促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡產(chǎn)生的研究進(jìn)展

鄭毅 許鵬 劉凱

【提要】 細(xì)胞外囊泡（EVs）治療是一種前景廣闊的臨床治療方法，可以規(guī)避間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）治療的多種潛在風(fēng)險。但基于治療目的需要大量EVs，而EVs 的產(chǎn)量較低難以滿足需求，需要開發(fā)促進(jìn)EVs 產(chǎn)生的方法。本文圍繞近年來促進(jìn)EVs 產(chǎn)生的新方法與進(jìn)展進(jìn)行介紹，為實現(xiàn)EVs 的高效、大量生產(chǎn)并應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域提供參考。

近20 年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來越受到關(guān)注，應(yīng)用于臨床的MSCs包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）、脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cell，HUC-MSCs）等。MSCs 具有自我更新能力，可以分化成多種細(xì)胞譜系，并且可以分泌多種生長因子，表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生潛能。研究發(fā)現(xiàn)，局部應(yīng)用ADSCs 可以加速傷口愈合、促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎恢復(fù)[1-2]。然而，最近的研究表明，MSCs 并非通過分化成其他細(xì)胞來修復(fù)受損組織，而是通過其介導(dǎo)的旁分泌機(jī)制[3]，如細(xì)胞因子以及細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）等，來調(diào)控受損的細(xì)胞[4-5]，而EVs 是MSCs 發(fā)揮組織修復(fù)與再生效應(yīng)的關(guān)鍵產(chǎn)物之一[6]。

相較于MSCs，EVs 在臨床應(yīng)用中具有諸多優(yōu)勢。多項動物研究表明，EVs 可以減少心肌梗死面積[7]、減輕肝臟損傷[8]、改善受損的腎功能[9]、促進(jìn)卒中恢復(fù)[10]與皮膚創(chuàng)面愈合[11]等。還有研究者將EVs 用于COVID-19 的治療[12]。此外，EVs 可作為疾病診斷的標(biāo)志物[13]，或作為天然來源的生物載體實現(xiàn)藥物遞送與釋放[14]?；谠偕委熌康?，EVs 的生產(chǎn)需要培養(yǎng)大量的MSCs。然而，細(xì)胞分泌EVs 的產(chǎn)量過低，難以達(dá)到治療的需求。例如，嚙齒動物模型所需的EVs 相當(dāng)于48 h 內(nèi)從200 萬個MSCs 收集的EVs 數(shù)量[15]，而按照比例，應(yīng)用于人體的治療量可能需要數(shù)億細(xì)胞來生產(chǎn)[16]。因此，有必要研究新的方法來促進(jìn)EVs 的產(chǎn)生。目前的研究主要聚焦在如下幾個方面：第一，提高單位數(shù)量細(xì)胞釋放EVs 的數(shù)量。通過對細(xì)胞進(jìn)行物理或化學(xué)等外源性刺激，可以促進(jìn)EVs 的產(chǎn)生[17]。第二，通過各種立體培養(yǎng)方法增加培養(yǎng)空間中細(xì)胞的數(shù)量，從而提高獲取EVs 的效率，并減少每個細(xì)胞所需的培養(yǎng)基體積。第三，解決目前分離方法效率低、提取的EVs 易受破損等問題[18]，從而提高EVs 的分離效率。本文將圍繞近年來促進(jìn)EVs產(chǎn)生的新方法與進(jìn)展進(jìn)行介紹，為實現(xiàn)EVs 高效、大量生產(chǎn)并應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)治療領(lǐng)域提供參考。

1 外源性刺激促進(jìn)細(xì)胞釋放EVs

1.1 血清剝奪

血清剝奪是最常用，簡單的促進(jìn)MSCs 釋放EVs 的外源性刺激方法[19]。Li 等[20]發(fā)現(xiàn)，使用血清剝奪培養(yǎng)基與含10%無EVs 血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系（Neuro2a）和富含運動神經(jīng)元的胚胎小鼠脊髓細(xì)胞與小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤的融合體（NSC-34），48 h 后，血清剝奪培養(yǎng)基的EVs 產(chǎn)量始終高于10%無EVs 血清的培養(yǎng)基的產(chǎn)量。Bost 等[21]的進(jìn)一步研究表明，在培養(yǎng)基中添加血清培養(yǎng)人胚胎腎293 細(xì)胞（Human embryonic kidney 293 cell line，HEK-293）的衍生株HEK-293T 細(xì)胞，不利于細(xì)胞EVs 的釋放。為了探究哪些成分會影響細(xì)胞EVs 釋放，通過提取出血清中的EVs 與白蛋白等大分子物質(zhì)單獨作用于細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞EVs 的產(chǎn)生受到抑制。對血清剝奪培養(yǎng)與10%血清培養(yǎng)的HEK-293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的分析表明，血清剝奪培養(yǎng)使細(xì)胞的神經(jīng)酰胺轉(zhuǎn)錄水平明顯增加，而使用神經(jīng)酰胺抑制劑GW4869 處理細(xì)胞可顯著降低血清剝奪培養(yǎng)細(xì)胞EVs 的產(chǎn)生，提示神經(jīng)酰胺依賴性的EVs發(fā)生途徑是血清剝奪促進(jìn)EVs 釋放的關(guān)鍵機(jī)制。然而，血清剝奪過久的細(xì)胞常表現(xiàn)出不良的生長狀態(tài)，無法持續(xù)性地生產(chǎn)EVs。但因其操作簡單易行，大量的研究仍在提取EVs 前對細(xì)胞進(jìn)行血清剝奪處理[20]。

1.2 低氧

低氧刺激也是促進(jìn)細(xì)胞釋放EVs 的一種較常見的方法。多項研究表明，1%或0.1%的低氧條件可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞分泌EVs[22]；0.5%的低氧條件可以促進(jìn)骨髓干細(xì)胞分泌EVs。低氧狀態(tài)下，低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)升高，進(jìn)一步激活下游靶標(biāo)nSMase2，而nSMase2 是EVs 生物發(fā)生與釋放的關(guān)鍵因子之一，提示低氧可能是通過HIF-1α 與nSMase2 的一系列通路的激活，促進(jìn)了細(xì)胞分泌EVs[23]。低氧還可影響并改變多種細(xì)胞基因的表達(dá)，如葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（GLUT-1）、表皮生長因子受體（EGFR）等，從而增加這些受體的激活或?qū)е率荏w聚集，進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)吞作用并促進(jìn)EVs釋放[24]。低氧不僅能促進(jìn)EVs 的釋放，經(jīng)過低氧刺激后細(xì)胞分泌的EVs 具有更強(qiáng)的促進(jìn)血管生成、促進(jìn)脂肪移植物成活、促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面恢復(fù)[25-27]等生物學(xué)效應(yīng)。

1.3 pH 改變

Ban 等[28]發(fā)現(xiàn)，相比中性培養(yǎng)基，將HEK-293 細(xì)胞在酸性培養(yǎng)基中孵育30 min，其分泌的EVs 內(nèi)容物中蛋白和核酸的濃度顯著增加，EVs 的標(biāo)志物CD9、CD63 和HSP70 明顯增多；而堿性培養(yǎng)基中未發(fā)生明顯改變。Parolini 等[29]觀察到酸性微環(huán)境可以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞EVs 的釋放與攝取。Nakase等[30]的研究表明，低pH 培養(yǎng)Hela 細(xì)胞可能通過影響MVB的胞吐來影響EVs 的釋放；低pH 會改變Hela 細(xì)胞分泌的EVs 相關(guān)性狀，包括其蛋白含量、zeta 電位等，而這些改變可能影響了Hela 細(xì)胞對EVs 的再攝入，從而增加了EVs 在上清液中的數(shù)量，但其確切的機(jī)制仍不清楚。此外，低pH 促進(jìn)細(xì)胞分泌EVs 是否對所有細(xì)胞具有普適性，以及針對不同的細(xì)胞何種pH 條件最適宜等問題仍需進(jìn)一步研究。

1.4 機(jī)械應(yīng)力

大量研究表明，機(jī)械應(yīng)力的變化能夠改變細(xì)胞，影響其分化和轉(zhuǎn)歸。例如，壓力可以促進(jìn)MSCs 向軟骨分化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長與細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)[31]。最近的研究將生物反應(yīng)器模擬體內(nèi)的機(jī)械力與液體剪切力，發(fā)現(xiàn)這些刺激可以促進(jìn)細(xì)胞分泌EVs。Patel 等[32]構(gòu)建了一種3D 灌注生物反應(yīng)器系統(tǒng)，可以模擬生理狀態(tài)下血流動力學(xué)應(yīng)力。培養(yǎng)3 d 后，人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞（Human dermal microvascular endothelial cells，HDMEC）分泌EVs 的產(chǎn)量相比靜態(tài)培養(yǎng)增加了100 倍以上，EVs的CD63 的表達(dá)增加了14 倍。Guo 等[33]設(shè)計了一種具備拉伸收縮功能的灌注生物反應(yīng)器，培養(yǎng)體內(nèi)來源的干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌的EVs 產(chǎn)量明顯增加。機(jī)械應(yīng)力可以增加細(xì)胞內(nèi)機(jī)械敏感性YAP 蛋白的表達(dá)，該蛋白在細(xì)胞核中的積累可以進(jìn)一步激活Wnt 通路，Wnt 通路的激活可以促進(jìn)細(xì)胞釋放EVs[34]。

1.5 電刺激

電刺激具有多種生理學(xué)功能，生物體內(nèi)的電刺激可以刺激組織的發(fā)育與再生，促進(jìn)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，也能促進(jìn)軟骨分化與成熟等[35]。Fukuta 等[36]的研究表明，低水平的電刺激（0.3～0.5 mA·cm-2）可以通過影響鼠黑色素瘤細(xì)胞系（B16F1）與鼠成纖維細(xì)胞系（3T3 Swiss Albino）中的Rho GTPase 蛋白、Rab 家族蛋白與細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平來增加內(nèi)吞與EVs 釋放，提高EVs 產(chǎn)量。另外，較強(qiáng)的瞬時電刺激可導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，雖然瞬時電刺激常用于轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA 或特定藥物，但該方式也可以使EVs 的釋放增加數(shù)十倍[37]。因此，電刺激理論上可以在促進(jìn)EVs 分泌的同時，轉(zhuǎn)入需要的治療藥物，實現(xiàn)靶向且高效的EVs 生產(chǎn)。

1.6 細(xì)胞因子與化學(xué)藥物

EVs 的產(chǎn)量也可以通過使用一些細(xì)胞因子與化學(xué)藥物來提高。例如，部分抗炎類藥物（乙酰水楊酸、塞來昔布和氯喹等）可以促進(jìn)細(xì)胞分泌EVs[38]。將特定細(xì)胞（如中性粒細(xì)胞）與細(xì)胞因子使用TNF-α 孵育，可以促進(jìn)EVs 的分泌。這些細(xì)胞因子與化學(xué)藥物可以影響細(xì)胞的肌動蛋白功能與細(xì)胞膜流動性，還可以改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，從而影響EVs 的釋放[39]。但由于引入了外來化學(xué)藥物或試劑，可能對EVs 的成分與純度造成影響，是否可以應(yīng)用于EVs 的大量生產(chǎn)仍有待進(jìn)一步研究。

1.7 其他

Chen 等[40]發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激處理后，腫瘤細(xì)胞分泌的EVs 明顯增加。Bagheri 等[41]使用80 J·cm-2功率強(qiáng)度的低強(qiáng)度激光（Low-level laser irradiation，LLLI）照射，可以通過誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生自噬，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Wnt 信號通路的激活和GTPase 的轉(zhuǎn)錄來增加EVs 的分泌。目前，許多方法仍停留在理論階段，在未來的轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，仍需探討其機(jī)制與原理，并嘗試構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化的生產(chǎn)流程。

2 提高細(xì)胞培養(yǎng)效率

3D 培養(yǎng)是提高細(xì)胞培養(yǎng)效率最常用的方法，可在有限的細(xì)胞培養(yǎng)空間內(nèi)，擴(kuò)展細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)量。最早提出的3D 生物反應(yīng)器是2008 年Integra CELLine 的“燒瓶”生物反應(yīng)器[42]，可使培養(yǎng)的間皮瘤細(xì)胞的EVs 產(chǎn)量提升12 倍，且EVs 的形態(tài)、表型和免疫功能與對照組類似。隨后，更多種類的3D 生物反應(yīng)器被開發(fā)應(yīng)用。Patel 等[32]構(gòu)建了多層支架結(jié)構(gòu)的3D生物反應(yīng)器，在增大培養(yǎng)面積的同時模擬體內(nèi)的流體剪切力，明顯促進(jìn)了EVs 產(chǎn)生。3D 生物反應(yīng)器通過內(nèi)置的傳感器，還可實現(xiàn)自動化的微環(huán)境控制，可以更好地進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，以及對O2、CO2 和溫度的控制[43]。

最近，以中空纖維為代表的新型3D 生物反應(yīng)器逐漸成為研究的熱點。中空纖維生物反應(yīng)器有別于傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶，是一種在封閉系統(tǒng)內(nèi)將細(xì)胞區(qū)域與培養(yǎng)基區(qū)域分隔開來的三維反應(yīng)器。由于中空纖維的特殊性，細(xì)胞可以在系統(tǒng)中長時間保持良好形態(tài)而無需傳代；中空纖維可以在單位空間內(nèi)培養(yǎng)大量細(xì)胞，并將EVs 富集在外部隔室的培養(yǎng)基內(nèi)，同時半透膜避免了內(nèi)隔室細(xì)胞培養(yǎng)基中血清來源EVs 的污染[44]，具有獨特的優(yōu)勢。

3 改善EVs 的提取方法

隨著分離提純技術(shù)的快速發(fā)展，目前已經(jīng)有許多提取EVs 的方法。這些方法基于EVs 不同的特性（如密度、形狀、大小和表面蛋白等）來進(jìn)行分離，每種技術(shù)各有優(yōu)劣。

差速離心法是目前最常用的EVs 提取方法[45]。然而，雜質(zhì)蛋白的混雜可能會影響其應(yīng)用及成分分析[46]。此外，較大的離心力可能對EVs 的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不良的影響[18]；每次離心體積較小，離心時間較長，限制了該方法在大規(guī)模提取EVs 中的應(yīng)用。

超濾法是基于膜過濾的一種分離方法，操作簡便[47]。但是，超濾時的壓力可能導(dǎo)致EVs 破裂，影響其生理學(xué)功能與成分[48]。此外，囊泡在膜上大量堆積與吸附，會導(dǎo)致膜的堵塞與產(chǎn)量損失[49]。其中，尺寸排阻色譜法基于重力作用，可以保持EVs 的結(jié)構(gòu)與原有生物活性[50]，但其能處理的樣本體積有限；基于免疫結(jié)合原理的有免疫吸附法[51]，但產(chǎn)量低成本高[45]；基于親疏水原理的共沉淀法[52]，產(chǎn)量較高[53]，但可導(dǎo)致其他雜質(zhì)的共沉淀[54]，引入的外來化學(xué)物質(zhì)不利于EVs 的臨床應(yīng)用。

最近，一種新的基于微流體膜過濾的方法（TFF）使EVs的分離提取技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展[55]。TFF 的原理與超濾法類似，但超濾法的直流過濾易導(dǎo)致靠近膜表面的液體顆粒積聚，引起膜阻塞并降低過濾效率，最終導(dǎo)致膜破裂[56-57]。TFF引入了切向流分量，防止顆粒在膜表面形成高濃度液層，可以使過濾效率保持穩(wěn)定，避免以上問題的產(chǎn)生。將TFF 與其他EVs 分離提純的方法結(jié)合，可以顯著提高EVs 的產(chǎn)量并減少損失。Nordin 等[58]開發(fā)了一種TFF 結(jié)合尺寸排阻色譜的提取方法，可收獲高達(dá)50%～80%的EVs（理論產(chǎn)量）。Haraszti 等[59]聯(lián)合使用微載體3D 培養(yǎng)方法與TFF 提純方法，總體使EVs產(chǎn)量提高了140 倍。Kim 等[60]開發(fā)了一種完全封閉的雙循環(huán)TFF 芯片（dcTFF），可收獲所需粒徑區(qū)間的EVs。盡管TFF 同樣難以分離與EVs 粒徑相似的雜質(zhì)，但TFF 可以處理大體積（＞1 L）的樣本，非常適合用于大量生產(chǎn)EVs；此外，由于保持了過濾效率的穩(wěn)定性，TFF 提高了批次間的一致性[61]。因此，TFF 可能是未來更適合臨床使用的EVs 提取方法之一。當(dāng)然，TFF 設(shè)備仍需要進(jìn)一步發(fā)展，其可擴(kuò)展性、驗證方法和標(biāo)準(zhǔn)化等問題仍有待進(jìn)一步解決與完善。

4 總結(jié)與展望

過去的數(shù)年間，隨著EVs 研究的發(fā)展與深入，其在再生治療中的優(yōu)勢正逐漸顯現(xiàn)出來，而基于治療目的，需要高效、大量地生產(chǎn)EVs。為了克服EVs 產(chǎn)量低的問題，已經(jīng)有多種策略用于促進(jìn)EVs 的產(chǎn)生。雖然許多方法仍處于理論階段，或僅局限于特定的細(xì)胞或應(yīng)用場景，但隨著研究的進(jìn)一步發(fā)展，距離高效、大量地生產(chǎn)EVs 的目標(biāo)將更加接近。在今后的研究中，需要探究EVs 生產(chǎn)方法對EVs 質(zhì)量與生物學(xué)效應(yīng)的影響，摸索與建立EVs 產(chǎn)生的流程與標(biāo)準(zhǔn)，滿足未來再生醫(yī)學(xué)的臨床需求。