TREM2基因的敲低加重納米氧化鋁導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育障礙

郭馨岳，趙錦津，高曉誠(chéng)，張?zhí)m，黃濤，王艷紅，牛僑，張勤麗

山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生教研室，太原 030001

近年來(lái)，隨著納米科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，納米氧化鋁（alumina nanoparticles, AlNPs）廣泛應(yīng)用于日常生活中，如生物醫(yī)學(xué)[1]、涂料[2]和食品包裝[3]等領(lǐng)域。由于使用的廣泛性，含有AlNPs的材料在生產(chǎn)、加工和使用中會(huì)直接或間接地排入生產(chǎn)生活環(huán)境中，因此它們的毒性也備受關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，AlNPs可以穿過(guò)血腦屏障，在腦中蓄積且難以排出，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷[4]，AlNPs會(huì)引起仔鼠腦組織氧化應(yīng)激及腦膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的改變[5]，鼻腔滴注AlNPs后對(duì)大鼠腦組織造成結(jié)構(gòu)損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和免疫炎癥反應(yīng)[6]。其他一些金屬納米顆粒也具有毒性，如早期暴露于納米二氧化鈦會(huì)通過(guò)抑制運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)而對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生損傷[7]，納米二氧化硅作用于PC12細(xì)胞后可以降低細(xì)胞活力，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡[8]，提示納米二氧化硅暴露可能對(duì)神經(jīng)發(fā)育產(chǎn)生毒性。

Ⅱ型髓系細(xì)胞觸發(fā)受體（triggering receptor expressed on myeloid cells 2, TREM2）是TREM2家族的一種免疫球蛋白樣孤兒受體，該受體與配體結(jié)合后會(huì)激活一系列與免疫功能相關(guān)的下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)編碼蛋白質(zhì)TREM2的基因點(diǎn)突變，特別是TREM2 R47H的變異與阿爾茨海默病（Alzheimer Disease, AD）、額顳葉癡呆（frontotemporal dementia, FTD）、帕金森?。≒arkinson Disease, PD）和散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化癥（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）等疾病都高度相關(guān)。除了與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)聯(lián)外，TREM2還被證明對(duì)大腦發(fā)育至關(guān)重要。TREM2具有免疫調(diào)節(jié)作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中只表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，參與神經(jīng)元存活、凋亡、突觸修剪、甚至神經(jīng)回路形成等生理活動(dòng)[10]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，TREM2缺陷小鼠突觸密度增加，表明TREM2控制小膠質(zhì)細(xì)胞的突觸修剪，TREM2缺失的3月齡小鼠，神經(jīng)元連接改變，出現(xiàn)自閉癥譜系疾病樣行為表現(xiàn)[11]。但關(guān)于TREM2是否在生命早期的神經(jīng)發(fā)育中起作用還不清楚，為了闡明AlNPs的神經(jīng)毒性以及trem2基因在早期神經(jīng)發(fā)育中的作用，本研究通過(guò)敲低trem2基因，并在此基礎(chǔ)上暴露AlNPs，觀察斑馬魚幼魚的行為學(xué)、基因改變和生化指標(biāo)等，初步探討trem2基因在AlNPs致神經(jīng)發(fā)育障礙中的作用，為后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

50 nm粒徑AlNPs購(gòu)自美國(guó)Sigma公司（分析純，純度為99.7%），TREM2 RNAi慢病毒試劑購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司，超純RNA提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司（日本），基因引物序列購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA（bicinchonininc acid）蛋白定量試劑盒、魚乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase, AChE）試劑盒購(gòu)自上海江萊生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器

ESEN-AW-SS1斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（北京愛(ài)生，中國(guó)），RO5O循環(huán)凈水機(jī)（Heal Force，中國(guó)香港），Nano-ZS90納米粒度儀（Malvern Paralytical，英國(guó)），JEM-100CX透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），ZXSR-1090真彩觸摸屏生化培養(yǎng)箱（上海智城，中國(guó)），EthoVison XT10動(dòng)物運(yùn)動(dòng)跟蹤系統(tǒng)（Noldus Information Technology，荷蘭），SYS-820顯微注射系統(tǒng)、P-97型玻璃微電極拉制儀（WPI公司，美國(guó)），SZX7體視顯微鏡、BX51倒置熒光屏數(shù)碼顯微鏡（OLYMPUS，日本），5424 R低溫高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），SB25-12DTDN超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物，中國(guó)），Image-Pro Plus圖像分析軟件（Media Cybernetics，美國(guó)），SpectraMax M 2全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio Tek Instruments公司，美國(guó)），QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)）。

1.2 納米顆粒的表征

將AlNPs溶于斑馬魚胚胎E3培養(yǎng)液（5 mmol·L-1NaCl、0.17 mmol·L-1KCl、0.33 mmol·L-1CaCl2和0.33 mmol·L-1MgSO4·7H2O，pH為7.2），懸濁液經(jīng)過(guò)30 min超聲混勻后，吸取少量液體滴到有炭膜的銅網(wǎng)上，待銅網(wǎng)干燥后，在透射電鏡（transmission electron microscope, TEM）下觀察粒子分散情況，加速電壓為80 kV，用圖像分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行平均粒徑分析，用納米粒度儀檢測(cè)Zeta電位。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Tu系野生型斑馬魚購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家斑馬魚資源中心（武漢，中國(guó)）。斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)環(huán)境為：水溫（28±1） ℃，導(dǎo)電率500～550 μS·cm-1，pH值為7.0～7.5，光照周期為光照14 h，黑暗10 h。每天規(guī)律喂食活體豐年蝦2次。實(shí)驗(yàn)前一天晚上將親魚按比例（雌∶雄=1∶2）放入交配缸中，并加入養(yǎng)殖系統(tǒng)中的水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天早晨開燈后拔去擋板，使雌魚和雄魚自然交配產(chǎn)卵并收集。

1.3.2 染毒液的配制

用天平稱?。?0.000±0.0001） mg的AlNPs溶于1 L配制好的E3胚胎培養(yǎng)液中，制備AlNPs懸濁液，所得染毒液的濃度為50 mg·L-1。使用超聲波振動(dòng)儀（100 W，30 kHz）將制備的染毒液超聲30 min使其混勻備用。

1.3.3 顯微注射及分組

收集1～4細(xì)胞期的斑馬魚胚胎于培養(yǎng)皿內(nèi)，使用P-97型玻璃微電極拉制儀制備玻璃毛細(xì)管針，打開顯微注射系統(tǒng)，在體視顯微鏡下將慢病毒注入胚胎的卵黃內(nèi)（注射濃度為0.5×108TU·mL-1，注射體積為500 pL，陰性對(duì)照組注射TREM2陰性對(duì)照慢病毒載體作為溶劑對(duì)照組）。將注射后的胚胎放入六孔板中，分為5組，每組30顆，每組設(shè)置3個(gè)平行，每天更換染毒液，共暴露144 h。實(shí)驗(yàn)分組分別為對(duì)照組（control）、陰性對(duì)照組（negative con）、TREM2敲低組（TREM2-）、納米氧化鋁組（AlNPs）和TREM2敲低+納米氧化鋁組（TREM2-/+AlNPs）。

1.3.4 形態(tài)學(xué)和生殖毒性實(shí)驗(yàn)

在 6 hpf（hours post-fertilization）時(shí)開始進(jìn)行暴露，每天更換染毒液，染毒至144 hpf。染毒結(jié)束后記錄斑馬魚的發(fā)育形態(tài)變化以及計(jì)數(shù)孵化、畸形和死亡情況。

1.3.5 行為學(xué)檢測(cè)

自發(fā)運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)：144 hpf暴露結(jié)束后，將24條幼魚隨機(jī)放入24孔板中，每孔隨機(jī)放入一條正常發(fā)育的幼魚。將24孔板放入行為學(xué)軌跡跟蹤系統(tǒng)內(nèi)，黑暗狀態(tài)下適應(yīng)1 min后開始實(shí)驗(yàn)，通過(guò)紅外攝像機(jī)實(shí)時(shí)拍攝幼魚3 min的運(yùn)動(dòng)視頻。通過(guò)軟件計(jì)算平均速度、移動(dòng)距離、外圈停留時(shí)間時(shí)間百分比、絕對(duì)轉(zhuǎn)角。通過(guò)分析上述指標(biāo)的改變來(lái)說(shuō)明幼魚的運(yùn)動(dòng)能力。

驚恐逃避反射實(shí)驗(yàn)：144 hpf暴露結(jié)束后，將裝有幼魚的24孔板放入行為學(xué)軌跡跟蹤系統(tǒng)內(nèi)，黑暗狀態(tài)下適應(yīng)1 min后開始實(shí)驗(yàn)，通過(guò)紅外攝像機(jī)實(shí)時(shí)拍攝幼魚7 min的運(yùn)動(dòng)視頻（設(shè)置光照周期為3 min黑暗期-1 min光照期-3 min黑暗期）。通過(guò)軟件計(jì)算幼魚光照期的速度變化來(lái)分析幼魚的對(duì)光驚恐反應(yīng)能力。

1.3.6 熒光定量PCR檢測(cè)

144 hpf暴露結(jié)束后，每組取30條幼魚置于2 mL的EP管中，使用Trizol法提取斑馬魚RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒的操作步驟進(jìn)行基因定量檢測(cè)。引物序列如表1所示。

1.3.7 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)

144 hpf 暴露結(jié)束后，每組取30條斑馬魚幼魚，用生理鹽水制備勻漿上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定幼魚組織中乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性。重復(fù)測(cè)定3次。

表1 基因引物序列信息Table 1 The sequence information of gene primer

1.3.8 氧化應(yīng)激檢測(cè)

144 hpf暴露結(jié)束后，每組取30條斑馬魚幼魚，用生理鹽水制備勻漿上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定幼魚組織中超氧化物歧化酶（SOD）的活性。重復(fù)測(cè)定3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SEM）。使用Shapiro-Wilk test和Levene分別對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析One-Way ANOVA和Tukey對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果（Results）

2.1 AlNPs及其表征

如圖1所示，AlNPs經(jīng)超聲混勻30 min后，將AlNPs在透射電子顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)其呈球形且無(wú)明顯大顆粒聚集現(xiàn)象，平均粒徑為（67.46±14.70） nm，平均Zeta電位為（45.4±8.13） mV。

圖1 納米氧化鋁顆粒（AlNPs）溶液在透射電鏡（TEM）下的分散情況Fig. 1 Dispersion of alumina nanoparticles （AlNPs） solution under a transmission electron microscope （TEM）

2.2 斑馬魚幼魚形態(tài)學(xué)和生殖毒性結(jié)果

144 hpf暴露結(jié)束后統(tǒng)計(jì)各組幼魚的死亡率、孵化率和畸形率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各處理組不同時(shí)間段發(fā)育情況無(wú)明顯差異。如圖2所示，各處理組均出現(xiàn)畸形情況，畸形類型有：脊柱彎曲、尾部畸形、心包水腫和卵黃囊水腫等。如圖3所示，各處理組的死亡率、孵化率和畸形率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。

2.3 AlNPs暴露影響斑馬魚幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力

斑馬魚幼魚在黑暗狀態(tài)下的運(yùn)動(dòng)行為如圖4所示。與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TREM2-組的平均速度降低（P=0.001）、移動(dòng)距離減小（P=0.001）、外圈停留時(shí)間百分比降低（P=0.02）、絕對(duì)轉(zhuǎn)角增大（P=0.01），差異顯著；AlNPs組的平均速度降低（P=0.02）、移動(dòng)距離減?。≒=0.001）、外圈停留時(shí)間百分比降低（P=0.01）、絕對(duì)轉(zhuǎn)角增大（P=0.002），差異顯著；TREM2-/+AlNPs組的平均速度降低（P=0.001）、移動(dòng)距離減?。≒=0.001）、外圈停留時(shí)間百分比降低（P=0.001）、絕對(duì)轉(zhuǎn)角增大（P=0.001），差異顯著。與AlNPs組相比，TREM2-/+AlNPs組的平均速度降低（P=0.016）、移動(dòng)距離減?。≒=0.007）、外圈停留時(shí)間百分比降低（P=0.013）、絕對(duì)轉(zhuǎn)角增大（P=0.041），差異顯著。斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡如圖5所示，在黑暗狀態(tài)下，對(duì)照組表現(xiàn)出對(duì)周圍環(huán)境進(jìn)行探索性游動(dòng)，而TREM2-組，AlNPs組和TREM2-/+AlNPs組表現(xiàn)出停滯，焦慮樣行為，軌跡變得雜亂，沒(méi)有規(guī)律。

2.4 AlNPs暴露導(dǎo)致斑馬魚幼魚驚恐反應(yīng)能力下降

斑馬魚幼魚對(duì)光刺激的驚恐反射表現(xiàn)如表2所示。當(dāng)受到光刺激時(shí)，各組幼魚的速度（mm·s-1）均發(fā)生不同程度的降低。與對(duì)照組相比，TREM2-組、AlNPs組和TREM2-/+AlNPs組的速度明顯降低（P=0.001），差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 斑馬魚幼魚TREM2基因表達(dá)下降

不同處理組的斑馬魚幼魚體內(nèi)TREM2基因的表達(dá)量如圖6所示。通過(guò)計(jì)算得trem2基因的抑制率約為47%。與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TREM2-組（P=0.001，P=0.003），AlNPs組（P=0.001，P=0.024），TREM2-/+AlNPs組（P=0.001）的基因表達(dá)量都顯著下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與AlNPs組相比，TREM2-/+AlNPs組的基因表達(dá)量降低，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）。

圖2 斑馬魚幼魚的畸形類型注：SC表示脊柱彎曲；TM表示尾巴畸形；PE表示心包水腫；YSE表示卵黃囊水腫。Fig. 2 Different types of malformations of zebrafish larvaeNote: SC indicates spinal curvature; TM indicates tail malformation; PE indicates pericardium edema; YSE indicates yolk sac edema.

圖3 斑馬魚幼魚死亡率、孵化率和畸形率（N=12）Fig. 3 Hatching rate, mortality rate and deformity rate of zebrafish larvae （N=12）

表2 斑馬魚幼魚對(duì)光驚恐反射的速度變化（N=24，X±SEM）Table 2 Changes of panic escape reflex velocity of zebrafish larvae under illumination （N=24, X±SEM）

圖4 斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為注：a表示與對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c表示與AlNPs組相比，P<0.05。Fig. 4 The motor behavior of zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with negative control group, P<0.05; c, compared with AlNPs group, P<0.05.

圖5 斑馬魚幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)軌跡圖Fig. 5 Trajectory of spontaneous movement behavior of zebrafish larvae

2.6 斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)下降

不同處理組的斑馬魚幼魚的神經(jīng)發(fā)育基因的表達(dá)如圖7所示。與對(duì)照組相比和陰性對(duì)照組相比，TREM2-組（P=0.001），AlNPs組（P=0.002，P=0.006）和TREM2-/+AlNPs（P=0.001）組的α1-tubulin基因的表達(dá)下降，差異顯著；TREM2-組（P=0.001），AlNPs組（P=0.005，P=0.006）和TREM2-/+AlNPs（P=0.001）組的mbp基因表達(dá)下降，差異顯著；TREM2-組（P=0.001），AlNPs組（P=0.005，P=0.006）和TREM2-/+AlNPs（P=0.001）組的syn2a基因表達(dá)下降，差異顯著。與AlNPs組相比，TREM2-/+AlNPs組的α1-tubulin基因（P=0.018）、mbp基因（P=0.009）表達(dá)下降，差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 斑馬魚幼魚神經(jīng)遞質(zhì)水平降低

不同處理組中斑馬魚幼魚體內(nèi)AChE活性如圖8所示，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TREM2-組、AlNPs組和TREM2-/+AlNPs組的AChE活性均有所下降，差異顯著（P=0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與AlNPs組相比，TREM2-/+AlNPs組的AChE活性顯著下降，差異顯著（P=0.001），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.8 斑馬魚幼魚體內(nèi)SOD活性降低

斑馬魚幼魚體內(nèi)SOD活性如圖9所示。與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，TREM2-組（P=0.001）、AlNPs組（P=0.046）和TREM2-/+AlNPs組（P=0.001）的SOD活性下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與AlNPs組相比，TREM2-/+AlNPs組的活性降低（P=0.005），差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論（Discussion）

斑馬魚在生物醫(yī)學(xué)研究中是一種重要的脊椎動(dòng)物模型，作為替代傳統(tǒng)哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)嘗試，因其和人類基因有著高度的同源性，且具有易于繁殖、快速的生長(zhǎng)周期以及光學(xué)透明性等優(yōu)點(diǎn)，斑馬魚已被用于毒理學(xué)[12-14]、遺傳學(xué)[15-16]和藥理學(xué)[17-18]等領(lǐng)域的研究。近年來(lái)，斑馬魚被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)毒性的研究[7, 19-21]。本研究以斑馬魚早期發(fā)育階段為研究模型，探索AlNPs對(duì)斑馬魚幼魚早期神經(jīng)發(fā)育的影響以及TREM2基因在神經(jīng)發(fā)育中的作用。

金屬氧化物納米顆粒的安全性一直備受關(guān)注，它的靶器官涉及人體各個(gè)組織器官，其中腦為主要的靶器官之一，它可以穿透血腦屏障，在腦內(nèi)蓄積。有研究顯示，氧化鋅納米顆粒可以對(duì)肝臟造成損傷[22]；納米氧化釹會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致心臟毒性[23]；納米二氧化鈦會(huì)抑制神經(jīng)發(fā)育和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)[7]等。關(guān)于AlNPs的毒性研究發(fā)現(xiàn)，AlNPs可以引起大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷以及炎癥反應(yīng)[24]。AlNPs還可以降低大鼠的神經(jīng)細(xì)胞活力，誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死[25]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，AlNPs可以誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡，發(fā)生過(guò)度自噬、氧化損傷及多巴胺傳遞受損，影響學(xué)習(xí)記憶能力[26-30]。

近年來(lái)，TREM2成為神經(jīng)退行性疾病的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)TREM2的突變可能會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的功能異常，它能夠通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力，介導(dǎo)神經(jīng)突觸的重塑[31-32]進(jìn)而引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，說(shuō)明其在腦組織損傷和修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在疾病狀態(tài)下，TREM2介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能受損，神經(jīng)細(xì)胞零星的死亡過(guò)程中釋放凋亡物質(zhì)，組織碎片清除延遲，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子增加，導(dǎo)致組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受破壞[33]。有研究指出TREM2與AD、FTD、PD和ALS等疾病都具有關(guān)聯(lián)，在多囊性脂膜性骨發(fā)育不良伴硬化性白質(zhì)腦?。╬olycystic lipomembranous osteodysplasia with sclerosing leukoencephalopathy, PLOSL）病人的腦中可以觀察到軸突和髓鞘丟失，發(fā)現(xiàn)TREM2功能缺失突變會(huì)導(dǎo)致PLOSL病[34-36]。在PD模型中，TREM2缺陷會(huì)加重α-突觸核蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)元丟失[37]。上述研究表明TREM2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定及神經(jīng)發(fā)育中起著重要的作用。

圖6 斑馬魚幼魚體內(nèi)TREM2基因的表達(dá)情況注：a表示與對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c表示與AlNPs組相比，P<0.05。Fig. 6 Expression of TREM2 gene in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with negative control group, P<0.05; c, compared with AlNPs group, P<0.05.

圖7 斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育基因的表達(dá)情況注：a表示與對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c表示與AlNPs組相比，P<0.05。Fig. 7 Expression of neural development genes in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with negative control group, P<0.05; c, compared with AlNPs group, P<0.05.

圖8 斑馬魚幼魚神經(jīng)遞質(zhì)水平注：a表示與對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c表示與AlNPs組相比，P<0.05。Fig. 8 Neurotransmitter level in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with negative control group, P<0.05; c, compared with AlNPs group, P<0.05.

圖9 斑馬魚幼魚超氧化物歧化酶（SOD）活性注：a表示與對(duì)照組相比，P<0.05；b表示與陰性對(duì)照組相比，P<0.05；c表示與AlNPs組相比，P<0.05。Fig. 9 Superoxide dismutase （SOD） activity in zebrafish larvaeNote: a, compared with control group, P<0.05; b, compared with negative control group, P<0.05; c, compared with AlNPs group, P<0.05.

目前關(guān)于TREM2在疾病中作用的研究多是從疾病病理角度觀察TREM2干預(yù)效果，因此，本研究從trem2基因干預(yù)角度出發(fā)，探索trem2基因?qū)υ缙谏窠?jīng)發(fā)育的影響，為進(jìn)一步研究TREM2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用提供依據(jù)。斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為檢測(cè)能夠整體反映斑馬魚的運(yùn)動(dòng)及神經(jīng)發(fā)育狀況，通常通過(guò)平均速度、移動(dòng)距離、外圈停留時(shí)間百分比、絕對(duì)轉(zhuǎn)角和活躍度等指標(biāo)進(jìn)行綜合性評(píng)估，在進(jìn)入新環(huán)境中斑馬魚會(huì)對(duì)周圍環(huán)境進(jìn)行探索性游動(dòng)，驚恐反應(yīng)能力一般通過(guò)明暗交替刺激來(lái)評(píng)估，通常以運(yùn)動(dòng)速度來(lái)表示其反映能力，反映神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示，AlNPs會(huì)導(dǎo)致斑馬魚神經(jīng)行為運(yùn)動(dòng)遲緩，運(yùn)動(dòng)速度和移動(dòng)距離有明顯的下降，對(duì)強(qiáng)光刺激的驚恐反應(yīng)能力也出現(xiàn)下降，而trem2基因的缺失導(dǎo)致神經(jīng)運(yùn)動(dòng)行為障礙變嚴(yán)重，這些結(jié)果與胡占英和張靖溥[38]的結(jié)果一致，表明trem2基因的敲低可能會(huì)加重AlNPs導(dǎo)致的神經(jīng)發(fā)育毒性，造成幼魚運(yùn)動(dòng)能力失調(diào)。髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein, MBP）是髓鞘形成的標(biāo)志物，α1微管蛋白（α1-tubulin）在軸突和樹突的發(fā)育和再生中起著重要作用[39-41]，而突觸蛋白（synapsin, SYN）是一種神經(jīng)磷蛋白質(zhì)，在突觸形成和神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中發(fā)揮重要作用，何夢(mèng)婷等[42]發(fā)現(xiàn)暴露于溴乙酰胺后斑馬魚α1-tubulin、mbp和syn2a基因表達(dá)有不同程度的降低，F(xiàn)u等[43]也發(fā)現(xiàn)斑馬魚暴露于雙酚A后mbp和syn2a的基因和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，本研究敲低trem2基因后發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)出現(xiàn)了不同程度的降低，表明trem2基因可能影響斑馬魚的神經(jīng)發(fā)育功能。乙酰膽堿酯酶（AChE）是膽堿能神經(jīng)傳遞的重要調(diào)節(jié)酶，它能水解遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh），終止其作用，許多研究已經(jīng)證明了膽堿能外周標(biāo)記物在伴有神經(jīng)功能障礙的疾病中的重要性，我們發(fā)現(xiàn)trem2基因的敲低及AlNPs會(huì)降低AChE的活性，提示機(jī)體的膽堿能神經(jīng)傳遞受到了干擾。氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素，當(dāng)氧化損傷發(fā)生時(shí)，SOD的活性會(huì)受到抑制，H2O2和O2失衡，生成的H2O2不能被及時(shí)清除且與其他金屬反應(yīng)生成毒性更大的羥基，加重機(jī)體的氧化應(yīng)激損傷[44]。本研究結(jié)果表明，AlNPs會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚機(jī)體SOD活性下降，trem2基因的缺失也會(huì)導(dǎo)致SOD活性下降，表明機(jī)體清除自由基的能力下降，機(jī)體發(fā)生了氧化損傷。

綜上所述，本研究通過(guò)行為學(xué)、神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因、AChE活性及SOD活性，探討了TREM2及AlNPs對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育毒性的作用，結(jié)果表明AlNPs可以通過(guò)氧化應(yīng)激抑制斑馬魚幼魚神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和神經(jīng)遞質(zhì)活性而引起神經(jīng)發(fā)育毒性，而trem2基因的缺失會(huì)加重AlNPs對(duì)機(jī)體的氧化損傷和神經(jīng)發(fā)育障礙，影響斑馬魚的發(fā)育。但本研究尚存在不足之處，如trem2基因與神經(jīng)發(fā)育的具體分子作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。