江美蓮

（池州市動物疫病預(yù)防與控制中心 247100）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，近年來動物疫病實(shí)驗(yàn)室檢測能力進(jìn)一步提升，動物疫病監(jiān)測工作在高致病性禽流感、非洲豬瘟等重大動物疫病防控工作中所起到的作用愈發(fā)明顯。基層動物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)通過疫病監(jiān)測工作的開展，能及時(shí)掌握轄區(qū)內(nèi)畜禽某種病原感染和分布情況，發(fā)現(xiàn)疫病傳播的風(fēng)險(xiǎn)因素，評估畜禽群體免疫效果，有效控制相應(yīng)動物疫病的發(fā)生與發(fā)展。而樣品采集工作是動物疫病監(jiān)測中至關(guān)重要的環(huán)節(jié),是實(shí)驗(yàn)室檢測工作的基礎(chǔ)，最終影響監(jiān)測結(jié)果的可信度以及能否反映出當(dāng)?shù)貏游镆卟〉恼鎸?shí)情況。因此，采樣人員務(wù)必要掌握正確的樣品采集方法，規(guī)范使用采樣器具，明確采樣注意事項(xiàng)，安全保存和運(yùn)輸，確保待檢樣品的有效性。

1 樣品種類

動物疫病監(jiān)測常用樣品主要可歸納為血液、組織和拭子三大類。其中血液樣品又分為全血抗凝血、抗凝血漿和非抗凝血析出的血清；組織樣品有實(shí)質(zhì)器官、淋巴結(jié)、扁桃體以及皮膚等；拭子樣品主要有沾取呼吸道分泌液的口腔/喉氣管棉拭子、獲取糞便的泄殖腔（肛）棉拭子、病患部水泡液拭子以及環(huán)境棉拭子等。不同種類的樣品采集時(shí)操作技術(shù)要點(diǎn)也有所差別。

2 采樣原則

采樣人員在采集樣品時(shí)，需要遵循以下原則：一是采集的樣品必須具有足夠的代表性；二是要根據(jù)檢測項(xiàng)目和內(nèi)容來選擇相應(yīng)的采樣時(shí)間；三是采樣過程中要嚴(yán)防造成環(huán)境污染和疫病傳播擴(kuò)散。天然孔流血、血凝不良的病死動物，首先應(yīng)采取耳尖血涂片，排除炭疽，要做好個(gè)人防護(hù)，做好環(huán)境消毒和廢棄物處理，嚴(yán)防病原擴(kuò)散。

2.1 保障樣品的代表性

采集樣品必須要考慮樣品是否具有代表性，充分展示目標(biāo)群體特性，抽樣調(diào)查是借助于抽樣數(shù)據(jù)來分析總體情況。在實(shí)際采樣的過程中，采樣人員要充分考慮待監(jiān)測區(qū)的布局、動物種類、數(shù)量、遷徙習(xí)慣、流通情況等因素，通過建立代表監(jiān)測點(diǎn)，來了解總體情況，根據(jù)疫病流行規(guī)律、監(jiān)測目標(biāo)、采樣方法等進(jìn)行采集。隨著實(shí)驗(yàn)室檢測檢驗(yàn)技術(shù)的不斷改進(jìn)和發(fā)展，技術(shù)創(chuàng)新層出不窮，采樣人員在樣品采集之前，要充分了解檢驗(yàn)相關(guān)要求，有針對性地采集相應(yīng)樣品。

2.2 保證樣品的時(shí)效性

采樣前，必須考慮采樣的目的，根據(jù)需要檢測的項(xiàng)目和內(nèi)容，選擇最恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)進(jìn)行樣品采集。例如，目前動物疫病監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室主要是抗體檢測和病原檢測，這兩種物質(zhì)會隨時(shí)間產(chǎn)生變化。在注射疫苗或感染病原后，機(jī)體內(nèi)不同時(shí)期抗體或病原濃度有較大差距，進(jìn)而導(dǎo)致監(jiān)測數(shù)值出現(xiàn)變化。死亡的動物尸體腐敗速度受外界環(huán)境如溫度等因素影響較大，病料采集時(shí)間要求較嚴(yán)。動物機(jī)體狀況瞬息萬變，檢測結(jié)果僅代表樣品采集當(dāng)時(shí)動物的身體情況，因此要注意監(jiān)測結(jié)果的修復(fù)和整理，提升疫病監(jiān)測的準(zhǔn)確度。

3 動物疫病監(jiān)測采樣技術(shù)要點(diǎn)

3.1 器械工具

包括采樣箱、保溫箱或者保溫瓶、一次性注射器（針頭）、解剖刀、剪刀、鑷子、酒精燈、酒精棉、碘酒棉、棉簽、玻片、無菌棉拭子、試管架、冰袋等采樣用品；離心管、平皿、塑料瓶、樣品自封袋、塑料包裝袋等樣品容器；記號筆、簽字筆、標(biāo)簽、封條、膠布、采樣單等采樣記錄用品；以及根據(jù)需要可能用到的阿氏液、PBS 液、30%甘油鹽水緩沖液、肉湯和雙抗等保存液；此外，還需配備口罩、防護(hù)鏡、一次性手套、乳膠手套、防護(hù)服、膠靴等人員防護(hù)用具。

3.2 血液樣品采集

3.2.1 采集部位

基層實(shí)際工作中常見動物采血部位：禽類進(jìn)行常規(guī)免疫抗體監(jiān)測時(shí)，通常選擇翅下靜脈；小豬采血一般選擇前腔靜脈，大豬或成年母豬較難保定，前腔靜脈采集對采樣人員技術(shù)嫻熟性要求較高，可使用一次性真空采血管采集耳靜脈血；牛、羊通常選擇頸靜脈。

3.2.2 全血（抗凝血）樣品

使用一次性注射器抽取合適位置的靜脈血，血液采集完成后及時(shí)加入抗凝劑，充分混合，防止血液出現(xiàn)凝固現(xiàn)象；或者使用一次性帶管針頭插入靜脈后，直接連接負(fù)壓醫(yī)用抗凝管收集。輕柔緩慢旋轉(zhuǎn)晃動，將收集的抗凝血混合均勻，靜置一段時(shí)間，可得上清血漿。

3.2.3 血清（非抗凝血）樣品

不添加任何抗凝劑，使用一次性注射器直接采集血液樣品2～5mL，夏天室溫下傾斜靜置30～50min，冬天室溫下傾斜靜置2～4h，也可37℃下靜置40～50min，血液凝固后析出上清血清，3000r/min 離心5min 左右，將血清移入塑料離心管中，4℃保存待用。但若需保存較長時(shí)間，則要凍結(jié)保存于-20℃左右的環(huán)境中。

3.3 組織樣品采集

3.3.1 皮膚樣品

采集皮膚樣品一般選擇病變最典型處連同周邊健康部分一起。例如，進(jìn)行口蹄疫病毒檢測時(shí)，可選取新鮮的結(jié)痂或水泡皮，使用清水對采集部位進(jìn)行沖洗，剪取3～5g 的份量采集完整的結(jié)痂和完整水泡，或者用無菌注射器吸取不少于1mL 的水泡液，將樣品放進(jìn)事先加入50%甘油或者磷酸鹽緩沖液的滅菌瓶中，蓋上蓋子密封瓶口。同種同群動物一般采集3～5 頭病畜，樣品采集完成后要及時(shí)進(jìn)行冷凍保存。

3.3.2 實(shí)質(zhì)器官

采樣前對解剖刀具等進(jìn)行徹底消毒，采樣過程中如果器械工具被污染，要使用酒精燈進(jìn)行火焰消毒。按照由上到下、從外到內(nèi)、胸腔到腹腔的順序?qū)⑿枰臉悠芬来尾杉?，樣品放置于一次性塑料滅菌袋或自封袋中，密封袋口，用記號筆對動物種類、組織名稱、采樣日期、編號等內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，每一個(gè)樣品單獨(dú)放置，避免交叉感染。

3.3.3 牛、羊腦

使用消毒后的剪刀從病死牛（羊）枕骨大孔處將腦硬膜剪開，向枕骨大孔中伸入食指，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)一圈，將腦髓與腔壁相連的神經(jīng)、血管等有效切斷，進(jìn)而能順利地挖出腦髓。然后抽出食指，貼著枕骨大孔腔壁將采樣勺插進(jìn)去，按照大約牛腦5～7cm、羊腦4cm 的標(biāo)準(zhǔn)控制插入深度，抽回采樣勺，將腦組織往外挖出，即可完整取出延腦。

3.4 拭子樣品采集

3.4.1 禽口腔/泄殖腔拭子

對禽類進(jìn)行高致病性禽流感等病原檢測時(shí)一般采集口腔（喉氣管）和泄殖腔拭子樣品。具體操作是一手固定禽頭頸，使其口腔張開，一手持經(jīng)過消毒滅菌的棉拭子從禽口腔向咽的后部插入，擦拭、旋轉(zhuǎn)后取出，放置于加入緩沖液的離心管中；一手提起尾羽，一手拿著棉拭子插入泄殖腔內(nèi)，深度約在1～5cm 之間，輕輕旋轉(zhuǎn)后抽出，將沾有泄殖腔黏膜表層的糞便、組織的棉拭子放入含有約2mL PBS 液的離心管中。折斷棉棒，蓋上離心管蓋子，確定密封好無滲漏，做好標(biāo)記，保存于低溫環(huán)境中。

3.4.2 牛羊O/P 液

口蹄疫病原檢測經(jīng)常采集此樣品。采樣前，將探杯浸泡在1%氫氧化鈉溶液或0.2%檸檬酸溶液中3～5min，然后用與待采樣動物體溫接近的清水沖洗探杯。對動物進(jìn)行保定處理，在動物吞咽時(shí)向食道5～10 cm 處插入探杯，來回抽動2～3 次后拉出探杯，即可采集到5～10mL 的O/P 液[1]。將采集到的O/P 液倒入含有磷酸緩沖液或者等量細(xì)胞培養(yǎng)液的滅菌瓶中，搖晃均勻后封口保存。每采集完成一頭動物，均要徹底消毒、沖洗探杯，避免動物交叉感染以及食道灼傷。

3.4.3 環(huán)境拭子

用生理鹽水浸濕無菌棉拭子后，在環(huán)境（物品）表面按“Z”字形軌跡畫線，邊畫邊旋轉(zhuǎn)棉拭子接觸面，連續(xù)數(shù)次，畫線區(qū)域盡可能覆蓋環(huán)境（物品）界面，面積越大，采集到病原的機(jī)會越大，采集完成后將棉頭放入潔凈的1.5mL 離心管中，加入保存液，折斷棉簽桿，蓋緊蓋子，做好標(biāo)記。通常一個(gè)離心管中放2 個(gè)棉拭子。

4 樣品采集過程中常見問題

4.1 樣品的真實(shí)性存疑

由于對動物疫病監(jiān)測工作的意義和作用認(rèn)識不夠，部分基層畜牧獸醫(yī)工作者遇到例如養(yǎng)殖場（戶）不配合，擔(dān)心畜禽產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，不利于生長等困難；或者采樣技術(shù)不嫻熟，難以順利采集足夠的樣品等情況時(shí)，為了完成采樣任務(wù)數(shù)量，可能會出現(xiàn)將一個(gè)樣品分成好幾份的情況，那么樣品的代表性和真實(shí)性就出現(xiàn)了偏差。

4.2 血液樣品的質(zhì)量不過關(guān)

實(shí)際采樣工作中，血清樣品會因?yàn)椴裳窟^少，分離出的血清量達(dá)不到檢測需求，或者反復(fù)凍融等原因造成質(zhì)量下降。血液樣品時(shí)常會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，其產(chǎn)生原因可能有以下幾種，一是采血技術(shù)不熟練，針尖在血管中反復(fù)進(jìn)出造成血腫，在血腫的地方抽取血液；二是排血到容器中速度過快致使紅細(xì)胞破裂；三是采血的注射器或容器受到了污染；四是采血之后沒有對樣品進(jìn)行適當(dāng)溫度保存或者沒有及時(shí)送到實(shí)驗(yàn)室處理；五是血樣容器放置不穩(wěn)傾倒了或者在送樣的過程中受到了震蕩[2]。

4.3 組織樣品采集不規(guī)范

對病料組織進(jìn)行樣品采集時(shí)，沒有選擇特定部位，采集的樣品沒有代表性；動物死亡后間隔了太長時(shí)間才進(jìn)行采樣，采集到的組織樣品已腐敗變質(zhì)，被其他物質(zhì)或病原等污染；不按規(guī)定量采集病理組織，樣品體積太大或過?。徊杉粍游矬w的不同組織樣品時(shí)，將所有病料混在一起，沒有獨(dú)立封裝、存放。

4.4 其他問題

沒有進(jìn)行必要的采樣前準(zhǔn)備工作，樣品采集所需器具、防護(hù)用品等有遺漏，或者未攜帶采樣登記表；棉拭子樣品采集過程中，沒有在塑料離心管中加入保存液；離心管的蓋子沒有蓋（擰）緊，液體滲漏出來，造成交叉污染；樣品編號不規(guī)范，采樣登記表記錄不詳細(xì)，例如畜禽日齡、免疫情況等信息填寫不全，后期難以追溯。

5 動物疫病監(jiān)測采樣注意事項(xiàng)

5.1 采樣全程需無菌操作

樣品采集所用到的器械、工具等均要求無菌，用于儲存樣品的容器必須保證完好無損，并且密封性好，采集過程滿足無菌操作要求。采樣人員務(wù)必注意做好個(gè)人防護(hù)，穿防護(hù)服，佩戴口罩、手套、鞋套，防止操作過程中接觸病原，造成生物學(xué)安全事故。需要剖解后采集內(nèi)臟器官等組織樣品時(shí)，遵循從胸腔到腹腔的順序進(jìn)行，先采用無菌的方式采集動物的實(shí)質(zhì)器官，避免受到外界的污染，后采集胃腸和糞便等可能受到污染的組織[3]。

5.2 樣品的數(shù)量和質(zhì)量要符合要求

要結(jié)合監(jiān)測目標(biāo)、監(jiān)測方案及實(shí)驗(yàn)室的檢測能力等多種因素，根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)采集適當(dāng)?shù)臉悠窋?shù)量，提升有效性、滿足檢測需求的同時(shí)，還要留出備用量，防止做必要的重復(fù)檢測時(shí)分量不足。

為保證血液樣品質(zhì)量，采樣時(shí)需注意：如果使用的是一次性真空管，采血過程中血液應(yīng)不間斷地流入管中，一旦血流間斷，則要另換管，否則不易析出血清；使用一次性注射器采血結(jié)束后，如果血液暫存注射器內(nèi)，要將活塞緩慢拉出液面一段距離，中間留有一段空氣；如果將血液從注射器移入試管，要沿著試管壁緩慢徐徐注入，不能有氣泡，也不能震蕩，傾斜靜置。

5.3 注意樣品種類和時(shí)效

要根據(jù)檢測目標(biāo)有針對性地選擇相應(yīng)時(shí)間段來進(jìn)行樣品采集。①病原監(jiān)測。要根據(jù)不同種類病原特性、發(fā)病動物臨床癥狀、是否進(jìn)行過治療以及曾經(jīng)有無發(fā)病史等情況綜合考慮，選擇相應(yīng)的時(shí)間和部位進(jìn)行樣品采集?；铙w動物一般采集其血液、乳汁、口鼻及生殖道分泌物等；死亡動物，采樣需越快越好，特別是氣溫較高的夏天，其內(nèi)臟病料不能超過6h，氣溫較低的冬天也不要超過24h，時(shí)間耽擱得越長，越容易產(chǎn)生不合格樣品。②抗體監(jiān)測。根據(jù)不同疫苗注射后在機(jī)體產(chǎn)生抗體的濃度選擇適當(dāng)?shù)牟蓸訒r(shí)間。例如，禽流感、口蹄疫一般選擇在免疫21d后進(jìn)行；豬藍(lán)耳病則選擇在免疫28d 后再進(jìn)行[4]。需要注意的是采血之前最好讓待采動物禁食8h 左右。

5.4 樣品的保存和運(yùn)輸

采樣完成后，樣品要遵循嚴(yán)格的保存和運(yùn)輸規(guī)定，否則，很可能造成樣品失效。原則上，一種樣品只能裝置在一個(gè)容器里，并且要及時(shí)地密封。如果用的是塑料袋，保險(xiǎn)起見，最好使用兩個(gè)，且兩個(gè)袋子都要封口，防止樣品漏出。采樣時(shí)如果氣溫較高，須配備冷藏設(shè)備；若時(shí)間短距離不遠(yuǎn)的話，可用冰袋降溫。按照相應(yīng)的存放要求及檢測目的，及時(shí)運(yùn)送到檢測機(jī)構(gòu)。比如，需要進(jìn)行細(xì)菌檢測或者寄生蟲檢測的樣品，冷藏后需要在24h 內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室檢測；需要檢測病毒的組織或棉拭子樣品，需在數(shù)個(gè)小時(shí)內(nèi)運(yùn)送到檢測室；血液樣品如果現(xiàn)場沒有條件分離血清，必須在24h 內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理、保存，若無法及時(shí)送檢，就要保證一直處于-20℃的冷凍環(huán)境中。在保存和運(yùn)輸樣品時(shí)要避免光照、震動等因素，最大限度地進(jìn)行平穩(wěn)運(yùn)輸，確保其完整及穩(wěn)定性。

6 結(jié)語

樣品采集是基層動物疫病防控工作者常態(tài)化、基礎(chǔ)性的工作，如果采集過程不規(guī)范，用于實(shí)驗(yàn)室檢測的樣品的代表性和針對性不能保證，動物疫病監(jiān)測工作的推進(jìn)將會受到很大影響。動物疫病預(yù)防控制等相關(guān)部門應(yīng)該加大經(jīng)費(fèi)投入，加強(qiáng)培訓(xùn)，組織相關(guān)人員學(xué)習(xí)并掌握樣品采集的操作技術(shù)流程和注意事項(xiàng)，保障樣品質(zhì)量，以利于有關(guān)工作的進(jìn)一步開展。