復(fù)合微生物菌劑對(duì)番茄青枯病的生防效應(yīng)

王文麗,金涵,從炳成,周蕾,韋中,王世梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院/江蘇省固體有機(jī)廢棄物資源化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省有機(jī)固體廢棄物 協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部資源節(jié)約型肥料工程技術(shù)研究中心,江蘇 南京 210095)

番茄是世界上重要的蔬菜作物,全球年產(chǎn)量約1.6億t,由青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的青枯病,對(duì)番茄的破壞性高,常導(dǎo)致番茄植株的大面積枯萎死亡,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因病原菌的遺傳多樣性、耐藥性及廣泛的宿主范圍,用化學(xué)殺菌劑防治的成功率不高。當(dāng)前市場(chǎng)上能防治青枯病的化學(xué)藥劑極少,登記的僅有噻森銅,且化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用也會(huì)對(duì)人類健康和環(huán)境造成許多不利影響[2-3]。近年來(lái),利用有益功能微生物防控青枯病已成為一種安全、可靠的防控方法。功能微生物包括無(wú)致病力的勞爾氏菌、青枯菌噬菌體及拮抗生防菌株[4]。研究表明,無(wú)致病力的勞爾氏菌通過(guò)與青枯菌競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位而抑制病害發(fā)生,但其在田間環(huán)境中難以在根際大量定殖,導(dǎo)致與致病菌的競(jìng)爭(zhēng)力相對(duì)較弱[5]。青枯菌噬菌體能夠靶向控制病原菌,在防控番茄青枯病中亦有應(yīng)用[6],但噬菌體施入土壤后常面臨著擴(kuò)散率低、失活率高等問(wèn)題,且病原菌分泌的胞外多糖也會(huì)限制噬菌體的吸附,從而影響其應(yīng)用效果[7]。拮抗生防菌主要包括芽胞桿菌、鏈霉菌、木霉等,這些生防菌株能夠通過(guò)產(chǎn)生拮抗物質(zhì)、與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等方式抑制青枯菌生長(zhǎng),從而降低植物發(fā)病率[8]。生防菌株因其在根際定殖后能夠自行傳播與維持,起到長(zhǎng)期抑制土傳病害的作用,能減少非再生資源的投入[9],因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。鏈霉菌(Streptomyces)是土壤放線菌中的重要類群,約占土壤可培養(yǎng)微生物的20%,普遍存在于根際土壤中,可以產(chǎn)生多樣的次生代謝產(chǎn)物幫助植物抵御病原菌的入侵[10]。鏈霉菌在固體發(fā)酵基質(zhì)上可形成豐富的分生孢子,易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸。芽胞桿菌(Bacillus)營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單,產(chǎn)生的芽孢抗逆性強(qiáng),兼具拮抗及促生作用[11],是生防菌篩選的重要對(duì)象。單一生防菌劑的應(yīng)用效果常不穩(wěn)定或持續(xù)時(shí)間較短,研究不同功能微生物之間潛在的協(xié)同效應(yīng),探索施用復(fù)合微生物制劑控制植物病害是克服單一菌劑缺陷的途徑之一。本研究以篩選的拮抗放線菌與芽胞桿菌為材料,研究復(fù)合菌劑防控番茄青枯病的生防效應(yīng),為土傳病害的防控提供生防策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株拮抗放線菌WL-3、WL-4;細(xì)菌XL-2、CW-02;青枯勞爾氏菌(R.solanacearum)1115,均由本實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.1.2 培養(yǎng)基高氏1號(hào)培養(yǎng)基:可溶性淀粉20.0 g,KNO31.0 g,NaCl 0.5 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.5 g,FeSO40.01 g,去離子水1 000 mL,pH7.5。燕麥培養(yǎng)基:燕麥片20.0 g,MgSO40.2 g,KNO30.2 g,K2HPO40.5 g,瓊脂粉20.0 g,去離子水1 000 mL,pH7.5。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA):葡萄糖10.0 g,蛋白胨5.0 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏3.0 g,去離子水1 000 mL,pH7.5。鉻天青(CAS)檢測(cè)培養(yǎng)基:CAS 0.060 5 g,十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA)0.072 9 g,1 mmol·L-1FeCl310 mL,0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液50 mL,去離子水 940 mL,瓊脂9 g。L-色氨酸培養(yǎng)基:甘露醇10.0 g,K2HPO40.5 g,MgSO40.2 g,NaCl 0.1 g,酵母膏1.0 g,NH4NO31.0 g,L-色氨酸0.1 g,去離子水1 000 mL,pH7.0。吲哚乙酸(IAA)比色液:0.5 mol·L-1FeCl31 mL,硫酸30 mL,去離子水50 mL。種子發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖45.0 g,黃豆粉30.0 g,CaCO35.0 g,酵母粉5.0 g,去離子水1 000 mL,pH7.5。

1.2 拮抗放線菌及拮抗細(xì)菌的初步鑒定

根據(jù)《放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類》[12]和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[13]的方法,對(duì)前期從南京郊區(qū)番茄大棚土樣中篩選獲得的具有拮抗番茄青枯菌能力的放線菌菌株WL-3、WL-4及細(xì)菌菌株CW-02、XL-2進(jìn)行初步鑒定,檢測(cè)其形態(tài)及理化特征。提取菌株的總DNA,采用細(xì)菌16S rRNA基因的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行基因序列分析,所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析,用MEGA 7.0的Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,確定菌株的分類地位。

鏡檢觀察菌株CW-02、XL-2細(xì)胞形態(tài)、有無(wú)芽孢及芽孢著生的位置,并測(cè)序分析16S rRNA基因序列,確定其分類地位。

1.3 拮抗放線菌菌株對(duì)青枯菌分泌胞外多糖的影響

將放線菌菌株的斜面孢子(2～3環(huán))接種在50 mL高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶),于180 r·min-1搖床28 ℃發(fā)酵96 h,8 000 r·min-1離心15 min,取上清液。于30 mL NA液體培養(yǎng)基接種 200 μL 108CFU·mL-1青枯菌,再根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果,添加5 mL上述上清液,與青枯菌共培養(yǎng)24 h。取樣,透射電鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照。

1.4 芽胞桿菌的生物學(xué)特性

1.4.1 芽胞桿菌產(chǎn)鐵載體及IAA的定性檢測(cè)將待測(cè)菌株接種于CAS培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)5 d,如果菌落周圍出現(xiàn)有橘黃色透明圈,表明待測(cè)菌株產(chǎn)鐵載體。將待測(cè)菌株接種于裝有25 mLL-色氨酸液體培養(yǎng)基的50 mL的離心管中,28 ℃、125 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 d,取樣,離心取上清液,在2.5 mL離心管分別加入200 μL IAA比色液和上清液,靜置15 min后觀察。如果顯現(xiàn)紅色,則為陽(yáng)性,說(shuō)明菌株分泌IAA,并且顯色越深表明菌株分泌IAA的能力越強(qiáng)。

1.4.2 H2O2耐受性及SOD活性測(cè)定將菌株CW-02、XL-2的菌體細(xì)胞分別接種NA液體培養(yǎng)基,180 r·min-1培養(yǎng)12 h后,分別添加NA液體培養(yǎng)基體積的0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5% H2O2,2 h后吸取 100 μL 于平板涂布計(jì)數(shù),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。測(cè)定菌株產(chǎn)SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法,酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司。

1.5 拮抗放線菌與芽胞桿菌菌株間的相容性檢測(cè)

利用平板交叉劃線法檢測(cè)菌株間的相容性。分別用接種環(huán)蘸取新鮮的放線菌分生孢子及芽胞桿菌菌苔,于PDA平板上交叉劃線,28 ℃培養(yǎng)5～7 d后,觀察各菌株在交叉劃線接觸點(diǎn)的生長(zhǎng)狀況。

1.6 放線菌及芽胞桿菌的固體發(fā)酵

1.6.1 放線菌的固體發(fā)酵于250 mL錐形瓶裝入30 mL種子發(fā)酵培養(yǎng)基,滅菌后,分別接種菌株WL-3、WL-4新鮮的孢子懸液,28 ℃、180 r·min-1條件下培養(yǎng)48～60 h,獲得液體種子懸液,然后接入固體發(fā)酵基質(zhì)。

取固體發(fā)酵基質(zhì)40 g,混勻裝入500 mL錐形瓶,121 ℃滅菌30 min,接種10%種子懸液。48 h搖動(dòng) 1次,觀察基質(zhì)顏色及氣味的變化,28 ℃發(fā)酵14 d后,取樣測(cè)定孢子數(shù)。具體方法:稱取10 g菌劑,添加 90 mL 無(wú)菌水,180 r·min-1振蕩1 h,4層紗布過(guò)濾制取孢子懸液,將孢子懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋,顯微計(jì)數(shù),統(tǒng)計(jì)單位體積的孢子數(shù),換算出每克菌劑中孢子數(shù)。

1.6.2 芽胞桿菌固體發(fā)酵將芽胞桿菌CW-02、XL-2分別接種到裝有30 mL NA的100 mL三角瓶中,28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)24 h,制備種子懸液。將固體發(fā)酵基質(zhì)裝入三角瓶(20 g/250 mL),121 ℃滅菌 40 min,接種10%種子懸液。每24 h翻動(dòng)1次,培養(yǎng)3 d后取樣,鏡檢菌體形態(tài),至95%形成芽孢后,取樣進(jìn)行稀釋、涂布計(jì)數(shù)。

1.7 復(fù)合菌劑的篩選

利用育苗基質(zhì)小盆栽試驗(yàn)篩選防控效果較佳的復(fù)合菌劑,調(diào)整單一菌劑的孢子或細(xì)胞數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí),即109CFU·g-1,復(fù)合菌劑為單菌劑1∶1(體積比)混勻,每盆生防菌劑接種量5%,菌劑與育苗基質(zhì)攪拌均勻。設(shè)置空白對(duì)照為不接生防菌處理,基質(zhì)對(duì)照為不接菌處理(排除基質(zhì)干擾)。在育苗基質(zhì)盤中,播種雜交1代‘紅矮生’番茄種子,每穴放置2顆露白的種子,在上面覆蓋一層基質(zhì),用水澆透,置于溫室中培育。待番茄苗長(zhǎng)到3葉1心時(shí),移栽到直徑7.5 cm的小缽中,每缽裝入100 g含菌劑的基質(zhì)。番茄苗培養(yǎng)1周后,每缽接種10 mL(106CFU·g-1)青枯菌,每處理18缽。根據(jù)1.5節(jié)結(jié)果選擇菌株,設(shè)置單一菌株(鏈霉菌WL-3、WL-4,芽胞桿菌CW-02、XL-2)及4株菌兩兩復(fù)合的組合,共12個(gè)處理。室內(nèi)條件:白天溫度 28～30 ℃,光照12 h;夜間溫度23～25 ℃,黑暗12 h。開始發(fā)病后記錄番茄的發(fā)病狀況,病情穩(wěn)定后計(jì)算植株發(fā)病率。

1.8 復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防控效果及土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

盆栽試驗(yàn)土壤采自南京郊區(qū)麒麟鎮(zhèn)后村番茄種植園,土壤為黃棕壤,有機(jī)質(zhì)含量31.74 g·kg-1,pH6.37。將土壤晾干、磨碎、過(guò)篩后備用。

設(shè)置復(fù)合菌劑組合(WL-4+CW-02)處理,以不加菌劑為空白對(duì)照,以單一菌劑WL-3、CY-1為對(duì)照。菌株CY-1拮抗植物病原真菌,不拮抗青枯菌;菌株WL-3拮抗青枯菌,不拮抗病原真菌。共4個(gè)處理,每處理24缽,生防菌劑接種量5%,將各菌劑與土壤混勻,每缽裝入含200 g菌劑的土壤。在育苗盤中培育番茄苗,長(zhǎng)到3葉1心時(shí),選取大小一致的番茄苗移栽到盆缽中。室內(nèi)條件同1.7節(jié)。1周后,接種20 mL 107CFU·L-1的青枯菌(終濃度為106CFU·g-1)。開始發(fā)病后統(tǒng)計(jì)番茄的發(fā)病情況并計(jì)算病情指數(shù),番茄青枯病單株病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)[14]。發(fā)病穩(wěn)定后取植株根際土,測(cè)定并分析各處理對(duì)根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

土壤高通量測(cè)序樣品采集及分析:分別選取4個(gè)處理中的植株,去除表層土壤后,將番茄植株連同根部土壤一同拔出,去掉植株主體土,抖落并收集根部1～2 mm的根際土壤樣品,充分混勻。取充分混勻的土壤樣品0.50 g,采用EZNA?Soil DNA Kit(OMEGA)提取樣品DNA,利用 NanoDrop 2000 檢測(cè)抽提 DNA 濃度和純度,A260/A280值為1.8～2.0。將符合要求的DNA樣品送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行土壤細(xì)菌高通量測(cè)序。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010軟件,采用SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗放線菌及拮抗細(xì)菌的初步鑒定

從土壤中篩選獲得的2株放線菌WL-3、WL-4及2株細(xì)菌XL-2、CW-02,對(duì)青枯菌有顯著的拮抗作用,如圖1所示。

圖1 放線菌及細(xì)菌對(duì)青枯菌的拮抗作用Fig.1 Inhibition effects of actinomycetes and bacteria against Ralstonia solanacearum

圖2 菌株WL-3(A)及WL-4(B)孢子絲形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics of strain WL-3(A)and WL-4(B)spore filament

圖3 菌株WL-3(A)、WL-4(B)的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogeny trees of strains WL-3(A),WL-4(B)by using 16S rRNA gene sequences

2.1.1 放線菌的初步鑒定放線菌形態(tài)學(xué)特征:菌株WL-3在燕麥培養(yǎng)基上氣生菌絲呈粉紅色,菌落形狀為不規(guī)則圓形,電鏡觀察其孢子絲呈直鏈狀,孢子為圓柱形(圖2-A);菌株WL-4在燕麥培養(yǎng)基上菌落呈規(guī)則圓形,邊緣整齊,表面有褶皺,氣生菌絲前期呈淡綠色,后期逐漸變?yōu)榛揖G色,電鏡觀察孢子絲為螺旋狀,分生孢子為橢圓形(圖2-B)。對(duì)菌株WL-3、WL-4的16S rRNA基因測(cè)序,并選取同源性高的相關(guān)序列信息進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,如圖3所示,菌株WL-3(登錄號(hào):MW316590)與玫瑰綠鏈霉菌(Streptomycesroseoviridis)序列相似性為99.0%;菌株WL-4(MW 721131)與孟加拉鏈霉菌(S.bangladeshensis)相似性為98.0%。2株菌初步鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp.)。

2.1.2 兼具拮抗及促生作用的細(xì)菌鑒定從土壤中篩選出2株對(duì)青枯菌具有拮抗效果的細(xì)菌菌株XL-2、CW-02,對(duì)青枯菌的拮抗效果見圖1。2株菌在NA平板上均為乳白色菌落,邊緣整齊,呈圓形,簡(jiǎn)單染色,鏡檢發(fā)現(xiàn)XL-2端生芽孢,CW-02中生芽孢(菌體形態(tài)圖略)。通過(guò)菌株XL-2、CW-02的16S rRNA基因序列測(cè)序,菌株XL-2(ON209529)與貝萊斯芽胞桿菌(Bacillusvelezensis)序列相似性為 99.0%,菌株CW-02(ON209527)與萎縮芽胞桿菌(B.atrophaeus)序列相似性為 99.0%。2株菌初步鑒定為芽胞桿菌(Bacillussp.)。

2.2 放線菌WL-3、WL-4對(duì)青枯菌分泌胞外多聚物的影響

通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),經(jīng)菌株WL-3、WL-4發(fā)酵上清液處理后,與對(duì)照相比青枯菌的莢膜厚度明顯變薄(圖4),說(shuō)明拮抗菌株的代謝產(chǎn)物能顯著抑制青枯菌胞外多聚物的分泌。

圖4 WL-3(A)、WL-4(B)及對(duì)照處理(C)對(duì)青枯菌形態(tài)的影響Fig.4 Effects of WL-3(A),WL-4(B)and control(C)on the morphology of R.solanacearum

2.3 芽胞桿菌的生物學(xué)特征

從表1可知:菌株XL-2、CW-02分泌鐵載體能力較強(qiáng),定性檢測(cè)IAA均為陽(yáng)性。在H2O2耐受性試驗(yàn)中,2株菌在含0.4% H2O2條件下仍能較好生長(zhǎng),表明其對(duì)H2O2耐受性較高,菌株具有較高的SOD活性。菌株XL-2、CW-02的SOD活性分別為116.72和120.88 U·mL-1。

表1 芽胞桿菌的植物促生特性及對(duì)H2O2耐受性Table 1 Plant growth-related properties and hydrogen peroxide tolerance of the Bacillus spp.

2.4 放線菌WL-3、WL-4與芽胞桿菌XL-2、CW-02菌株間的相容性

4株菌間的相容性結(jié)果(圖5)顯示:菌株WL-3對(duì)XL-2有抑制作用;菌株WL-4、CW-02與XL-2交叉處正常生長(zhǎng),菌株間沒(méi)有拮抗作用;2株芽胞桿菌對(duì)鏈霉菌WL-3生長(zhǎng)有抑制作用。

圖5 菌株WL-3、WL-4、CW-02及XL-2的相容性Fig.5 Compatibility of strain WL-3,WL-4,CW-02 and XL-2

2.5 拮抗菌株的固體發(fā)酵

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),玉米粉、黃豆粉、麥麩與稻殼較適宜鏈霉菌生長(zhǎng)。通過(guò)各基質(zhì)在不同水平上孢子數(shù)量的比較,獲得WL-3固體菌劑最佳發(fā)酵配方:25%玉米粉,5%黃豆粉,70%麥麩+稻殼(質(zhì)量比為1∶3),料水比為1∶1,pH7.5。將培養(yǎng)48 h的WL-3種子液接入固體發(fā)酵基質(zhì),接種量為10%,28 ℃發(fā)酵14 d后,孢子量1.58×109CFU·g-1,菌劑呈暗棕色,有土腥氣味產(chǎn)生。WL-4固體發(fā)酵配方:20%玉米粉,15%黃豆粉,65%(麥麩、稻殼的質(zhì)量比為1∶2),料水比為1∶1,pH7.5。將培養(yǎng)60 h的WL-4種子液接入固體發(fā)酵基質(zhì),接種量為10%,28 ℃發(fā)酵14 d后,孢子量2.0×109CFU·g-1,菌劑呈灰色,有強(qiáng)烈的土腥氣味產(chǎn)生。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,確定芽胞桿菌的固體發(fā)酵條件。菌株XL-2與CW-02配方:麥麩、玉米粉、米糠的質(zhì)量比為8∶1∶1,料水比為1∶1,接種量10%,培養(yǎng)3 d。菌劑XL-2細(xì)菌數(shù)量達(dá)2.3×1010CFU·g-1;菌劑CW-02細(xì)菌數(shù)量達(dá)9.0×109CFU·g-1。

2.6 復(fù)合菌劑的篩選

利用育苗基質(zhì)盆栽試驗(yàn),篩選出最佳的菌劑組合。從圖6可以看出:對(duì)照(CK)植株發(fā)病率為78.00%,菌劑WL-3處理植株發(fā)病率為44.44%,復(fù)合菌劑CW-02+WL-4(C+4)處理植株發(fā)病率為30.00%。單菌劑CW-02、WL-4處理發(fā)病率分別為55.56%、66.67%,防控效果較復(fù)合菌劑CW-02+WL-4處理差,復(fù)合菌劑顯示出較強(qiáng)的協(xié)同作用。而復(fù)合菌劑CW-02+XL-2(C+X)、XL-2+WL-3(X+3)、WL-3+WL-4(3+4)發(fā)病率與其對(duì)應(yīng)的單菌劑沒(méi)有顯著差異,未表現(xiàn)出明顯的協(xié)同作用。所以選擇復(fù)合菌劑CW-02+WL-4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 不同處理對(duì)番茄植株青枯病發(fā)病率的影響Fig.6 Effects of different treatments on incidence rate of tomato bacterial wilt1)CK:空白對(duì)照Blank control;Medium:基質(zhì)對(duì)照Matrix control;C+3:CW-02+WL-3;C+4:CW-02+WL-4;C+X:CW-02+XL-2;X+3:XL-2+WL-3;X+4:XL-2+WL-4;3+4:WL-3+WL-4. 下同。The same as follows. 2)不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level.

2.7 復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防控效果及根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.7.1 復(fù)合菌劑對(duì)番茄青枯病的防控效果從圖7可知:發(fā)病初期,空白對(duì)照番茄的病情指數(shù)高于各菌劑處理,植株發(fā)病迅速。隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng),各處理番茄的病情指數(shù)逐漸增加,15 d左右病情開始穩(wěn)定,復(fù)合菌劑處理的病情指數(shù)為41.21%,防控效果為45.58%。單菌劑WL-3處理情況相似,在14 d左右病情趨于穩(wěn)定,病情指數(shù)為50.17,防控效果為33.75%。單菌劑CY-1(對(duì)照)處理,其在室內(nèi)平板對(duì)峙試驗(yàn)中未表現(xiàn)出對(duì)青枯菌的拮抗作用,但在盆栽試驗(yàn)中具有一定的防控效果,其病情指數(shù)為60.00,防效為20%左右。空白對(duì)照在15 d時(shí)病情指數(shù)為65.63,在18 d時(shí)病情才趨于穩(wěn)定,病情指數(shù)為75.73。

圖7 不同處理番茄的病情指數(shù)Fig.7 Disease indexes of tomato plant with different treatments

2.7.2 復(fù)合菌劑對(duì)番茄根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響從圖8-A、B可知:復(fù)合菌劑CW-02+WL-4、單菌劑WL-3與CY-1的土壤細(xì)菌群落豐度(Chao1)與多樣性(Shannon)均高于空白對(duì)照(CK),表明添加菌劑顯著提高土壤細(xì)菌群落的豐富度與多樣性。其中復(fù)合菌劑群落豐度(Chao1)最高,相對(duì)于CK提高5.30%,而復(fù)合菌劑CW-02+WL-4、單菌劑WL-3和CY-1處理的Shannon指數(shù)相對(duì)于CK分別提高5.00%、4.44%和3.24%。

從圖8-C可以看出:不同處理群落組成大致相同,但相對(duì)豐度有較大差異。豐度較高的前10個(gè)細(xì)菌門分別為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、黏球菌門(Myxococcota)。施用菌劑后變形菌門的豐度顯著高于CK,其在WL-3菌劑處理中相對(duì)豐度最高,為46.79%,在復(fù)合菌劑中為41.11%,在CY-1菌劑中為38.38%,而在CK中僅占28.05%。酸桿菌門各菌劑處理均低于CK:復(fù)合菌劑與WL-3菌劑相對(duì)豐度分別為8.72%和11.79%,CK高達(dá)17.13%。擬桿菌門、芽單胞菌門等相對(duì)于CK差異不明顯。結(jié)果表明施用菌劑能夠影響部分根際土壤細(xì)菌門水平的相對(duì)豐度。

不同菌劑處理對(duì)根際土壤細(xì)菌屬水平的影響,優(yōu)勢(shì)菌屬如圖8-D所示。復(fù)合菌劑處理中Sphingomonas相對(duì)豐度為4.23%,Pseudomonas為4.85%,Bacillus為1.84%;WL-3菌劑處理中Sphingomonas相對(duì)豐度最高,為7.88%,Streptomyces為1.59%;CY-1菌劑處理的Sphingomonas相對(duì)豐度為6.91%,Nitrospira為 1.21%;CK中Sphingomonas與Pseudomonas相對(duì)豐度分別為3.58%和1.05%,均低于3種菌劑處理,而Ralstonia相對(duì)豐度為2.74%,均高于3種菌劑處理,表明菌劑處理能顯著降低病原菌屬的相對(duì)豐度,提高有益菌屬的相對(duì)豐度。

圖8 不同處理對(duì)根際土壤細(xì)菌α多樣性(A、B)、門水平的群落組成(C)和優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度(D)的影響Fig.8 Effects of different treatments on rhizosphere soil bacterial α diversity(A,B),community composition at phylum level(C)and abundance of dominant bacteria(D)

3 討論

生防菌劑是防控番茄青枯病的重要措施,土壤放線菌在生物防治中表現(xiàn)出巨大的潛力。本研究從番茄種植區(qū)土壤中篩選出2株拮抗放線菌WL-3、 WL-4,初步鑒定為鏈霉菌(Streptomycessp.)。鏈霉菌WL-3、WL-4不僅抑制青枯菌的生長(zhǎng),經(jīng)透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵上清液還影響青枯菌胞外多糖的分泌量。El-Shirbiny等[15]曾證明玫瑰綠鏈霉菌能夠促進(jìn)小麥生長(zhǎng),但利用玫瑰綠鏈霉菌防控青枯病鮮有報(bào)道。Al-Bari 等[16]研究發(fā)現(xiàn)孟加拉鏈霉菌AAB-4能夠代謝產(chǎn)生鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯,可以拮抗細(xì)菌和真菌。鏈霉菌WL-3、WL-4產(chǎn)生活性物質(zhì)的作用有待進(jìn)一步檢測(cè)。

連作障礙造成的土壤鹽漬化會(huì)使植物遭受逆境傷害,活性氧(ROS)含量增加,發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用,細(xì)胞生物膜受損[17]。超氧化物歧化酶(SOD)是生物體防御氧化損傷的一種金屬酶,對(duì)自由基具有強(qiáng)烈清除作用。功能微生物細(xì)胞在根際定殖,菌體如產(chǎn)生SOD,能催化ROS發(fā)生歧化反應(yīng),減少ROS對(duì)植物的傷害,具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物病害的作用。本試驗(yàn)篩選獲得2株芽胞桿菌,產(chǎn)SOD活性高且拮抗青枯菌,同時(shí)能夠分泌鐵載體與IAA。已有研究發(fā)現(xiàn)萎縮芽胞桿菌能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物,如細(xì)菌素、脂肽、幾丁質(zhì)酶及鐵載體、生長(zhǎng)素、赤霉素等,促進(jìn)植株的生長(zhǎng),并具有較好生防潛力[18-19]。Khan等[20]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌能產(chǎn)生高效的抗氧化肽,具有蛋白酶、葡聚糖酶和纖維素酶等多種水解酶活性。

青枯病暴發(fā)的主要原因是植物根際有益菌群數(shù)量的減少、細(xì)菌多樣性的降低和植物病原菌的積累。在控制植物病害方面,2種或2種以上有益微生物的聯(lián)合應(yīng)用比單一微生物的應(yīng)用效果好[21]。Santiago等[22]報(bào)道一些微生物組合提供了對(duì)多種作物的廣譜保護(hù),并改善其生長(zhǎng),提高其產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究篩選出芽胞桿菌與鏈霉菌組合(CW-02+WL-4),2種菌之間無(wú)拮抗作用,相對(duì)于單一菌劑處理,復(fù)合菌劑處理表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng),為植物病害的綜合防治提供了新的選擇。植物健康與土壤微生物群落多樣性呈正相關(guān),在番茄根際土壤中存在一個(gè)穩(wěn)定而復(fù)雜的菌群網(wǎng)絡(luò)維持番茄植株的健康,有助于防止青枯菌感染[23]。青枯菌的入侵會(huì)破壞根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),導(dǎo)致非致病性細(xì)菌的多樣性和豐度明顯下降,而復(fù)合菌劑的應(yīng)用能夠提高土壤微生物群落多樣性,增加OTU數(shù)量和Chao1、Shannon指數(shù)[24-25]。本研究利用高通量測(cè)序檢測(cè)菌劑對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)施用單一菌劑及復(fù)合菌劑后土壤中變形菌門與放線菌門等的相對(duì)豐度增加。Qi等[26]研究發(fā)現(xiàn)健康土壤網(wǎng)絡(luò)中放線菌門、芽單胞菌門、變形菌門的比例均高于發(fā)病土壤。在屬水平上,相對(duì)于空白對(duì)照,單菌劑與復(fù)合菌劑處理的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)與假單胞菌屬(Pseudomonas)相對(duì)豐度均在較高水平,鞘氨醇單胞菌屬具有抑制土傳疾病和產(chǎn)生植物激素類化合物的作用[27];而勞爾氏菌屬相對(duì)豐度均低于對(duì)照,表明菌劑處理能顯著降低病原菌屬的豐度。Dong等[28]研究發(fā)現(xiàn),在微聚集體中,勞爾氏菌屬的相對(duì)豐度與青枯病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)。盆栽試驗(yàn)中,選擇單一菌株WL-3作為對(duì)照,是初篩時(shí)由于菌株WL-3處理效果優(yōu)于菌株WL-4,其與復(fù)合菌株(CW-02+WL-4)比較,如果對(duì)照再設(shè)置WL-4處理就更有說(shuō)服力。對(duì)照菌株鏈霉菌(S.yetensis)CY-1,其主要抑制植物病原真菌,在平板對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)青枯菌無(wú)明顯拮抗作用,但在盆栽試驗(yàn)中作為對(duì)照處理,卻顯示出對(duì)青枯病具有一定的防控效果(20%),從細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)分析上看,其可能原因是改善了根際的微生物區(qū)系,從而間接減弱了青枯病的發(fā)生,也從側(cè)面驗(yàn)證了改善根際微生物區(qū)系可減低病害發(fā)生的程度。