eDNA宏條形碼監(jiān)測(cè)沉積物原生生物群落多樣性

薛棋文，楊江華，張麗娟，張效偉,#，雷春生,*

1. 常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，常州 213164 2. 污染控制與資源化研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023

原生生物是由單細(xì)胞組成的微生物[1]，分布廣泛，以細(xì)菌、藻類等為食，并被后生生物等捕食，在水生食物網(wǎng)中占有重要地位[2]。而且，部分原生生物以水體中的碎屑或腐殖質(zhì)為食，擔(dān)任著凈化水體的重要功能，是食物鏈中不可或缺的一環(huán)[3]。原生生物生長(zhǎng)周期短，對(duì)水環(huán)境變化極為敏感，是水體富營(yíng)養(yǎng)化重要的指示生物之一。例如富營(yíng)養(yǎng)的湖泊與水質(zhì)較好的湖泊中纖毛蟲(chóng)的豐度存在巨大差異，在富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中纖毛蟲(chóng)豐度更高[4]。

目前，原生生物監(jiān)測(cè)主要基于自微型生物群落監(jiān)測(cè)方法（PFU法）[5]。將泡沫塑料塊放入監(jiān)測(cè)的水體中富集原生生物，帶回實(shí)驗(yàn)室后使用顯微鏡人工觀察原生生物群落的組成，判斷監(jiān)測(cè)水體區(qū)域的受污染狀況。雖然此方法操作易上手、成本較低，但是重污染地區(qū)原生生物聚集較慢，影響評(píng)估結(jié)果[6]，具有一定的局限性。監(jiān)測(cè)沉積物中原生生物則需要將環(huán)境樣品長(zhǎng)時(shí)間風(fēng)干，使用培養(yǎng)皿對(duì)孢子（原生生物在干旱條件下存活方式）進(jìn)行培養(yǎng)[7]，在顯微鏡下人工計(jì)數(shù)需要耗費(fèi)大量時(shí)間與精力且保存不易。同時(shí)原生生物易受到環(huán)境因子的影響而改變自身形態(tài)這一特性對(duì)人工鑒定造成了很大的困難[8]。

環(huán)境DNA（eDNA）宏條形碼技術(shù)為監(jiān)測(cè)沉積物原生生物多樣性提供了新的方法。生物參與生態(tài)過(guò)程時(shí)，會(huì)向環(huán)境中釋放含有DNA的分泌物，例如血液、糞便、脫落的組織結(jié)構(gòu)等[9]。這些游離于環(huán)境中的生物DNA片段被稱為環(huán)境DNA[10]。隨著測(cè)序技術(shù)發(fā)展，高通量測(cè)序（high-throughput sequencing）因其可以一次性將數(shù)據(jù)量巨大的DNA條形碼堿基信息進(jìn)行分類，使獲取環(huán)境中物種DNA信息成為了可能[11]。結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）可以識(shí)別環(huán)境中存在的低豐度的物種信息[12]。該技術(shù)最大的特點(diǎn)是能夠?qū)h(huán)境中微量存在的DNA條形碼堿基序列片段幾何數(shù)量級(jí)的擴(kuò)增，從而獲得環(huán)境中生物多樣性的信息[13]。eDNA宏條形碼比傳統(tǒng)方法具有更高的敏感度[14]，不需要目標(biāo)物種在采樣位點(diǎn)被觀測(cè)到[15]。eDNA技術(shù)檢測(cè)物種不直接對(duì)生物體進(jìn)行采樣，具有對(duì)稀有和難以捕捉物種的實(shí)地調(diào)查能力[16]。目前環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)已經(jīng)被用于監(jiān)測(cè)魚(yú)類、浮游等水生生物中[17]，但在我國(guó)湖泊沉積物研究中尚不多見(jiàn)。因此本項(xiàng)目擬以太湖流域?yàn)閷?duì)象：（1）建立基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)沉積物原生生物多樣性的方法；（2）評(píng)估沉積物原生生物完整性指數(shù)與水生態(tài)健康的關(guān)系。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 研究區(qū)域

太湖流域的河流、水庫(kù)和湖蕩等設(shè)置82個(gè)點(diǎn)位，每個(gè)點(diǎn)位一共采取3份等體積沉積物樣本，共采集246份樣品。分別在2019年3月和8月采集沉積物用于原生生物群落分析，采樣位點(diǎn)圖如圖1所示。

1.2 樣品的采集與處理

每個(gè)點(diǎn)位用尺寸為300 mm×208 mm×150 mm（長(zhǎng)×寬×高）的皮特森抓泥器采集4次，抓取表層深度約5 cm的沉積物，累計(jì)采集0.125～0.25 m2，采樣過(guò)程中避免水體的擾動(dòng)。將底泥混勻后取50 g裝入離心管中。每個(gè)位點(diǎn)采集3個(gè)平行樣品?，F(xiàn)場(chǎng)用干冰保存，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用-80 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

用凍干機(jī)將樣品中的水分凍干后拍打混勻，每份樣品取約0.3 mg，使用QIAGEN power soil kit 100試劑盒提取沉積物中DNA。使用18S RNA V9引物（上游引物序列CCTTCYGCAGGTTCACCTAC，下游引物序列TCCCTGCCHTTTGTACACAC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR在96孔板中進(jìn)行，每個(gè)96孔板均設(shè)有3個(gè)陰性對(duì)照（無(wú)菌水）。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否存在非特異性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系如下：2×Vazyme taq酶12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA樣品1 μL、無(wú)酶水10.5 μL。反應(yīng)條件為：（1）在95 ℃條件下預(yù)變性3 min；（2）95 ℃變性30 s；（3）62 ℃退火30 s；（4）72 ℃延伸15 s循環(huán)；（5）重復(fù)2到4步驟循環(huán)28次；（6）末次延伸72 ℃ 5 min。

圖1 采樣位點(diǎn)分布圖Fig. 1 Sampling sites map

PCR產(chǎn)物利用Ion torrent Proton平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序[18]。在EcoView軟件中去除Q<20的序列，保留讀長(zhǎng)130～170 bp的序列；使用UCHIME軟件篩查嵌合子序列信息，避免嵌合子污染去除重復(fù)、低頻序列，保留unique序列并排除測(cè)序過(guò)程中的隨機(jī)誤差；使用USEARCH程序類聚相似度97%以上的分類單元（OTU），類聚閾值參考18S rRNA基因通用類聚標(biāo)準(zhǔn)；在Protist Ribosomal Reference database（PR2）數(shù)據(jù)庫(kù)（版本號(hào)4.14.0）進(jìn)行物種信息注釋，并將注釋為古菌、細(xì)菌、葉綠體、線粒體和未知的序列去除，注釋結(jié)果從屬關(guān)系混亂的物種按照域界門(mén)綱目科屬種順序重新劃分，3份平行樣本中物種OTU出現(xiàn)2次及以上保留，數(shù)據(jù)四舍五入取整數(shù)均值。以上操作在Linux系統(tǒng)中完成?；谖锓NOTU水平、門(mén)水平和屬水平上分析eDNA技術(shù)區(qū)分物種alpha-多樣性的季節(jié)差異，使用T值檢驗(yàn)來(lái)判定；基于OTU與屬水平上分析beta-多樣性不同季節(jié)的差異，將OTU注釋文件在R語(yǔ)言中進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 指數(shù)計(jì)算方法

基于OTU分類單元水平與屬水平分析，使用R語(yǔ)言Vegan包計(jì)算alpha-多樣性與beta-多樣性。alpha-多樣性計(jì)算公式如下。

豐富度（Richness）指數(shù)計(jì)算公式：Richness即為OTU分類單元數(shù)

香農(nóng)（Shannon）指數(shù)計(jì)算公式：H=-∑（Pi）×（lnPi），Pi代表個(gè)體數(shù)與總體數(shù)之比

基于OTU分類單元水平與屬水平計(jì)算方法重復(fù)性指數(shù)，公式如下所示[19]：

3個(gè)平行樣本OTU的交叉率=3×共有的OTU數(shù)目/（平行1的OTU數(shù)目+平行2的OTU數(shù)目+平行3的OTU數(shù)目）。

考慮權(quán)重的OTU交叉率=（平行1共有的序列數(shù)+平行2共有的序列數(shù)+平行3共有的序列數(shù)）/（平行1的序列數(shù)+平行2的序列數(shù)+平行3的序列數(shù)）。

至少2個(gè)平行樣本出現(xiàn)的OTU交叉率=（2×只在2個(gè)平行中出現(xiàn)的OTU數(shù)目+3×3個(gè)平行共有的OTU數(shù)目）/（平行1的OTU數(shù)目+平行2的OTU數(shù)目+平行3的OTU數(shù)目）。

1.5 原生生物完整性評(píng)估

根據(jù)上述步驟得到的數(shù)據(jù)構(gòu)建原生生物完整性指數(shù)，該方法主要是篩選對(duì)環(huán)境干擾有明顯變化的原生生物多樣性指數(shù)來(lái)定量描述生物特性與環(huán)境影響因子的關(guān)系。首先根據(jù)原生生物特征篩選指標(biāo)；計(jì)算出多樣性指數(shù)的分布并做相關(guān)性分析篩選合適的指數(shù)；計(jì)算原生生物指標(biāo)值以及確定生物完整性指數(shù)的計(jì)算方法；確定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。按照以下步驟進(jìn)行構(gòu)建：首先確定參考點(diǎn)與受損點(diǎn)，在以往的研究中水庫(kù)位點(diǎn)常被認(rèn)為是生境較好的地帶，太湖流域北部的湖泊與河流均長(zhǎng)期處于水污染影響的狀態(tài)，水質(zhì)處于中國(guó)地表水標(biāo)準(zhǔn)3類水以下，故參考點(diǎn)選取水庫(kù)位點(diǎn)，受損點(diǎn)選取太湖北部地區(qū)位點(diǎn)，本研究取T1、T2、T3和T6水庫(kù)位點(diǎn)為參考點(diǎn)，取T46、T48、T72和T75河流位點(diǎn)為受損點(diǎn)，取相同位點(diǎn)3份平行樣本中多樣性指數(shù)均值計(jì)算原生生物完整性指數(shù)。隨著參考點(diǎn)與受損點(diǎn)變化，能夠明顯區(qū)分參考點(diǎn)與受損點(diǎn)的參數(shù)稱為顯著性差異指數(shù)，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)的以5%分位數(shù)作為參考值，下降趨勢(shì)的以95%分位數(shù)作為參考值。統(tǒng)一的參數(shù)量綱分值計(jì)算：下降的參數(shù)分?jǐn)?shù)為參考值/參數(shù)值；上升的參數(shù)分?jǐn)?shù)為（最大值-參考值）/（最大值-參考值）。最后統(tǒng)一進(jìn)行分?jǐn)?shù)匯總，按照25%、50%和75%人為劃分太湖流域生態(tài)健康狀態(tài)等級(jí)。

2 結(jié)果（Results）

2.1 原生生物群落組成

利用環(huán)境DNA技術(shù)檢測(cè)出82個(gè)位點(diǎn)共有6 215個(gè)OTU，其中原生生物有2 468個(gè)OTU，占總序列數(shù)的13%（圖2），隸屬13門(mén)44綱（表1）。其中有70%的分類單元能注釋到種，79%的分類單元能注釋到屬，91%的分類單元能注釋到科，97%的分類單元能注釋到目，98%的分類單元能注釋到綱，99%的分類單元能注釋到門(mén)。OTU序列數(shù)優(yōu)勢(shì)類群為纖毛蟲(chóng)門(mén)、絲足蟲(chóng)門(mén)、錐足亞門(mén)、甲藻門(mén)和頂復(fù)門(mén)等（圖2），其中纖毛蟲(chóng)門(mén)分類單元占原生生物總分類單元的37%，絲足蟲(chóng)門(mén)分類單元占原生生物總分類單元的30%，錐足亞門(mén)分類單元占原生生物總分類單元的10%，甲藻門(mén)分類單元占原生生物總分類單元的9%，頂復(fù)門(mén)分類單元占原生生物總分類單元的5%。

2.2 方法重復(fù)性研究

選取2次采樣位點(diǎn)中97個(gè)位點(diǎn)的樣本，樣本包含2個(gè)季度采樣重合位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)樣本包含3個(gè)平行樣本，共計(jì)291個(gè)樣本。

基于OTU計(jì)算與基于屬多樣性指數(shù)CV值分布絕大部分均處于0.15以下，可知環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)具有很好的方法重復(fù)性。隨機(jī)抽取1個(gè)點(diǎn)位（共3份平行樣本）的方法重復(fù)性研究示意圖如圖3所示。3個(gè)平行樣本均檢出的OTU占總OTU的21.7%，至少在2個(gè)平行樣本檢出的OTU占總OTU的47%。若考慮序列權(quán)重，3個(gè)平行樣本OTU交叉率達(dá)到63.50%，至少在2個(gè)平行樣本檢出的OTU所占比例達(dá)到84.25%。3個(gè)平行樣本出現(xiàn)的屬平均值的交叉率平均值為37.70%，至少在2個(gè)平行樣本出現(xiàn)的屬交叉率均值為62.15%。基于權(quán)重3個(gè)平行樣本出現(xiàn)的屬交叉率均值為91.33%，基于權(quán)重至少在2個(gè)平行樣本出現(xiàn)的屬交叉率均值為97.13%?；贠TU的多樣性指數(shù)豐富度CV值均值為12.5%；香農(nóng)指數(shù)CV值均值為4.9%；均勻度CV值均值為4.5%?；趯俚亩鄻有灾笖?shù)豐富度CV值均值為9.3%；香農(nóng)指數(shù)CV值均值為4%；均勻度CV值均值為3.7%，alpha-多樣性CV值分布如圖4所示。

圖2 原生生物OTU分布Fig. 2 Distribution of OTU in protist

表1 物種注釋表Table 1 Taxa annotation table

圖3 方法重復(fù)性研究示意圖注：A1～A3代表相同位點(diǎn)的3個(gè)平行樣本。Fig. 3 Schematic diagram of method repeatability studyNote: A1～A3 represent three parallel samples of the same samples.

2.3 原生生物群落alpha-多樣性季節(jié)差異

原生生物alpha-多樣性在不同季節(jié)存在顯著差異。對(duì)比2個(gè)季度的豐富度指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)、均勻度指數(shù)、分類單元數(shù)優(yōu)勢(shì)物種門(mén)相對(duì)豐度，基于OTU分類單元水平與屬水平進(jìn)行分析。T值檢驗(yàn)分析整體性差異結(jié)果顯示，基于OTU與基于屬計(jì)算的豐富度指數(shù)在時(shí)間尺度上具有顯著差異，而香農(nóng)指數(shù)與均勻度則未見(jiàn)顯著性差異（圖5）?；贠TU計(jì)算的原生生物優(yōu)勢(shì)物種豐富度指數(shù)，在不同季節(jié)中具有顯著差異類群為纖毛蟲(chóng)門(mén)、甲藻門(mén)、頂復(fù)門(mén)和盤(pán)嵴亞界（圖6）。

2.4 原生生物群落beta-多樣性

進(jìn)行春季（3月）和秋季（8月）原生生物群落主成分（PCA）分析，區(qū)分時(shí)間尺度上群落結(jié)構(gòu)的變化。不同季節(jié)原生生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著（圖7）。

2.5 利用原生生物完整性指數(shù)評(píng)價(jià)水生態(tài)健康

不同季節(jié)指標(biāo)篩選：本研究篩選了2個(gè)季度15個(gè)評(píng)價(jià)參數(shù)（表2）。甲藻門(mén)豐富度、甲藻門(mén)香農(nóng)指數(shù)、甲藻門(mén)相對(duì)豐度和纖毛蟲(chóng)相對(duì)豐度4個(gè)指數(shù)在3月的參考點(diǎn)與受損點(diǎn)之間具有顯著性差異；纖毛蟲(chóng)香農(nóng)指數(shù)、絲足蟲(chóng)豐富度、基于OTU的香農(nóng)指數(shù)和基于OTU的豐富度在8月的參考點(diǎn)與受損點(diǎn)之間存在顯著性差異（圖8）。

3月的各類指數(shù)中，參考點(diǎn)與受損點(diǎn)之間甲藻門(mén)豐富度、甲藻門(mén)香農(nóng)指數(shù)和甲藻門(mén)相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，纖毛蟲(chóng)相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)。8月的各類指數(shù)中，參考點(diǎn)與受損點(diǎn)之間基于OTU的豐富度、香農(nóng)指數(shù)、絲足蟲(chóng)豐富度和纖毛蟲(chóng)香農(nóng)指數(shù)均呈下降趨勢(shì)。生物完整性指數(shù)校正表如表3所示，春季（3月）與秋季（8月）水生態(tài)健康評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表4所示。評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，3月與8月采樣位點(diǎn)生態(tài)健康等級(jí)具有一致性（圖9）。

圖4 alpha-多樣性指數(shù)CV值Fig. 4 CV value of alpha diversity index

圖5 多樣性指數(shù)非獨(dú)立樣本T值檢驗(yàn)注：**代表P<0.001；***代表P<0.0001；ns表示不顯著。Fig. 5 T value test of non independent samples based on OTU diversity indexNote: **represents P<0.001; ***represents P<0.0001; ns represents not significant.

圖6 不同采樣季節(jié)對(duì)原生生物優(yōu)勢(shì)物種的影響注：*代表P<0.05，**代表P<0.001，***代表P<0.0001；ns表示不顯著。Fig. 6 Effects of different sampling seasons on dominant protist speciesNote: *represents P<0.05; **represents P<0.001; ***represents P<0.0001; ns represents not significant.

表2 指數(shù)篩選表Table 2 Index screening table

圖7 原生生物群落PCA分析Fig. 7 PCA analysis of protist community

圖8 原生生物完整性差異指數(shù)Fig. 8 Protist community index screening

表3 指數(shù)校正表Table 3 Index correction table

圖9 太湖流域生態(tài)健康等級(jí)分布Fig. 9 Distribution of ecological health grades in Tai Lake Basin

表4 原生生物完整性指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)Table 4 Integrity index standard of benthic protist

3 討論（Discussion）

3.1 生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)

準(zhǔn)確的原生生物監(jiān)測(cè)仍然需要進(jìn)一步完善本土物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。由于我國(guó)還未建立本土原生生物物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)，本次原生生物的注釋采用的是國(guó)際通用的PR2數(shù)據(jù)庫(kù)，仍然存在無(wú)法注釋的OTU，注釋結(jié)果并不能完全包含太湖流域沉積物原生生物信息，未來(lái)尚需開(kāi)展大規(guī)模的本土物種DNA信息建庫(kù)的研究工作。

3.2 eDNA技術(shù)的重復(fù)性評(píng)價(jià)

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)生物系統(tǒng)多樣性方面體現(xiàn)出了極大的應(yīng)用潛力[20]，但是關(guān)于該技術(shù)對(duì)沉積物原生生物監(jiān)測(cè)的重復(fù)性與穩(wěn)定性的研究較少[21]。精準(zhǔn)度會(huì)影響監(jiān)測(cè)結(jié)果在時(shí)間尺度與空間尺度上的比較[22]，重復(fù)性是一個(gè)重要的衡量依據(jù)，體現(xiàn)了一項(xiàng)監(jiān)測(cè)技術(shù)的穩(wěn)定性與可行度[23]。使用環(huán)境DNA技術(shù)分析的對(duì)象主要是OTU[24]，因此基于分類單元的技術(shù)重復(fù)性分析結(jié)果舉足輕重。本研究中發(fā)現(xiàn)雖然至少在2個(gè)平行樣本中檢出的OTU的平均交叉率只有47%，但是基于序列權(quán)重的交叉率達(dá)到84.25%，說(shuō)明平行樣本間共有的OTU覆蓋了絕大多數(shù)的優(yōu)勢(shì)物種，某一個(gè)平行中特有的OTU主要為低豐度OTU，在環(huán)境中分布不均勻，并不影響技術(shù)重復(fù)性研究的最終結(jié)論，這一現(xiàn)象側(cè)面反映了環(huán)境DNA技術(shù)具有極高的獲取環(huán)境中物種信息的能力。

3.3 沉積物原生生物多樣性的季節(jié)差異

基于OTU與基于屬計(jì)算的原生生物alpha-多樣性指數(shù)在豐富度上存在著顯著性差異，然而其他指數(shù)并不存在類似差異，豐富度指數(shù)表示OTU的分類單元數(shù)，說(shuō)明3月原生生物群落比8月具有更多的種，而8月原生生物群落在豐度、分布上與3月差別并不明顯。beta-多樣性在季節(jié)上差異不顯著，這可能是由于沉積物中的環(huán)境DNA存在隨著時(shí)間的累積過(guò)程，反映的是近段時(shí)間內(nèi)生物組成，另外，相比水樣中的DNA，沉積物DNA受外界溫度、光照、水流等因素影響更小。

3.4 環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測(cè)沉積物原生生物的展望

利用水環(huán)境中的各種生物多樣性參數(shù)的指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)生境整體的好壞，這些指標(biāo)被稱為水質(zhì)生物評(píng)價(jià)參數(shù)[25]。國(guó)內(nèi)使用該方法評(píng)價(jià)生態(tài)健康已有60多年，相比理化參數(shù)，生物指數(shù)可以更加直接地指示生態(tài)健康。水體中的原生生物主要生活在沉積物中，遷移活動(dòng)依靠水流等被動(dòng)作用，因此生物活動(dòng)位置較其他水體生物穩(wěn)定[26]。沉積物是污染物長(zhǎng)期匯集的場(chǎng)所，易受污染的影響而改變?nèi)郝浣Y(jié)構(gòu)與生物多樣性[27]，所以沉積物原生生物群落的各種生物多樣性指數(shù)可以反映長(zhǎng)期以來(lái)水環(huán)境生態(tài)健康狀態(tài)[28]。

太湖流域一直以來(lái)是環(huán)境監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)研究的熱點(diǎn)地區(qū)，大多數(shù)研究基于浮游動(dòng)植物[29]、水體大型生物如魚(yú)類[30]開(kāi)展研究，鮮有研究關(guān)注沉積物中的原生生物群落[31]。在環(huán)境DNA技術(shù)的支撐下，構(gòu)建基于原生生物完整性指數(shù)用于評(píng)價(jià)水生態(tài)健康[32]，使用原生生物完整性指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)水生態(tài)健康具有一定意義上的方法學(xué)補(bǔ)充與數(shù)據(jù)參考價(jià)值[33]，但參考點(diǎn)與受損點(diǎn)的選取不可避免存在著研究人員的主觀因素，不能完全代表監(jiān)測(cè)區(qū)域的水生態(tài)健康狀態(tài)。常規(guī)監(jiān)測(cè)中，建議使用沉積物原生生物群落來(lái)構(gòu)建生物完整性指數(shù)用于評(píng)價(jià)長(zhǎng)期的生態(tài)健康狀態(tài)。沉積物中污染物濃度與組成更多反映了水環(huán)境長(zhǎng)期的變化趨勢(shì)，起伏較低、更為穩(wěn)定，同時(shí)不受光照等影響，底層水溫主要受季節(jié)變化的影響，溫度變化波動(dòng)較小。

環(huán)境DNA技術(shù)為彌補(bǔ)了傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)方法的不足[34]，不依賴于專業(yè)物種鑒定專家，更加快速高效且可標(biāo)準(zhǔn)化，不需要對(duì)沉積物原生生物進(jìn)行培養(yǎng)，降低了時(shí)間成本[35]，避免了因培養(yǎng)條件限制而遺漏重要物種的可能性。未來(lái)通過(guò)進(jìn)一步的技術(shù)研發(fā)，如數(shù)據(jù)庫(kù)完善、方法的標(biāo)準(zhǔn)化，可實(shí)現(xiàn)在實(shí)際的水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)和評(píng)估上的廣泛應(yīng)用。