱匿，早期發(fā)現(xiàn)困難，而中晚期患者需行全喉切除，遠(yuǎn)期生存預(yù)后較差[2]。目前喉癌發(fā)生的分子機制尚不清楚，研究表明喉癌的發(fā)生與細(xì)胞自噬、免疫微環(huán)境功能紊亂等因素有關(guān)[3]。神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子(Semaphorin 3F，SEMA3F)基因位于人類3號染色體，編碼蛋白屬于Semaphorin家族成員，該家族的分泌信號蛋白參與神經(jīng)元發(fā)育過程中的軸突引導(dǎo)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，SEMA3F能以自分泌方式起作用來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖和存活，并作為抗腫瘤的抑癌基因[5]。神經(jīng)菌毛蛋白2(Neuropilin 2，NRP2)的編碼基因位于2q33.3，該基因編碼蛋白屬于神經(jīng)纖毛蛋白家族的一個成員，能與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF) 相互作用，在心血管發(fā)育、軸突引導(dǎo)和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NRP2在膀胱癌、肺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，其過表達(dá)通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤的惡性進(jìn)展[7-8]。本研究通過研究喉癌中SEMA3F、NRP2的表達(dá)，探討SEMA3F、NRP2在喉癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年3月～2018年3月我院收治的82例喉癌患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理HE染色，兩位病理科醫(yī)師明確診斷為喉鱗狀細(xì)胞癌。②首次診治，于我院完成常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)治療。③臨床資料完整，患者能配合檢查隨訪。④患者及家屬知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①獲取病理標(biāo)本前未接受放化療治療。②伴精神障礙性疾病等。③伴嚴(yán)重的臟器功能障礙。患者中男性68例，女性14例；年齡30～76歲，平均(56.3±6.2)歲；聲門型44例，聲門上型25例，聲門下型13例；腫瘤TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期37例；高分化50例，中低分化32例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 應(yīng)用熒光定量PCR檢測組織中SEMA3F、NRP2的表達(dá) 液氮中將癌及癌旁組織研磨，EP管中離心去除下層沉淀。應(yīng)用天根RNA提取試劑盒(北京天根，DP430)提取組織中總RNA，Nanodrop1000檢測RNA的濃度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(北京天根，RP1105)。以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)?？傮w系20 μL，包含SYBR Green Premix 10 μL，上游及下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 4 min，95℃ 30 s，58℃ 25 s，70℃ 30 s，共40個循環(huán)。SEMA3F、NRP2的表達(dá)以2-ΔΔCt值表示。根據(jù)組織中SEMA3F、NRP2 mRNA表達(dá)的平均數(shù)為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 資料收集及觀察指標(biāo) ①收集所有研究對象性別、年齡等一般臨床資料。②收集腫瘤分型、腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。③收集患者隨訪過程中生存狀態(tài)，生存狀態(tài)使用3年總體生存(Overal survival,OS)來評價,3年OS定義為從首次確診之日開始至無論何種原因?qū)е碌乃劳龌蛘吣┐坞S訪的時間。

1.2.3 出院隨訪 出院后開始隨訪，以電話方式每三月隨訪一次，隨訪內(nèi)容為患者生存狀態(tài)。隨訪三年，隨訪終止日期2021年3月。

2 結(jié)果

2.1 喉癌中SEMA3F、NRP2表達(dá) 癌及癌旁組織中SEMA3F mRNA的相對表達(dá)量分別為0.810±0.132、3.415±0.826，NRP2 mRNA的相對表達(dá)量分別為4.117±0.724、0.810±0.232。與癌旁組織相比，喉癌組織中SEMA3F mRNA的表達(dá)明顯較低(t=28.201，P<0.001)，而NRP2 mRNA明顯較高(t=39.389，P<0.001)，見圖1。

圖1 喉癌和癌旁組織中SEMA3F、NRP2表達(dá)

2.2 喉癌中SEMA3F與NRP2表達(dá)的相關(guān)性 相關(guān)分析結(jié)果表明，SEMA3F與NRP2 mRNA表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.561，P<0.001)，見圖2。

圖2 癌組織中SEMA3F與NRP2表達(dá)的相關(guān)性

2.3 SEMA3F、NRP2的表達(dá)與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系 喉癌中SEMA3F、NRP2的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(均P<0.05)。與Ⅰ～Ⅱ期相比，Ⅲ～Ⅳ期患者癌組織中SEMA3F明顯較低，而NRP2明顯較高(均P<0.05)；與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相比，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中SEMA3F明顯較低，而NRP2明顯較高(均P<0.05)，見表2。

2.4 SEMA3F、NRP2的表達(dá)與喉癌患者生存預(yù)后

表2 喉癌中SEMA3F、NRP2的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

所有82例喉癌患者均隨訪三年，失訪2例，死亡22例，3年生存率為72.5%(58/80)。SEMA3F高表達(dá)組和低表達(dá)組的3年總體生存率(OS)分別為90.2%(37/41)、53.8%(21/39)，低SEMA3F表達(dá)組患者3年OS顯著低于高表達(dá)組患者(2=6.174，P=0.031)；NRP2高表達(dá)組和低表達(dá)組的3年OS分別為57.1%(24/42)、89.5%(34/38)，高NRP2表達(dá)組患者3年OS顯著低于低表達(dá)組患者(2=5.623，P<0.001)，見圖3。

2.5 影響喉癌患者生存預(yù)后的因素 以喉癌患者隨訪過程中的生存情況為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，納入腫瘤分期(賦值1=Ⅰ～Ⅱ期，2=Ⅲ～Ⅳ期)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(1=伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，0=無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)、SEMA3F(賦值1=低表達(dá)，2=高表達(dá))、NRP2(賦值1=高表達(dá)，2=低表達(dá))為自變量。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示，喉癌組織中SEMA3F低表達(dá)、NRP2高表達(dá)、腫瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是喉癌患者不良預(yù)后的危險因素，見表3。

3 討論

喉癌的發(fā)生是一個多基因、多條信號通路參與的復(fù)雜過程，受到環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的雙重調(diào)節(jié)。喉癌發(fā)生的危險因素包括吸煙、飲酒及職業(yè)危險因素暴露等，多種因素共同作用，導(dǎo)致細(xì)胞癌基因的過度激活、抑癌基因的失活及染色體雜合性缺失等改變，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-10]。尋找喉癌關(guān)鍵的驅(qū)動癌基因或抑癌基因，揭示腫瘤發(fā)生的分子機制，對尋找新的喉癌早期診斷方案及臨床治療策略，具有重要意義。

圖3 Kaplan-Meier生存分析SEMA3F、NRP2的表達(dá)對喉癌患者預(yù)后影響

表3 影響喉癌患者預(yù)后因素的多因素COX比例風(fēng)險回歸模型

SEMA3F位于染色體 3p21.3，是Semaphorin 家族的分泌軸突指導(dǎo)分子，在神經(jīng)元發(fā)育和軸突傳導(dǎo)中發(fā)揮重要功能[11]，SEMA3F還是大腦發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[12]。除神經(jīng)系統(tǒng)外，SEMA3F在腫瘤發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)過程也發(fā)揮重要作用。研究表明，在肺癌和乳腺癌中SEMA3F 基因所在的染色體區(qū)域經(jīng)常丟失，提示SEMA3F起到腫瘤抑制因子的作用[13]。然而，SEMA3F 在喉癌中報道尚少。本研究中，癌組織中SEMA3F mRNA的表達(dá)顯著降低，表明SEMA3F在喉癌中可能發(fā)揮腫瘤抑制的作用。腫瘤中SEMA3F的表達(dá)下調(diào)與長鏈非編碼(Lnc)RNA的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA FAM83C-AS1能夠通過穩(wěn)定Zeste同源增強子2的表達(dá)，促進(jìn)SEMA3F基因啟動子區(qū)域H3K27me3位點甲基化，表觀遺傳學(xué)抑制SEMA3F轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲[14]。喉癌中SEMA3F表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SEMA3F低表達(dá)促進(jìn)喉癌的惡性進(jìn)展。有學(xué)者在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SEMA3F高表達(dá)患者淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率較低，生存期較長。機制上，SEMA3F 通過 PI3K-AKT 依賴性下調(diào) ASCL2-CXCR4 軸來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[15]。Kieszkowski等[5]研究表明，SEMA3F亦參與腫瘤耐藥性成的過程，即在腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，梯度加用順鉑處理腫瘤細(xì)胞，結(jié)果SEMA3F表達(dá)顯著上調(diào)，提示SEMA3F亦可通過對化療藥物耐藥性形成，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。此外，本研究亦證實，SEMA3F低表達(dá)的喉癌患者生存預(yù)后較差，并且SEMA3F低表達(dá)是喉癌患者不良生存預(yù)后的獨立危險因素。表明SEMA3F是喉癌患者預(yù)后的重要因素，值得深入研究。

NRP-2屬于神經(jīng)纖維蛋白家族成員，在肝細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胰島細(xì)胞和成骨細(xì)胞中均有表達(dá)，特別是在神經(jīng)元和血管發(fā)育中發(fā)揮重要作用。NRP-2為 VEGF-C/D 的輔助受體，VEGF-C/D 是一種眾所周知的淋巴管生成因子，在各種人類癌癥的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。在甲狀腺癌及胃癌等惡性腫瘤中，NRP-2的高表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長、遷移和侵襲，患者的預(yù)后較差[17-18]。本研究中，喉癌中NRP-2 mRNA的表達(dá)明顯較高。NRP-2 mRNA的表達(dá)受到微小RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究表明，miR-486-5p能夠結(jié)合NRP-2 mRNA的3＇非編碼區(qū)，抑制NRP-2 mRNA的表達(dá)，而腫瘤中miR-486-5p表達(dá)降低，導(dǎo)致NRP-2 mRNA表達(dá)顯著升高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移[19]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)NRP-2的高表達(dá)與較高的腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。NRP-2作為VEGF-C的配體，其表達(dá)水平升高能夠顯著激活下游P38/MAPK信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及淋巴轉(zhuǎn)移[20]。Schulz等[8]研究報道，腫瘤中NRP-2能夠結(jié)合TGF-β受體，激活下游上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化信號通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲。因此，喉癌中NRP-2可能作為一種原癌基因，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。喉癌中NRP-2高表達(dá)是患者不良生存預(yù)后的獨立危險因素，表明檢測喉癌中NRP-2可能是預(yù)測喉癌患者生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。NRP-2作為一種細(xì)胞表面分子，靶向NRP-2的治療不僅能夠抑制腫瘤的惡性進(jìn)展，還能夠改善對化療藥物治療的抵抗，進(jìn)而延長患者的生存時間[21]。

本研究中，喉癌中SEMA3F與NRP2 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可能是SEMA3F與NRP2存在相互作用。SEMA3F與NRP2 mRNA表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)關(guān)系密切，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)是喉癌獨立預(yù)后因素。腫瘤淋巴管生成是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵過程，血管內(nèi)皮生長因子 C(VEGF-C) 是促進(jìn)淋巴管生成的最重要分子[22]。NRP2是 VEGF-C的重要受體，結(jié)合VEGF-C后促進(jìn)惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[23]。SEMA3F是NRP2的信號素配體，可以與 VEGF-C競爭性結(jié)合 NRP2，發(fā)揮抑制下游信號通路的作用[24]。因此，SEMA3F可能通過結(jié)合并抑制NRP2的表達(dá)及功能，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移能力。

4 結(jié)論

喉癌中SEMA3F mRNA表達(dá)降低，NRP2 mRNA表達(dá)升高，均與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，喉癌組織中SEMA3F低表達(dá)、NRP2高表達(dá)、腫瘤Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是喉癌患者不良預(yù)后的危險因素，可能成為新的喉癌診斷及治療的新靶點。