包 錚 ， 賀 莉*， 李 悅， 宋亞莉

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部沼氣科學(xué)研究所， 四川 成都 610041; 2.四川省農(nóng)業(yè)援外辦公室， 四川 成都 610041)

厭氧發(fā)酵(AD)是處理糞便、秸稈、餐廚垃圾等有機(jī)廢棄物的主要利用方式之一，沼氣是AD體系中微生物代謝的產(chǎn)物，它是由有機(jī)底物的分解形成的[1-3]。分解過(guò)程可分為3個(gè)階段：水解階段、酸化階段和產(chǎn)甲烷階段，在每個(gè)階段都有不同的微生物組參與分解過(guò)程[4]。

在厭氧發(fā)酵第1階段，需氧細(xì)菌利用酶將大分子有機(jī)底物(蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、纖維素)轉(zhuǎn)化為分子量較低的化合物(如糖、氨基酸、有機(jī)酸和水)，水解細(xì)菌分離的酶附著在細(xì)菌的外壁上，將底物中的有機(jī)成分分解成小的可溶性成分，聚合物被轉(zhuǎn)化為低聚物和單體，這一過(guò)程即水解。水解過(guò)程依賴于細(xì)胞外酶(如纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶)，該過(guò)程受到4.5～6.0的pH值水平以及罐內(nèi)時(shí)間的影響。在厭氧發(fā)酵的第2階段，產(chǎn)酸菌進(jìn)行裂解，第1階段產(chǎn)生的單個(gè)分子進(jìn)入產(chǎn)酸菌的細(xì)胞，在那里繼續(xù)分解，同時(shí)，部分厭氧細(xì)菌利用氧殘基和形成厭氧微生物所需的厭氧條件也參與了該發(fā)酵過(guò)程。在pH值為6.0～7.5時(shí)，該體系主要產(chǎn)生一些揮發(fā)性脂肪酸和低分子量醇等物質(zhì)，如乙酸、乙醇、二氧化碳、硫化氫和氨等，這一過(guò)程被稱為酸化(或氧化)。同時(shí)，該過(guò)程會(huì)導(dǎo)致pH值的水平降低。在第3階段，產(chǎn)甲烷菌將乙酸、甲醇等物質(zhì)轉(zhuǎn)化為甲烷為主的物質(zhì)，一種方式是利用乙酸產(chǎn)生甲烷，另一種方式是在二氧化碳存在時(shí)利用氫氣生成甲烷，這個(gè)階段的菌群對(duì)溫度非常敏感[5]。有機(jī)廢棄物在厭氧微生物的作用下，經(jīng)過(guò)3個(gè)階段的分解轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生甲烷、氫氣等氣體可被用作清潔能源，揮發(fā)性脂肪酸、甲醇、可溶性糖等中間代謝產(chǎn)物可被用作工廠原料，以及最后剩余的沼渣經(jīng)處理后可以被用作有機(jī)肥[6]。AD不僅解決了環(huán)境污染的問(wèn)題還為社會(huì)帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)效益。

1 VFAs在AD體系中的作用

在整個(gè)AD過(guò)程中，VFAs是厭氧發(fā)酵過(guò)程中一類重要的中間代謝產(chǎn)物，正常的AD體系中VFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，其濃度范圍比較低且較穩(wěn)定，約有70%的產(chǎn)甲烷菌都是利用VFAs來(lái)進(jìn)行產(chǎn)甲烷過(guò)程。但是一般厭氧發(fā)酵體系中有機(jī)質(zhì)的含量較高，在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)容易有酸積累的現(xiàn)象發(fā)生，即當(dāng)VFAs濃度在6.7～9.0 mol·m-3時(shí)會(huì)造成微生物細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡失調(diào)，進(jìn)而抑制產(chǎn)甲烷產(chǎn)生，嚴(yán)重影響產(chǎn)甲烷過(guò)程的正常進(jìn)行，當(dāng)體系中的酸積累現(xiàn)象過(guò)于嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)辜?xì)胞失活，直接導(dǎo)致厭氧發(fā)酵的失敗[7-8]。VFAs的含量變化不僅能夠判斷AD過(guò)程是否順利進(jìn)行，而且可以間接觀察到AD過(guò)程中微生物的活性變化，因此，對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)非常必要。

目前，較為傳統(tǒng)的VFAs測(cè)定方法有比色法和滴定法[9]。這些傳統(tǒng)方法存在耗時(shí)耗力的缺點(diǎn)，在科技飛速發(fā)展的社會(huì)，比色法已逐漸淡出研究者們的視野。取而代之的是操作更簡(jiǎn)便、精度更高的電子儀器設(shè)備，例如氣相色譜 (GC)法、高效液相色譜法(HPLC)、中紅外光譜法(MIRS)、近紅外光譜法(NIRS)和生物傳感器[10-13]法。

2 AD體系中VFAs檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

2.1 滴定法

傳統(tǒng)滴定法的原理是在堿性條件下通過(guò)蒸餾分離出溶液中存在的氨氮，再在酸性環(huán)境中收集純度較高的VFAs，利用堿性溶液進(jìn)行標(biāo)定，通過(guò)消耗的體積計(jì)算VFAs的含量[14]。滴定法成本低、操作簡(jiǎn)單，但是需要前處理、耗時(shí)長(zhǎng)、不能在現(xiàn)場(chǎng)使用，在取樣和蒸餾過(guò)程中可能會(huì)損失掉部分VFAs，降低了結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，有研究發(fā)現(xiàn)滴定結(jié)果會(huì)受厭氧發(fā)酵環(huán)境中存在各種弱酸根離子以及溶液固體含量等因素的影響，使滴定結(jié)果出現(xiàn)誤差[15]。為此，許多研究學(xué)者通過(guò)簡(jiǎn)化處理步驟、改變?nèi)芤涵h(huán)境、選擇適當(dāng)?shù)牡味ńK點(diǎn)等方法優(yōu)化改進(jìn)建立新型滴定法[16]。例如，在分析VFAs與樣品離子干擾體系以及總固體之間的關(guān)系時(shí)，結(jié)合GC法和簡(jiǎn)化滴定步驟后的Nordmann滴定法測(cè)得VFAs化學(xué)值。滴定過(guò)程得到簡(jiǎn)化，結(jié)果差異性也有明顯的降低，但是依然需要專門的儀器設(shè)備，不利于實(shí)際發(fā)酵工程中的分析比較[17]。Nativ[18]等人利用模擬溶液開發(fā)了一種改進(jìn)的兩點(diǎn)滴定法，VFAs在較高的濃度范圍內(nèi)受到磷酸鹽等弱酸離子的影響可以忽略不計(jì)。同時(shí)，還使用外部分析法，即利用PHRREQC程序通過(guò)總無(wú)機(jī)碳的濃度預(yù)測(cè)VFAs的變化趨勢(shì)。此法減少了滴定步驟、提高了結(jié)果的精確度，但是操作環(huán)境較為嚴(yán)格、對(duì)探頭靈敏度以及標(biāo)準(zhǔn)樣品精度的要求較高。

2.2 GC法

氣相色譜儀的原理是樣品在進(jìn)樣器中經(jīng)過(guò)高溫處理后以氣體的形式被載氣攜帶進(jìn)入毛細(xì)色譜柱，各組分在載氣的沖洗下由于沸點(diǎn)、吸附系數(shù)等不同依次被分離出來(lái)，進(jìn)入檢測(cè)器后根據(jù)給出的信號(hào)被記錄成不同的色譜峰，通過(guò)峰面積和峰高來(lái)進(jìn)行定量和定性分析[19]。GC法所需樣品量小、靈敏度較高、適用范圍大，VFAs有較強(qiáng)的吸附性且極性較高，加上AD體系較為復(fù)雜，含有很多干擾因素，產(chǎn)生的色譜峰容易出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，可以對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理(如萃取、酯化)、選擇合適的極性柱以及改變GC升溫程序等方法來(lái)改善此類問(wèn)題[20-21]。此外，VFAs屬于弱酸，具有易揮發(fā)的特點(diǎn)，需要對(duì)溶液環(huán)境進(jìn)行酸化以確保測(cè)定時(shí)是分子的狀態(tài)，同時(shí)，在VFAs測(cè)定完之后及時(shí)清理進(jìn)樣針和色譜柱以避免造成污染和堵塞[22]。Ward[23]等對(duì)VFAs的4種監(jiān)測(cè)方法(微氣相色譜、薄膜進(jìn)樣質(zhì)譜、近紅外光譜以及pH值)進(jìn)行中試研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)薄膜進(jìn)樣質(zhì)譜需要頻繁清洗以及背景測(cè)量，不適用于長(zhǎng)期測(cè)量，除此之外的其他3種方法都具有較高的準(zhǔn)確性和低頻率維護(hù)的優(yōu)點(diǎn)。Ullah[24]等比較了直接注射和熱解吸兩種樣品運(yùn)載方式對(duì)GC測(cè)定性能的影響，發(fā)現(xiàn)熱解吸方式更好地抑制一些基質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 HPLC法

高效液相色譜技術(shù)是一種高效液相色譜儀的分離技術(shù)，原理主要是溶液中各組分在兩相運(yùn)動(dòng)中具有不同的分配系數(shù)，導(dǎo)致在反復(fù)分配過(guò)程中各組分的移動(dòng)速度具有明顯差距，進(jìn)而被依次分離流出[25]。受固定相的影響可分為固-液吸附色譜、液-液分配色譜、離子交換色譜以及凝膠色譜[26-27]。Mesquita[28]等使用帶有二極管陣列的紫外檢測(cè)器和離子排斥柱的液相色譜系統(tǒng)對(duì)厭氧消化系統(tǒng)中的VFAs進(jìn)行測(cè)定，比較純?nèi)芤汉蛯?shí)際發(fā)酵溶液的HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn)VFAs的色譜峰的分辨率受溶液環(huán)境的干擾程度可以忽略不計(jì)，分析檢測(cè)限、線性、重復(fù)性、基質(zhì)效應(yīng)等結(jié)果表現(xiàn)出7種VFAs都具有良好的獨(dú)立性以及較高的精確性。Peu[29]等利用配有紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器以及陽(yáng)離子交換柱的HPLC，在流動(dòng)相的作用下分離標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品中的VFAs，通過(guò)分析峰面積之間的關(guān)系建立了豬糞中6種VFAs的HPLC測(cè)定方法。

2.4 MIRS法

MIRS法是物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)在中紅外光譜區(qū)(4000～400 cm-1或者2500～25000 nm)發(fā)生基頻或倍頻吸收產(chǎn)生特征性的吸收峰，從而進(jìn)行物質(zhì)的定性或定量分析[30]。經(jīng)過(guò)預(yù)處理以及特征光譜提取后的MIRS模型可以有效的監(jiān)測(cè)AD過(guò)程，但是復(fù)雜的AD體系會(huì)使過(guò)濾器極易發(fā)生堵塞，導(dǎo)致相應(yīng)的裝置不能及時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析[31]。研究學(xué)者通過(guò)改進(jìn)MIRS裝置如使用光纖探測(cè)器的方法解決類似的問(wèn)題。Falk[32]等開發(fā)了一種基于偏最小二乘法ATR-MIR-FTIR設(shè)備，可以實(shí)現(xiàn)樣品提取、光譜記錄以及光譜分析的自動(dòng)化， 達(dá)到了AD體系中6種單組分VFAs的快速定量分析的目標(biāo)，設(shè)備帶有的傳感系統(tǒng)幾乎不需要維修。同時(shí)，污泥造成的淤積問(wèn)題也通過(guò)增加轉(zhuǎn)速器攪拌時(shí)間得到有效解決。Li[33]等改進(jìn)采樣方式、增加沖洗頻率以降低堵塞問(wèn)題的發(fā)生概率，用液相色譜法得到的化學(xué)值與中紅外光譜建立了基于偏最小二乘法模型，該模型能夠測(cè)定乙酸、丙酸等單組分的含量，且成功的應(yīng)用于中試體系中。

2.5 NIRS法

近紅外光譜(NIRS)技術(shù)是指利用近紅外光譜區(qū)(12500～4000 cm-1或800～2500 nm)所包含的物質(zhì)信息進(jìn)行有機(jī)物質(zhì)的定性或定量的檢測(cè)技術(shù)[34]。NIRS主要有透射式、漫透式和漫反射式3種采集方式，需根據(jù)不同待測(cè)物或者環(huán)境的變化選擇合適的采集技術(shù)。NIRS模型的效果一般通過(guò)相關(guān)系數(shù)(R2)、均方根誤差(RMSE)和殘差預(yù)測(cè)偏差(RPD)3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估[35]。越來(lái)越多的學(xué)者研究NIRS對(duì)AD中VFAs等多種參數(shù)的監(jiān)測(cè)能力，例如，有研究利用傅里葉變換近紅外光譜法結(jié)合偏最小二乘法(PLS)建立了污水污泥系統(tǒng)中的揮發(fā)性脂肪酸、碳酸氫鹽堿度和揮發(fā)性固體的回歸模型，該模型可用于消化池的原料類型改變和水力保留時(shí)間減少的識(shí)別和預(yù)警，以此來(lái)提高污水污泥厭氧消化器的性能[36]。Awhangbo[37]等通過(guò)利用NIRS結(jié)合多塊PLS方法預(yù)測(cè)不同來(lái)源厭氧消化物的VFAs和長(zhǎng)鏈脂肪酸，證實(shí)了可以通過(guò)多個(gè)來(lái)源的協(xié)同作用來(lái)優(yōu)化監(jiān)測(cè)過(guò)程，同時(shí)解決了遠(yuǎn)程探針在厭氧消化中出現(xiàn)的飽和和結(jié)垢問(wèn)題。Stockl[38]等用玉米和青貯牧草進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵池的投料，檢測(cè)AD體系中VFAs、總無(wú)機(jī)碳(TIC)以及VFAs/ TIC等參數(shù)的化學(xué)指標(biāo)，建立并分析了基于PLS的NIRS模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)預(yù)處理后的NIRS模型R2分別0.94、0.97和0.85～0.97，RPD值均在3以上，RMSE與所測(cè)參數(shù)的濃度范圍有關(guān)，3個(gè)指標(biāo)均說(shuō)明模型具有較高的精度，但是不適用于濃度高于校準(zhǔn)模型濃度的樣品。

2.6 生物傳感法

生物傳感器法結(jié)合了生物技術(shù)和物理化學(xué)技術(shù)，將生物活性物質(zhì)作為傳感器的識(shí)別元件，其分子識(shí)別部分所表達(dá)的信號(hào)通過(guò)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，通過(guò)這些信號(hào)分析待測(cè)物質(zhì)的含量[39]。生物傳感器主要包括識(shí)別元件、換能器和信號(hào)輸出裝備構(gòu)成，固定化識(shí)別元件是決定傳感器性能(例如靈敏性、穩(wěn)定性、使用壽命等)的核心因素，根據(jù)材料的特性一般分為酶?jìng)鞲衅?、微生物傳感器和免疫傳感器[40]。研究者們多在識(shí)別元件和換能器材料上對(duì)其進(jìn)行機(jī)理和功能的深度研究，例如傳統(tǒng)的微生物燃料電池(MFC)無(wú)法很好地區(qū)分AD體系中的有機(jī)物質(zhì)和VFAs，Sun[41]等改進(jìn)了此類傳感器，開發(fā)了一種由陽(yáng)極和陰極組成的兩腔室MFC微生物傳感器，兩腔室之間通過(guò)陰離子交換膜(AEM)進(jìn)行物理分離。通過(guò)觀察傳感器對(duì)合成廢水中醋酸鹽的電流響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)電流密度和不同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)乙酸鹽濃度呈一種非線性關(guān)系，并且在醋酸鹽濃度低于40 mM時(shí)，電流密度在設(shè)計(jì)的批次實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間(5 h)達(dá)到最大值，對(duì)于監(jiān)測(cè)乙酸鹽濃度具有一定的可行性。此外，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)葡萄糖等非離子物質(zhì)不能穿過(guò)AEM，所以基本不影響傳感器的性能，但是AEM會(huì)對(duì)丙酸鹽、丁酸鹽和異丁酸鹽有一定的選擇透過(guò)性，對(duì)乙酸鹽濃度的測(cè)定結(jié)果造成一定的偏差，同時(shí)，較高的初始溫度對(duì)微生物的活性有很大的影響，而且在長(zhǎng)期運(yùn)行后陰極表面的微生物生長(zhǎng)也會(huì)影響傳感器的性能。此后，該研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種由陽(yáng)極、陰極和樣品室組成的三腔室MFC傳感器[42]，此傳感器中底物輸?shù)疥?yáng)極室的機(jī)理是濃度擴(kuò)散，醋酸鹽通過(guò)AEM時(shí)受其它離子的干擾導(dǎo)致傳質(zhì)系數(shù)和擴(kuò)散率降低，使得在1 h反應(yīng)時(shí)間得到的結(jié)果偏差較大。與之前的研究相比較，監(jiān)測(cè)的濃度范圍增大，樣品室的添加極大地提高了傳感器的穩(wěn)定性，但是其非線性擬合度較低，制作成本也相對(duì)增加。

3 結(jié)論與展望

本文總結(jié)了6種常用的VFAs測(cè)定方法，滴定法成本低、易操作，一般用于總VFAs的測(cè)定，對(duì)于單個(gè)組分的測(cè)定來(lái)說(shuō)是很難實(shí)現(xiàn)的。GC法是目前相對(duì)而言應(yīng)用最廣泛的方法，缺點(diǎn)在于樣品測(cè)定前需要對(duì)其進(jìn)行消除顆粒、酸化等預(yù)處理，使操作步驟變得較為繁瑣。HPLC法具有靈敏度高、分離效果好、應(yīng)用范圍廣、前處理較為簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但是其分析成本較為昂貴、分析時(shí)間較長(zhǎng)。光譜技術(shù)由于具有無(wú)需預(yù)處理、分析速度快、無(wú)創(chuàng)、方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、石化、醫(yī)藥、食品、聚合物、林業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域，但是光譜技術(shù)受環(huán)境的影響(如溫度、濕度、樣品顆粒大小等)較大，需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)來(lái)降低外界因素的干擾。生物傳感法兼具生物技術(shù)的特異性選擇和物理化學(xué)技術(shù)分析速度快、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)。酶?jìng)鞲衅鬟x擇性好、靈敏度高，但是其敏感元件提煉工序復(fù)雜、造價(jià)高、性能不太穩(wěn)定，微生物傳感器相對(duì)而言性能更穩(wěn)定、造價(jià)低，且不受AD體系中干擾物質(zhì)的影響，但是存在響應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)、選擇性較差的缺點(diǎn)，免疫傳感器制作簡(jiǎn)便、使用壽命長(zhǎng)，缺點(diǎn)在于其選擇性差、所用的敏感元件材料也不易保存?，F(xiàn)在VFAs檢測(cè)方法的研究趨勢(shì)正朝著快速、無(wú)損、低成本、自動(dòng)化的方向發(fā)展，但是許多方法仍存在儀器性能、檢測(cè)時(shí)間、造價(jià)成本等問(wèn)題，希望未來(lái)能夠克服這些困難，真正滿足實(shí)際發(fā)酵工程的VFAs自動(dòng)化在線檢測(cè)。