昆蟲病原線蟲致病機制研究進展

常豆豆，王從麗，李春杰*

（1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所/大豆分子設(shè)計育種院重點實驗室，哈爾濱 150081；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

昆蟲病原線蟲（entomopathogenic nematodes，EPN）自然存在于土壤中，是一種專性寄生昆蟲的線蟲。大量研究證明，這類線蟲可侵染和殺死鱗翅目和鞘翅目等昆蟲幼蟲，對環(huán)境、植物及非靶標(biāo)生物無副作用，在害蟲生物防治中發(fā)揮著重要作用。昆蟲病原線蟲分為斯氏科 Steinernematidae、異小桿科Heterorhabditidae[1]，用于害蟲生物防治的昆蟲病原線蟲主要包括斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis。目前已發(fā)現(xiàn)和鑒定出100多種Steinernema和Heterorhabditis[2]。昆蟲病原線蟲與體內(nèi)細(xì)菌共生，共生細(xì)菌包括腸桿菌科的致病桿菌屬Xenorhabdus與發(fā)光桿菌屬Photorhabdus，分別與Steinernema和Heterorhabditis線蟲共生。腸道內(nèi)攜帶共生菌的侵染期線蟲（infective juveniles，IJs）自由生活在土壤環(huán)境中，主動尋找并侵入合適的寄主，隨后釋放體內(nèi)共生細(xì)菌到寄主昆蟲血腔內(nèi)，細(xì)菌迅速繁殖并產(chǎn)生毒素，使寄主于48 h內(nèi)患敗血癥而死亡。線蟲和細(xì)菌利用寄主體內(nèi)組織作為營養(yǎng)進行繁殖；當(dāng)寄主體內(nèi)營養(yǎng)消耗殆盡，侵染期線蟲從寄主體內(nèi)爬出并尋找新的寄主。在寄生過程中，線蟲依賴于共生細(xì)菌殺死其寄主昆蟲，共生細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抑制可競爭的次級微生物，將寄主組織分解成可利用的營養(yǎng)物質(zhì)，并作為食物來源，從而為其繁殖創(chuàng)造一個合適的環(huán)境[3]。共生細(xì)菌需要線蟲來保護自己不受外界環(huán)境的影響，被釋放到寄主血腔，并抑制寄主的抗菌蛋白[1]。線蟲與共生細(xì)菌形成致病復(fù)合物，其中共生細(xì)菌的致病機制被學(xué)者們普遍闡明，但是近年來研究表明致病復(fù)合物中線蟲表皮化合物及其共生細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)是與寄主早期互作的重要組成部分，避免被寄主昆蟲免疫系統(tǒng)識別[4]，而在侵染后期，線蟲和細(xì)菌分泌物共同作用改變寄主的生理平衡，使其患敗血癥而死亡。本文主要綜述斯氏屬線蟲及異小桿屬線蟲的表皮免疫機制、分泌蛋白鑒定和功能，以及致病機制等研究進展，為深入揭示這類線蟲的致病機制提供參考，為這類生物農(nóng)藥的高效研發(fā)提供新思路。

1 昆蟲病原線蟲的寄生策略

當(dāng)自由生活的 IJs到達目標(biāo)昆蟲，它會面對寄主的第一道防線，即物理結(jié)構(gòu)障礙，如角質(zhì)層和中腸營養(yǎng)膜等，當(dāng)這些屏障被打破后，昆蟲通過細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)保護自己免受細(xì)菌或線蟲感染[5]。細(xì)胞免疫反應(yīng)包括血細(xì)胞的吞噬、結(jié)瘤及包埋[6]，體液免疫包括可誘導(dǎo)的抗菌肽、細(xì)胞黏附分子、溶酶菌、凝集素、黑化作用等[7,8]。而IJs為了克服寄主體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)并成功寄生，主要采取免疫逃避和免疫抑制兩種策略。免疫逃避是線蟲合成與寄主抗原相關(guān)的分子（被稱為self-proteins）或獲得寄主的分子化合物，將這些分子物質(zhì)覆蓋在線蟲的體表來逃避寄主的免疫[9]；免疫抑制是線蟲通過排泄/分泌各種化合物來干擾或中和寄主在應(yīng)對侵染時引發(fā)的免疫[10]。線蟲在不同侵染階段采取不同的策略：在侵染寄主早期（0～3 h），線蟲和細(xì)菌通過表皮復(fù)合物的免疫逃避策略避免寄主酚氧化酶原系統(tǒng)（Prophenoloxidase system）和血細(xì)胞識別；在侵染寄主后期（3 h以后），IJs及其共生細(xì)菌釋放各種毒性因子，如蛋白酶、酚氧化酶抑制劑和毒素來抑制寄主的免疫反應(yīng)[11]。

2 昆蟲病原線蟲及其共生細(xì)菌對昆蟲致病作用

2.1 共生細(xì)菌的致病性

線蟲成功寄生過程即對寄主致病過程。多數(shù)國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注線蟲體內(nèi)共生細(xì)菌在致病過程的作用，認(rèn)為昆蟲病原線蟲釋放Photorhabdus或Xenorhabdus共生細(xì)菌后，細(xì)菌的表面成分如菌毛、鞭毛蛋白首先發(fā)揮作用，阻止吞噬和結(jié)瘤過程，避免被寄主免疫血細(xì)胞識別[12]，隨后，共生細(xì)菌分泌毒力因子，包括毒素復(fù)合物、蛋白酶、脂肪酶和脂多糖等抑制寄主的免疫反應(yīng)[13]，克服昆蟲的體液和細(xì)胞防御機制，細(xì)菌在血腔繁殖并在48 h內(nèi)使寄主患敗血癥而死亡[14,15]；共生菌還會產(chǎn)生有毒的次級代謝物，不僅對寄主昆蟲是致病的，而且還會阻止其他的細(xì)菌和真菌利用富含營養(yǎng)的昆蟲尸體[16]。

在致病性和營養(yǎng)關(guān)系方面，異小桿屬線蟲與發(fā)光桿菌之間共生關(guān)系的專一性比斯氏屬線蟲與致病桿菌更為嚴(yán)格[17]。在體外無菌培養(yǎng)時，斯氏屬線蟲被成功培養(yǎng)，而異小桿屬未被成功培養(yǎng)[18]，只有當(dāng)無菌異小桿屬線蟲在非特異性發(fā)光桿菌培養(yǎng)條件下才能得以繁殖[19]。Han和Ehlers[17]研究闡明了H.bacteriphohora和S.carpocapsae侵染期線蟲對其共生細(xì)菌的營養(yǎng)依賴性，及這兩種無菌線蟲在無菌大蠟螟Galleria mellonella體內(nèi)的發(fā)育和致病性。將無菌H.bacteriphohoraH06線蟲與其非特異性的發(fā)光桿菌離體培養(yǎng)，產(chǎn)生體內(nèi)無菌（axenic）的侵染期線蟲，用該線蟲侵染無菌大蠟螟，線蟲發(fā)育受阻并且無法致死大蠟螟；無菌S.carpocapsae在大蠟螟體內(nèi)可以發(fā)育為成蟲并繁殖，在3 d后殺死寄主昆蟲；而Hallem等[20]培養(yǎng)無菌H.bacteriphohora可以致死黑腹果蠅Drosophila melanogaster，無菌線蟲H.downeseiy可以致死寄主昆蟲煙草天蛾幼蟲Manduca sexta[21]，表明不同昆蟲對異小桿屬線蟲的響應(yīng)不同，斯氏屬和異小桿屬線蟲自身均有抵御昆蟲免疫的能力。

2.2 線蟲的致病性

已有研究表明昆蟲病原線蟲剛侵入寄主體內(nèi)不能立刻釋放共生細(xì)菌，斯氏屬格氏線蟲S.glaseri侵染寄主4～5 h后釋放致病桿菌[22]，異小桿屬線蟲H.bacteriphohora侵染寄主半小時后釋放發(fā)光桿菌[23]，因此，在侵染的早期階段，避免被寄主昆蟲的免疫識別是線蟲成功寄生的關(guān)鍵。一些學(xué)者研究了斯氏屬和異小桿屬線蟲致病過程，線蟲在線蟲-細(xì)菌復(fù)合體的致病性中，不僅具有“活注射器”的功能，而且還在侵入寄主后的不同時期通過表皮和其他分泌物的聯(lián)合作用來逃避和抑制寄主昆蟲的免疫。

2.2.1 斯氏屬線蟲表皮復(fù)合物對寄主的免疫調(diào)節(jié) 線蟲表皮是指線蟲身體最外層結(jié)構(gòu)，又稱為外鞘，與線蟲的上表皮松散連接[24]。Blaxter等[25]提出了線蟲角質(zhì)層免疫規(guī)避作用的一般模型，侵染期線蟲表面外膜（surface coat）在逃避昆蟲免疫過程中發(fā)揮重要作用。侵染期線蟲表皮由碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成，帶負(fù)電荷，處于動態(tài)變化中，其組分不斷被合成，并且向寄主擴散。研究表明S.feltiae表皮脂質(zhì)可以與來自大蠟螟血淋巴因子相結(jié)合，在線蟲周圍形成一層薄膜，這種非特異性的薄膜可以逃避寄主血細(xì)胞識別[26]，S.glaseri表皮蛋白模擬昆蟲對侵染期線蟲表皮特定蛋白的識別進而逃避寄主免疫[27]。在斯氏屬線蟲侵染的早期階段，即共生細(xì)菌在寄主血腔被釋放之前，線蟲和寄主昆蟲免疫系統(tǒng)相互作用過程中，線蟲體表化合物，即脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等首先接觸昆蟲免疫系統(tǒng)發(fā)揮其免疫抑制功能[4]。

2.2.1.1S.feltiae表皮脂質(zhì)的免疫抑制 Dunphy和Webster[28]鑒定了S.feltiae部分表皮成分可抑制大蠟螟血細(xì)胞包埋，用脂肪酶處理表皮會導(dǎo)致其抑制特性的喪失，推測角質(zhì)層脂質(zhì)的變化導(dǎo)致可識別抗原的暴露；同樣，Brivio等[29]研究發(fā)現(xiàn)S.feltiae表皮可抑制大蠟螟免疫反應(yīng)，提取S.feltiae的表皮也可抑制酚氧化酶活性，進而證實該線蟲體表參與免疫抑制。進一步研究結(jié)果表明這一特性是由表皮上脂類物質(zhì)發(fā)揮作用，從S.feltiae表皮上提取的脂類可以抑制大蠟螟酚氧化酶活性及血細(xì)胞包埋反應(yīng)[30]和抗菌肽的合成[31]。表皮脂類物質(zhì)之所以抗免疫活性是因為能夠結(jié)合昆蟲體內(nèi)的寄主互作蛋白（host-interacting proteins，HIPs）[26,30]。寄主互作蛋白是寄主免疫反應(yīng)中與外源物互作的一類蛋白的總稱，脂類與寄主互作蛋白的結(jié)合導(dǎo)致血淋巴中寄主互作蛋白濃度降低，阻止了酚氧化酶原系統(tǒng)激活和黑色素包埋所需的血淋巴絲氨酸蛋白酶的激活，從而抑制寄主免疫反應(yīng)[31]。從S.feltiae和大蠟螟相互作用之間關(guān)系可以看出，這種線蟲表皮脂質(zhì)實施的免疫抑制策略能夠中和寄主昆蟲的免疫防御引起寄主發(fā)病。

通過角質(zhì)層的研究可以排除由線蟲分泌物或其共生細(xì)菌造成的影響，并避免使用無菌性線蟲，因為共生菌的缺失可能會在生理上發(fā)生改變。關(guān)于S.feltiae線蟲表皮脂類功能研究相對比較清楚，其具體成分或分子靶標(biāo)已有報道。Lu等[32]認(rèn)為S.feltiae的侵染期線蟲表皮對寄主免疫的抑制作用來源于線蟲自身的分泌蛋白，潛在地粘附在表皮上。

2.2.1.2S.glaseri表皮蛋白的免疫抑制功能 在斯氏屬S.glaseri中同樣觀察到表皮的免疫抑制，但發(fā)揮作用的是表皮蛋白。Wang等[33]發(fā)現(xiàn)沒有共生細(xì)菌的S.glaseri抑制日本金龜子Popillia japonica血細(xì)胞包埋和黑化作用，說明S.glaseri自身可以分泌抑制昆蟲免疫的物質(zhì)；用乙醇粗提取S.glaseri表皮蛋白并測試活性，發(fā)現(xiàn)該表皮蛋白可使異小桿屬線蟲H.bacteriophora在日本金龜子體內(nèi)存活率提高四倍，進一步分析粗提物，表皮蛋白中含有至少一種與昆蟲血細(xì)胞免疫相關(guān)的蛋白，其中表面外膜蛋白（surface coat protein 3a，SCP3a）可抑制血細(xì)胞對外來物的吞噬，降低寄主血細(xì)胞數(shù)目，表現(xiàn)出強烈的免疫抑制效果[26]。劉華[34]也從S.glaseri表皮蛋白粗提物中分離純化了一個具有抑制昆蟲血細(xì)胞吞噬作用的蛋白組分，經(jīng)過雙向電泳分離和二級質(zhì)譜鑒定，獲得了免疫抑制蛋白的序列信息，序列分析證實免疫抑制蛋白與多個物種烯醇化酶（enolase）具有較高同源性，具備烯醇化酶家族的各種特征，將其命名為 Sg-ENOL（S.glaserienolase）。免疫電鏡分析證實天然的 Sg-ENOL 位于線蟲表皮，同時發(fā)現(xiàn)Sg-ENOL也存在于線蟲肌肉組織中。S.glaseri在昆蟲源物質(zhì)誘導(dǎo)下會分泌Sg-ENOL，而無誘導(dǎo)物時不會分泌；在進入寄主體內(nèi)后開始分泌Sg-ENOL，證實Sg-ENOL與S.glaseri侵染過程密切相關(guān)。

斯氏屬線蟲侵入寄主昆蟲體腔后，表皮復(fù)合物在抑制昆蟲免疫過程中發(fā)揮重要作用，但線蟲在生活史中蛻皮 4次，外表皮層在組成和組織上會發(fā)生改變，這與線蟲的外部環(huán)境有關(guān)[25]。另外，用不同來源的培養(yǎng)基繁殖S.glaseri線蟲的表皮蛋白組成和活性存在差異，活體和離體培養(yǎng)S.glaseri后進行裂解血細(xì)胞試驗，結(jié)果表明源于大蠟螟培養(yǎng)的S.glaseri的表皮蛋白表現(xiàn)出強烈的裂解血細(xì)胞活性，而源于人工培養(yǎng)基繁殖的S.glaseri的表皮蛋白活性不明顯[35]。劉勁和劉華[36]通過比較S.glaseri侵染期線蟲表皮蛋白和分泌蛋白，發(fā)現(xiàn)線蟲的免疫抑制作用主要是由分泌蛋白產(chǎn)生的；而自身表皮上的蛋白，雖然也具有一定的免疫抑制活性，但含量相對較低，活性很弱。線蟲侵入寄主早期，表皮蛋白幫助逃避昆蟲的血細(xì)胞包埋，線蟲在與寄主體內(nèi)物質(zhì)接觸后，線蟲自身分泌物通過體表分泌到昆蟲血腔，對寄主的致病作用起著促進作用。

2.2.2 斯氏屬線蟲分泌蛋白的致病性 線蟲排泄/分泌（excretory/secretory，ES）產(chǎn)物既是有效的免疫原，在線蟲的致病力和寄主環(huán)境適應(yīng)性上起到了重要作用。S.feltiae、S.glaseri以及S.carpocapsae[37]等斯氏屬線蟲除了自身表皮復(fù)合物對寄主的免疫抑制作用，協(xié)助分泌蛋白和共生細(xì)菌等致病因子致死昆蟲，許多研究者發(fā)現(xiàn)斯氏屬線蟲還可利用分泌物調(diào)節(jié)免疫功能，是對寄主的主要致病因子。分泌物是由不同種分子組成的混合物，學(xué)者們重點關(guān)注并解析其中的蛋白。線蟲通過分泌蛋白（excretory/secretory protein，ESP）破壞寄主先天免疫反應(yīng)，增強其在寄主內(nèi)存活和致病。最初主要通過基因重組蛋白[38]、色譜純化法[39]、表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）[40]等方法對線蟲分泌蛋白進行鑒定，隨著組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，近年來轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)被用于分泌蛋白的鑒定。

2.2.2.1 線蟲分泌蛋白的鑒定及其功能 蛋白酶是寄生蟲感染和生長過程中產(chǎn)生的最豐富的酶，在寄生過程中發(fā)揮著重要作用[41]。目前多個斯氏屬線蟲寄生相關(guān)基因已被鑒定，這些基因編碼不同的蛋白酶，通過分子生物學(xué)等研究方法從S.carpocapsae的分泌產(chǎn)物中鑒定了5種絲氨酸蛋白酶及1種絲氨酸蛋白酶抑制劑、1種金屬蛋白酶和2種天冬氨酸蛋白酶，表達分析結(jié)果表明這些基因在寄生階段表達量增加，同時其基因功能、致病機制已被明確，部分效應(yīng)子是通過調(diào)控線蟲的寄生、降解寄主組織、抑制寄主昆蟲的免疫反應(yīng)等來調(diào)控其致病機制，具體蛋白的詳細(xì)功能如表1。

表1 已被鑒定的S.carpocapsae分泌的蛋白及其功能Table 1 The secreted protein and its functions of S.carpocapsae identified

斯氏屬線蟲能分泌蛋白質(zhì)（主要是蛋白酶）參與寄主免疫抑制，幫助線蟲感染寄主并在寄主內(nèi)生存。但蛋白酶在寄主-寄生蟲相互作用中的確切生物學(xué)作用及蛋白酶分泌來源尚不清楚，以上研究斯氏屬的ESP都是在感染環(huán)境之外進行鑒定，在寄主免疫抑制與逃避及組織損傷中發(fā)揮作用，是調(diào)節(jié)免疫的活性分子；而Lu等[32]與Chang等[49]對S.carpocapsae及S.feltiae在無菌條件下分泌蛋白進行組學(xué)分析和在寄主體內(nèi)活性分析，挖掘斯氏屬線蟲分泌蛋白中發(fā)揮毒性作用的核心蛋白，進一步驗證斯氏屬線蟲在促進線蟲-細(xì)菌復(fù)合物的致病性方面具有更積極的作用，而不是簡單地依賴于它們的共生細(xì)菌。

2.2.2.2 斯氏屬線蟲分泌蛋白的組學(xué)分析 當(dāng)自由生活侵染期線蟲侵染寄主時，會發(fā)生顯著的形態(tài)變化，這個過程被稱為“激活”，代表了線蟲生命周期中從自由生活轉(zhuǎn)換為主動寄生，研究ESP需要設(shè)計一種模擬自然侵染條件的試驗，以便獲得與自由生活的個體產(chǎn)生的盡可能相似的ESP[50]。Lu等[32]與Chang等[49]通過寄主昆蟲勻漿分別激活S.carpocapsae和S.feltiae侵染期線蟲，并收集線蟲分泌的蛋白，兩種線蟲的蛋白對果蠅、家蠶Bombyx mori和大蠟螟3種昆蟲均具有致病性，因ESP的毒性和在寄主體內(nèi)的快速擴散特征，稱其為毒液蛋白。凝膠電泳分析從無菌S.carpocapsae侵染期線蟲中收集到的ESP與從帶共生細(xì)菌的侵染期線蟲中收集到的ESP具有相似的蛋白圖譜，并且從兩個群體中收集到的ESP具有相似的毒性。但斯氏屬不同種線蟲的ESP含量和組成存在顯著差異，當(dāng)暴露寄主組織6～30 h，S.feltiaeESP的含量是波動且下降的，而S.carpocapsae的ESP較穩(wěn)定且數(shù)量緩慢下降，表明這兩種線蟲可能利用不同的策略建立寄生關(guān)系。為了戰(zhàn)勝并殺死寄主昆蟲，S.feltiae可能對其共生細(xì)菌X.bovienii有更強的依賴性，在激活和釋放共生細(xì)菌后不久，侵染期線蟲可能會將它們的生存策略從殺死寄主轉(zhuǎn)變?yōu)樯?、取食和發(fā)育。通過分析未激活和激活侵染期線蟲的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在IJs激活期間，即線蟲早期寄生階段的基因表達發(fā)生了變化。

質(zhì)譜分析了毒液蛋白質(zhì)組，發(fā)現(xiàn)毒液蛋白是一種包含許多種蛋白質(zhì)的復(fù)雜混合物，不同種線蟲的毒液蛋白包含的結(jié)構(gòu)域有差異，S.carpocapsae的毒液蛋白中除了含有上述（表1）的蛋白酶及蛋白酶抑制劑，還檢測到了毒素相關(guān)蛋白，如含Shk結(jié)構(gòu)域蛋白和脂肪酸及視黃醇結(jié)合蛋白，這些蛋白是抑制寄主免疫系統(tǒng)的潛在候選蛋白。而同樣的在S.feltiae鑒定的266種S.feltiae毒液中含量最多的蛋白質(zhì)組是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。基因同源性分析發(fā)現(xiàn) 52個共同的毒液基因高表達，代表了這兩種斯氏屬線蟲共有一個核心效應(yīng)蛋白。在這組關(guān)鍵的ESP中，有肽酶、糖基水解酶、凝集素以及可能參與免疫調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，如FAR（fatty acid/retinol binding protein）蛋白、免疫球蛋白和免疫球蛋白樣蛋白。這些關(guān)鍵毒液蛋白的具體功能尚不清楚，但它們在S.carpocapsae和S.feltiae之間的保守性表明它們在多種昆蟲寄主中起著重要的寄生作用。

2.2.3 異小桿屬線蟲表皮的免疫抑制作用 Bedding和Molyneux[51]的研究結(jié)果表明侵染期異小桿屬線蟲有獨特的頭部端齒結(jié)構(gòu)，能夠穿透寄主的表皮和節(jié)間膜便于線蟲侵入。異小桿屬線蟲除了在寄主昆蟲內(nèi)釋放共生細(xì)菌外，侵染期線蟲還可抑制寄主昆蟲的免疫反應(yīng)[52,53]。Eleftherianos等[21]發(fā)現(xiàn)無菌異小桿屬線蟲H.downesei能夠有效地抑制煙草天蛾細(xì)胞免疫反應(yīng)，如血細(xì)胞的數(shù)量、血細(xì)胞的吞噬能力和血細(xì)胞聚集。侵染寄主早期，異小桿屬線蟲的表皮干擾寄主的細(xì)胞免疫和體液免疫。侵染期線蟲保留2齡表皮（J2-cuticle）稱之為包鞘（ensheath）幼蟲，出鞘（exsheath）標(biāo)志著線蟲褪去2齡表皮，從自由生活過渡到寄生生活[54]。斯氏屬線蟲的J2-cuticle在土壤移動過程中容易褪去，但異小桿屬線蟲J2-cuticle較穩(wěn)定，這種表皮有助于線蟲避免昆蟲Tipula oleracea的細(xì)胞包埋[55]，Yi等[56]研究表明H.bacteriphohora表皮通過抑制在寄主免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用的必需活性因子——類花生酸（Eicosanoids），進而抑制大蠟螟的血細(xì)胞密度、微聚集、吞噬和包埋、無細(xì)胞血淋巴酚氧化酶和抗菌活性，但表皮中是何種成分發(fā)揮免疫抑制的關(guān)鍵作用尚不清楚。

2.2.4 異小桿屬線蟲分泌蛋白的致病性 隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和組學(xué)的出現(xiàn)，線蟲在侵染早期的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與基因組[57]和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相結(jié)合，闡明可能參與致病的特定基因或基因家族。Adhikari等[58]通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究檢測到H.bacteriphohora與寄主相互作用中，分泌或排泄的一些潛在分子與毒力相關(guān)的基因表達模式，推測這些分泌物在昆蟲寄生和抑制寄主防御機制中發(fā)揮重要作用。Vadnal等[59]對H.bacteriophoraIJs在煙草天蛾幼蟲血淋巴中孵育9 h后進行了轉(zhuǎn)錄組測序，使用qRT-PCR驗證了上調(diào)和下調(diào)的基因亞群，揭示了一系列候選寄生基因。Moshayov等[60]將H.bacteriophora在大蠟螟體內(nèi)孵育，通過反轉(zhuǎn)錄、構(gòu)建抑制性消減雜交文庫及表達序列標(biāo)簽等分子生物學(xué)方法鑒定出寄生期間高表達的23個基因。Hao等[61]在H.bacteriophora中鑒定出凝集素、金屬蛋白酶、烯醇化酶、幾丁質(zhì)酶、表面相關(guān)抗原等與寄主昆蟲互作的相關(guān)基因，分別在逃避寄主免疫和寄主組織降解等過程中發(fā)揮作用。

線蟲在侵染寄主昆蟲的后期分泌毒性因子作用于寄主昆蟲[62]，如表2。異小桿屬H.bacteriophora在寄主體內(nèi)分泌特定類型的胞外蛋白酶選擇性地降解昆蟲的抗菌蛋白——天蠶抗菌肽（cecropin），使寄主抗菌免疫失活，促進共生細(xì)菌P.luminescens在昆蟲體腔內(nèi)定殖[63,64]。H.bacteriophora線蟲分泌物通過抑制黑腹果蠅的 Imd（Immune deficiency）通路促進共生細(xì)菌侵染[65]，產(chǎn)生的 UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransferase）抑制昆蟲蛻皮激素的活性及抗菌肽基因表達[66]，絲氨酸羧肽酶（Serine carboxypeptidase）和無脊椎動物型溶菌酶 （lysozyme）等引起昆蟲黑化、細(xì)胞反應(yīng)、抑制抗菌肽合成[67]。Eliá?等[68]研究表明H.bacteriophora侵染期線蟲分泌蛋白抑制寄主的酚氧化酶活性，純化篩選出38 kDa的肽段被鑒定為酚氧化酶抑制化合物的主要候選來源，通過質(zhì)譜和重測序方法進一步分析，在這一活性ESP片段中鑒定了6個肽序列，包括參與泛素化和免疫通路調(diào)控的蛋白質(zhì)；Noguez等[69]研究表明由H.bacteriophora線蟲產(chǎn)生的小分子信息素可以調(diào)控線蟲的生長發(fā)育進而促進毒性發(fā)揮。

表2 已被鑒定的H.bacteriphohora分泌的蛋白及其功能Table 2 The secreted protein and its functions of H.bacteriphohora identified

異小桿屬線蟲H.bacteriophora分泌的蛋白中調(diào)節(jié)寄主免疫蛋白的分子鑒定及功能已經(jīng)明確，但分泌蛋白中發(fā)揮毒性作用的關(guān)鍵蛋白尚不清楚，關(guān)于異小桿屬線蟲分泌蛋白的組學(xué)分析尚未見報道。

3 展望

本文綜述了廣泛研究的斯氏屬和異小桿屬線蟲致病機理方面的研究成果，例證除了共生細(xì)菌對昆蟲發(fā)揮致病作用外，昆蟲病原線蟲自身還能通過兩種方式促進昆蟲致?。呵秩炯闹髟缙?，通過表皮復(fù)合物抑制寄主免疫，為線蟲和攜帶的細(xì)菌分泌物的釋放創(chuàng)造合適的血淋巴環(huán)境；當(dāng)線蟲到達寄主血腔后，通過分泌具有免疫調(diào)節(jié)的蛋白破壞寄主組織或具有毒性的蛋白殺死寄主。因此，線蟲通過分泌多種有活性的毒性物質(zhì)致死寄主，而不是歸因于任何單一的分泌產(chǎn)物的作用。但目前仍然有許多問題值得深入研究，如線蟲分泌蛋白的靶標(biāo)蛋白和具體功能，分泌蛋白的具體來源及作用途徑尚不清楚；在生物防治應(yīng)用實踐中，能否利用現(xiàn)代分子生物學(xué)對已挖掘的線蟲寄生基因進行遺傳改良以提升線蟲的生物防治效果[70]。昆蟲病原線蟲在環(huán)境中面臨著各種生物和非生物因素的干擾，環(huán)境生物因素包括同類線蟲、共生細(xì)菌、寄主昆蟲、寄生真菌以及其他昆蟲病原等；環(huán)境非生物因素主要有土壤類型、溫濕度、鹽度、紫外線等[71]。昆蟲病原線蟲在不同逆境中對寄主昆蟲的致病過程中毒素蛋白是否也發(fā)揮著作用還是空白。因此需要深入研究昆蟲病原線蟲的致病機制，尤其是毒性蛋白的深入研究將備受關(guān)注，包括毒性蛋白的分離、鑒定、合成、功能驗證、殺蟲機制及應(yīng)用潛力等。毒性蛋白方面的研究將不僅有助于理解侵染期線蟲寄生機制以及線蟲與寄主的互作機制，而且將提高對昆蟲免疫知識的認(rèn)知，也將為設(shè)計新的生物殺蟲劑提供新材料，對害蟲高效生物防治具有重要的促進作用。