張瓊果，徐璐，李莉，莊乙君，張秋

作者單位：1海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，a血液凈化中心，b血液內(nèi)科，海南 ?？?570100；2海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液凈化中心，海南 ?？?570100；3海南省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 ?？?570100

腎移植是終末期腎病病人延續(xù)生命的重要手段，然而臨床觀察仍有較多因素可影響腎移植病人的長期生存［1］。研究表明，進(jìn)行移植手術(shù)的病人腫瘤發(fā)病率高于一般人群，主要以皮膚、淋巴組織增生性腫瘤為主，彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最為常見的類型，也是影響病人預(yù)后的重要因素［2］。目前腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL的機(jī)制尚未明確，可能與免疫抑制劑導(dǎo)致EB病毒感染及淋巴細(xì)胞增殖失調(diào)有關(guān)［3］。腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CREPT）是2012年常志杰教授鑒定的人類基因，并證實(shí)該基因在胃癌、直腸癌、肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均存在表達(dá)增高，且其水平與病人預(yù)后存在密切關(guān)系［4-6］。目前CREPT在腎移植術(shù)后DLBCL發(fā)生、發(fā)展中的作用關(guān)系仍較少有研究報(bào)道，其表達(dá)是否與其發(fā)生存在某種關(guān)系仍有待臨床探討。本研究腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL的病人作為研究對(duì)象，分析預(yù)后與CREPT的關(guān)系，旨在為明確DLBCL的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究提供思路，為早期評(píng)估病人病情、預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2013年2月至2019年8月海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院、海南省腫瘤醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院收治的腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL的病人作為研究對(duì)象，納入病例組，以病灶組織作為研究樣本；病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：進(jìn)行腎移植手術(shù)治療，移植手術(shù)資料完整；符合《中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷及治療指南》［7］相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；在院進(jìn)行DLBCL治療，治療資料及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：臨床資料不全者；合并其他腫瘤者；無隨訪數(shù)據(jù)者。醫(yī)院收治腎移植病人共2 104例，其中40例發(fā)生DLB?CL，40例全部納入病例組，另外選擇50例增生性淋巴結(jié)炎組織作為對(duì)照組。所有病人或其近親屬均簽署知情同意書，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 一般資料：性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)。腎移植相關(guān)資料：腎移植年限、EB病毒感染情況、移植腎功能情況。DLBCL相關(guān)情況：發(fā)病位置、B癥狀（不明原因發(fā)熱、盜汗、半年體質(zhì)量下降10%以上）情況、Ann Arboe分期、生發(fā)中心表型、乳酸脫氫酶（LDH）水平、體能評(píng)分（ECOG）［8］等。

1.2.2 CREPT表達(dá)情況 采用免疫組化方法檢測(cè)CREPT的表達(dá)，石蠟包被組織，切片機(jī)制備石蠟切片，切片厚度為4μm，依次浸入二甲苯、降梯度乙醇溶液脫蠟、復(fù)水，切片置入過氧化氫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶，清水沖洗后加入胎牛血清封閉10 min。加入一抗（鼠抗人CREPT單克隆抗體，稀釋倍數(shù)為1∶500，購自美國EPITOMICS公司），濕盒內(nèi)孵育過夜；室溫放置10 min后洗滌，加入二抗工作液（生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液），37℃孵育30 min，洗滌，加鏈霉卵白素工作液，DAB顯色5 min，觀察顯色滿意后自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸分化，再進(jìn)行脫水、透明、封片。采用日本奧林匹斯顯微鏡觀察切片，每張切片選擇5個(gè)高倍鏡視野，CREPT細(xì)胞定位為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，按照染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中不著色記為0分，淺棕黃色記為1分，棕黃色記為2分，棕褐色記為3分；陽性細(xì)胞所占比例<25%記為1分，25%~<50%記為2分，50%~75%記為3分，>75%記為4分，染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積為染色總積分，總分0~3分為低表達(dá)，>3~12分為高表達(dá)。

1.2.3 治療及預(yù)后 參考《中國彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤診斷及治療指南》［7］進(jìn)行治療，按照NCCN淋巴瘤臨床實(shí)踐指南［9］評(píng)估治療效果，治療效果分為完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定、疾病進(jìn)展，其中完全緩解及部分緩解視為治療有效；進(jìn)行隨訪，收集病人總生存期（OS）、無進(jìn)展生存期（PFS），以病理確診當(dāng)日作為隨訪起點(diǎn)，隨訪截止時(shí)間為2021年4月，隨訪以門診復(fù)診、電話隨訪為主，其中OS為病理確診日至任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間；PFS為病理確診日至開始出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展或死亡的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及率表示，組間比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，符合正態(tài)分布的資料以±s表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用logistic多因素分析治療效果的影響因素，采用Ka?plan-Meier法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存時(shí)間及生存率的分析，采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析病人預(yù)后相關(guān)影響因素。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腎移植術(shù)后DLBCL病人CREPT表達(dá)情況CREPT定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，40例腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL病人中，CREPT低表達(dá)者17例，高表達(dá)者23例；50例增生性淋巴結(jié)炎組織中，CREPT低表達(dá)者45例，高表達(dá)者5例，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。詳見圖1。

圖1 腎移植術(shù)后彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）病人腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CREPT）表達(dá)情況（蘇木精-伊紅染色×200）：1A為DLBCL病人CREPT強(qiáng)陽性表達(dá)；1B為增生性淋巴結(jié)炎組織CREPT

2.2 腎移植術(shù)后DLBCL病人CREPT表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性低表達(dá)組及高表達(dá)組病人性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、腎移植年限、移植腎功能、B癥狀情況、ECOG分級(jí)、LDH、生發(fā)中心表型等資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；高表達(dá)組EB活化率高于低表達(dá)組，高Ann Arboe分期病人比例高于低表達(dá)組（P<0.05）。詳見表1。

表1 腎移植術(shù)后DLBCL病人40例CREPT表達(dá)與臨床參數(shù)的相關(guān)性

2.3 DLBCL病人治療情況分析所有病人均進(jìn)行4~6個(gè)療程的利妥昔單抗聯(lián)合化療治療，治療結(jié)束后評(píng)估療效，其中達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)病人36例，無效者4例。多因素分析示，Ann Arboe分期是治療效果的影響因素（P<0.05）。詳見表2。

表2 DLBCL病人40例治療效果的影響因素分析

2.4 CREPT表達(dá)與DLBCL病人預(yù)后的關(guān)系分析截至2021年4月，病人隨訪總時(shí)間為10~96個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為41個(gè)月，兩組PFS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（log-rankχ2=2.25，P=0.133）；CREPT高表達(dá)組病人OS顯著低于低表達(dá)組（log-rankχ2=3.89，P=0.049）。詳見圖2，3。

圖2 腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CREPT）高表達(dá)及低表達(dá)病人無進(jìn)展生存期（PFS）的生存曲線

圖3 腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（CREPT）高表達(dá)及低表達(dá)病人總生存期（OS）的生存曲線

2.5 DLBCL病人預(yù)后的影響因素分析以病人OS、PFS作為因變量，以一般資料、腎移植相關(guān)資料、DLBCL資料、治療情況等資料作為自變量進(jìn)行Cox多因素分析，Ann Arboe分期、治療應(yīng)答情況與PFS回歸相關(guān)（P<0.05）；移植腎功能降低、Ann Arboe分期、ECOG評(píng)分、治療應(yīng)答情況、CREPT表達(dá)情況與OS相關(guān)（P<0.05）。詳見表3，4。

表3 腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL病人40例PFS的影響因素分析

3 討論

腎移植術(shù)后DLBCL的發(fā)生對(duì)病人生存時(shí)間有較大影響，分析其發(fā)生的可能機(jī)制、尋找潛在的標(biāo)志物對(duì)于臨床診治有一定臨床意義。CREPT是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的癌基因，目前認(rèn)為其可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展［10］。本研究結(jié)果顯示，與增殖性淋巴結(jié)相比，DLBCL病人CREPT高表達(dá)率較高，可能與DLBCL的發(fā)生相關(guān)。目前已有較多研究探討了CREPT基因表達(dá)與惡性腫瘤的關(guān)系，但與DLBCL之間的關(guān)系仍較少有研究報(bào)道。結(jié)合DLBCL發(fā)生機(jī)制分析兩者之間的關(guān)系，DLBCL以活躍的細(xì)胞增殖為主要特征，而CREPT是公認(rèn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞凋亡的基因，其表達(dá)增強(qiáng)可能與腫瘤的發(fā)生相關(guān)［11-12］。目前關(guān)于腎移植術(shù)后DLBCL發(fā)生的原因及機(jī)制尚未闡釋清楚，可能與腎移植術(shù)后免疫抑制導(dǎo)致淋巴細(xì)胞激活異常、BK感染相關(guān)［13-14］。本研究中對(duì)比了CREPT高病人及低病人的臨床資料，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)組EB活化率高于低表達(dá)組，高Ann Arboe分期病人比例高于低表達(dá)組，推測(cè)CREPT高表達(dá)可能與EB活化狀態(tài)有一定關(guān)系，而其表達(dá)情況與病人的臨床特征存在一定聯(lián)系，但基因表達(dá)與EB活化的關(guān)系目前無研究報(bào)道，兩者之間的具體作用關(guān)系仍有后續(xù)研究探討。

表4 腎移植術(shù)后發(fā)生DLBCL病人40例OS的影響因素分析

DLBCL病人預(yù)后較差，對(duì)于本身存在免疫力低下的腎移植病人，其預(yù)后受到的影響更多。本研究結(jié)果顯示，腎移植術(shù)后DLBCL病人PFS的影響因素主要為臨床分期及治療反應(yīng)性情況，這一結(jié)果與既往報(bào)道的DLBCL病人預(yù)后的相關(guān)因素類似［15-17］。隨著臨床分期的加深，病人腫瘤大小、病灶數(shù)量增加，治療難度較大，預(yù)后相對(duì)較差；治療效果主要是評(píng)估治療方式下短期療效，但研究表明，近期療效顯著的病人體內(nèi)腫瘤清除較為干凈，術(shù)后復(fù)發(fā)概率較小，有利于提高病人的無進(jìn)展生存期［18］。腎移植術(shù)后DLBCL病人OS的影響因素主要有臨床分期、移植腎功能情況、ECOG評(píng)分、治療應(yīng)答情況、CREPT表達(dá)情況等。腎移植手術(shù)病人術(shù)后需長期服用抗排異反應(yīng)藥物，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，其遠(yuǎn)期的長期生存除與DLBCL病情有關(guān)，也與腎功能、身體狀態(tài)有關(guān)，存在移植腎功能降低的病人遠(yuǎn)期生存較差，ECOG評(píng)分較差的病人身體質(zhì)量較差，對(duì)于化療、治療的耐受性也較差，同樣影響遠(yuǎn)期生存［19］。CREPT與DLBCL病人OS存在一定關(guān)系的原因可能為一方面，表達(dá)情況與病人的臨床特征存在一定關(guān)系，CREPT高表達(dá)病人臨床分期較高，這部分病人治療效果較差；另外，如上文所述，CREPT表達(dá)與BK感染存在一定關(guān)系，而后者是引起B(yǎng)K相關(guān)腎病從而引起腎功能丟失的重要原因［20］，在本研究中CREPT高表達(dá)病人BK感染率較高，遠(yuǎn)期預(yù)后較差。既往較少有研究探討CREPT與DLBCL病人預(yù)后的關(guān)系，劉軍等［21］研究證實(shí)CREPT在腎癌組織中高表達(dá)，且病人總體生存時(shí)間及無瘤生存時(shí)間均與之相關(guān)；Wen等［22］針對(duì)宮頸癌病人的研究也證實(shí)，CREPT與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)，本研究在前人研究結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)。當(dāng)前抗腫瘤藥物研發(fā)成為臨床研究的重點(diǎn)及難點(diǎn)，CREPT作為一種與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)的蛋白，通過調(diào)控其表達(dá)或可抑制腫瘤的進(jìn)展，目前已有降解CREPT多肽抑制劑在胰腺癌細(xì)胞中的應(yīng)用研究，未來可能成為腫瘤新藥研發(fā)的方向。

綜上所述，腎移植術(shù)后DLBCL病人CREPT表達(dá)率較高，且與病人臨床特征、預(yù)后存在一定關(guān)系，或可為腫瘤機(jī)制研究、腫瘤新藥的研究提供新思路。本研究局限性在于本研究納入對(duì)象為腎移植術(shù)后DLBCL的病人，臨床病例較少；另外CREPT與DLBCL臨床特征的相互作用關(guān)系僅為推斷，具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)研究探討。