異菌脲在油菜植株、土壤和水中的代謝途徑及代謝物3,5-DCA的毒性研究

汪震，華修德，施海燕，王鳴華

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095

異菌脲（iprodione）是二甲酰亞胺類高效廣譜保護(hù)性殺菌劑。其作用機(jī)理是抑制蛋白激酶，控制許多細(xì)胞功能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，包括與碳水化合物結(jié)合進(jìn)入真菌細(xì)胞組分，起到干擾作用，既可抑制真菌孢子萌發(fā)和產(chǎn)生，也可抑制菌絲生長(zhǎng)，主要防治由灰葡萄孢屬[1]、叢梗孢屬[2]、核盤(pán)菌屬[3]、小菌核菌屬和交鏈孢屬[4]等引起的多種蔬菜、果樹(shù)和果實(shí)貯藏期病害[5]。據(jù)中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)登記的含有異菌脲的產(chǎn)品有161個(gè)，其中登記在油菜上防治油菜菌核病的產(chǎn)品有9個(gè)。

化學(xué)農(nóng)藥的代謝產(chǎn)物和代謝途徑受環(huán)境因素影響其轉(zhuǎn)化過(guò)程復(fù)雜多樣[6]。研究證明，有些農(nóng)藥代謝物的毒性比母體化合物更大。例如，Zhang等[7]通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丙硫菌唑的主要代謝物脫硫丙硫菌唑的細(xì)胞毒性高于母體；Gao等[8]研究發(fā)現(xiàn)乙蟲(chóng)腈的代謝產(chǎn)物乙蟲(chóng)腈亞砜對(duì)斑馬魚(yú)的毒性是母體的6倍；Liu等[9]報(bào)道了吡丙醚在5種土壤中的主要降解產(chǎn)物4-羥基-吡丙醚對(duì)蚯蚓的毒性遠(yuǎn)高于母體吡丙醚。因此，研究和評(píng)估農(nóng)藥代謝產(chǎn)物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)對(duì)食品安全和生態(tài)安全具有重要的意義[10-12]。研究表明，異菌脲在植物表面主要通過(guò)脫鹵反應(yīng)發(fā)生代謝[13]。此外，研究發(fā)現(xiàn)3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）是二甲酰胺類殺菌劑（異菌脲、腐霉利和乙烯菌核利）在植物和環(huán)境中的代謝產(chǎn)物之一。Ambrus等[14]報(bào)道了二甲酰亞胺類殺菌劑在大豆、黃瓜和花生等植物上的主要代謝物之一為3,5-DCA。Rifai等[15]發(fā)現(xiàn)3,5-DCA是腐霉利的光解產(chǎn)物。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局（U.S. Environmental Protection Agency, US EPA）報(bào)道了3,5-DCA比母體化合物具有更強(qiáng)的毒性和持久性[16]。Dom等[17]研究發(fā)現(xiàn)，3,5-DCA對(duì)羊角月牙藻的72 h-EC50值為14.5 mg·L-1，對(duì)大型溞的48 h-EC50值為0.60 mg·L-1。Lai等[18]研究發(fā)現(xiàn)異菌脲代謝產(chǎn)物3,5-DCA對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的毒性高于母體異菌脲。因此，聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO）規(guī)定乙烯菌核利的殘留定義為乙烯菌核利及其所有含3,5-DCA部分的代謝產(chǎn)物之和[19]。異菌脲在我國(guó)主要用于防治油菜菌核病，其在發(fā)揮藥效作用的同時(shí)，也會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，還會(huì)降解產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。因此，開(kāi)展異菌脲在油菜上的代謝研究至關(guān)重要，有助于明確其代謝途徑。同時(shí)研究異菌脲代謝產(chǎn)物3,5-DCA的生態(tài)毒性對(duì)于異菌脲的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要的意義，可為異菌脲的殘留物定義提供參考信息。本文通過(guò)室內(nèi)模擬試驗(yàn)，采用UPLC-TOF-MS/MS研究異菌脲在油菜植株、土壤和水中的代謝產(chǎn)物，推測(cè)異菌脲可能的代謝途徑，并研究了代謝產(chǎn)物3,5-DCA對(duì)Hep G2細(xì)胞和蚯蚓的毒性。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 供試材料

供試土壤：選用江蘇省南京市0～20 cm未被污染的耕作層土壤，實(shí)驗(yàn)前先將土壤活化一周，將活化后的土壤室內(nèi)陰干，過(guò)2.0 mm篩，置于常溫下備用。供試油菜：采用甘藍(lán)型油菜品種（揚(yáng)油1號(hào)），油菜籽購(gòu)于江蘇金土地種業(yè)有限公司。細(xì)胞株：選用肝癌Hep G2細(xì)胞系為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，由中?guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。供試蚯蚓：赤子愛(ài)勝蚓（Eiseniafoetida），由江蘇省鎮(zhèn)江市句容蚯蚓養(yǎng)殖場(chǎng)提供，并在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)14 d后，選擇體質(zhì)量在0.30～0.60 g的具有生殖環(huán)帶的蚯蚓進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

異菌脲標(biāo)準(zhǔn)品（99.5%，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；3,5-DCA標(biāo)準(zhǔn)品（98%，上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司）；色譜純正己烷、乙腈、甲醇（美國(guó)TEDIA公司）；CCK-8試劑盒（北京Solarbio生物有限公司），其他化學(xué)試劑均為分析純。島津LC 20ADXR液相色譜（Shimadzu，日本）串聯(lián)AB SCIEX Triple TOF 5600質(zhì)譜儀（AB SCIEX，美國(guó)）；Forma Series II二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Electron）；M5多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Dexices）。

1.3 水解

用pH 7的Clark-Lubs緩沖溶液配制5 mg·L-1異菌脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲混勻，分裝于棕色容量瓶中，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光密閉培養(yǎng)，于0、3、6、12、24和48 h采集水樣分析，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.4 土壤降解

參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270—2014），準(zhǔn)確稱取50.0 g土壤，加入5 mL濃度為200 mg·L-1的異菌脲丙酮溶液，攪拌均勻，置于避光通風(fēng)處，待有機(jī)溶劑揮發(fā)后，再與200 g土壤充分混合，使土壤中的終濃度為4 mg·kg-1，分裝在50 mL離心管中（每管10.0 g），含水量保持在飽和持水量的60%，置于（25±1） ℃黑暗的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、3、7、14、21、35和63 d取樣分析。記錄所有離心管的原始質(zhì)量，培養(yǎng)過(guò)程中每2 d添加水分使質(zhì)量保持初始水平，保持土壤原有的持水量。另設(shè)不加異菌脲的土壤作為空白對(duì)照和溶劑對(duì)照，設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 植物代謝

按照文獻(xiàn)方法[20-22]，對(duì)油菜種子進(jìn)行消毒和萌發(fā)。萌發(fā)后選取5～7葉期的健康幼苗，將其移至含Hogland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)瓶中，待其穩(wěn)定生長(zhǎng)后，用小型手持式噴霧在油菜葉表面均勻噴施50 mL 10 mg·L-1的異菌脲水溶液（含0.1% Triton X-100），置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)（光周期14 h·d-1，溫度（25±1） ℃，相對(duì)濕度75%）培養(yǎng)。在處理后的3 h、6 h、1 d、3 d、6 d、9 d和16 d采集植株樣品檢測(cè)，每次隨機(jī)取3株。另設(shè)不施藥的空白對(duì)照和溶劑對(duì)照。

1.6 樣品分析方法

1.6.1 樣品提取

土壤：稱取土壤樣品10.0 g于50 mL離心管中，添加5 mL水和30 mL乙腈，渦旋10 min后再超聲15 min，加入2.0 g無(wú)水MgSO4和3.0 g NaCl，渦旋5 min，隨后以4 000 r·min-1離心5 min，取一半上清液過(guò)無(wú)水Na2SO4后減壓濃縮，2 mL色譜乙腈溶解定容，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

油菜植株：稱取剪碎后的油菜植株樣品10.0 g于250 mL三角瓶中，加入10 mL水和30 mL乙腈，振蕩1 h，抽濾后置于含有3.0 g NaCl的具塞量筒中，充分振蕩1 min，靜置30 min，取一半上清液，減壓濃縮，用2 mL色譜乙腈定容，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)。

水樣：取2 mL水樣直接進(jìn)樣分析。

1.6.2 LC-MS儀器檢測(cè)條件

LC-MS的分析采用島津LC 20ADXR液相色譜串聯(lián)AB SCIEX Triple TOF 5600質(zhì)譜儀，色譜柱Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×50 mm，2.7 μm；Aglient），流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣體積5 μL，流動(dòng)相由0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）組成，采用梯度洗脫：0～0.5 min，90% A；0.5～2.5 min，90%～40% A；2.5～9.0 min，40% A；9.0～10.0 min，40%～5% A；10.0～14.0 min，5% A；14.0～14.2 min，5%～90% A；14.2～16.0 min，90% A。分析時(shí)間16 min。

質(zhì)譜參數(shù)：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下，Q-TOF-MS電離模式采用電噴霧離子化正離子源（ESI+），m/z掃描范圍50～500，離子噴霧電壓5 500 V，源溫度550 ℃，霧化氣4.48×106Pa，加熱氣4.48×106Pa，簾氣2.41×106Pa去簇電壓80 V，碰撞能量40 V，碰撞能量擴(kuò)散20 eV，離子釋放延遲67 ms，離子釋放寬度25 ms。

1.7 細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性測(cè)定選用細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的Hep G2細(xì)胞以1×105～4×105個(gè)·mL-1的初始密度接種于96孔板中，每孔100 μL，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h（37 ℃、5% CO2）；吸出培養(yǎng)液換為不同濃度的含藥培養(yǎng)液（異菌脲濃度為50、100、200、250和300 mg·L-1；3,5-DCA濃度為25、50、100、150和200 mg·L-1），染毒24 h；向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度值。按式（1）計(jì)算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%

（1）

式中：As為試驗(yàn)孔吸光度（含有細(xì)胞和待測(cè)物的培養(yǎng)基）；Ac為對(duì)照組吸光度（含有細(xì)胞的培養(yǎng)基，無(wú)待測(cè)物）；Ab為空白孔吸光度（含有培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和待測(cè)物）。

1.8 蚯蚓毒性

按照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270—2014）中蚯蚓急性毒性人工土壤法進(jìn)行3,5-DCA對(duì)蚯蚓的急性毒性實(shí)驗(yàn)，設(shè)7個(gè)濃度組（10、20、30、40、50、60和70 mg·kg-1），并設(shè)空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10條蚯蚓。觀察并記錄蚯蚓的中毒癥狀和死亡數(shù)（用針輕觸蚯蚓尾部，蚯蚓無(wú)反應(yīng)則為死亡），及時(shí)清除死蚯蚓。統(tǒng)計(jì)第7天和第14天的死亡率，計(jì)算LC50。同時(shí)使用氯乙酰胺作為參比物質(zhì)中測(cè)定蚯蚓對(duì)化合物的敏感性。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 異菌脲在水中代謝產(chǎn)物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲及其代謝產(chǎn)物在水中的提取離子圖如圖1（a）所示。在保留時(shí)間為11.81、7.98、8.00、6.91、11.46、11.76和6.53 min分別發(fā)現(xiàn)了代謝產(chǎn)物M1（C13H15Cl2N3O4）、M2（C12H15Cl2N3O2）、M4（C8H8Cl2N2O）、M5（C13H14ClN3O3）、M7（C9H6Cl2N2O2）、M8（C9H8Cl2N2O3）和M9（C6H5Cl2N）。根據(jù)各代謝產(chǎn)物的分子離子峰、質(zhì)荷比、典型碎片、二級(jí)質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)，確定了代謝物的結(jié)構(gòu)，如表1所示。

圖1 異菌脲（IPR）及其代謝產(chǎn)物在水（a）、油菜植株（b）和土壤（c）樣品中的提取離子圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of iprodione （IPR） and its metabolites from UPLC-TOF-MS/MS analysis in water （a）, rape plant （b） and soil （c） samples

根據(jù)代謝產(chǎn)物推斷異菌脲在水中可能的代謝途徑，如圖2所示。因?yàn)楫惥迨嵌柞啺奉悮⒕鷦?，結(jié)構(gòu)式中二氧代咪唑烷的酰胺鍵不穩(wěn)定，易發(fā)生水解反應(yīng)。此外，還發(fā)生了C—N鍵斷裂，N-脫烷基化反應(yīng)。異菌脲（M0）二氧代咪唑烷4號(hào)位酰胺鍵發(fā)生水解形成一級(jí)代謝產(chǎn)物M1；2號(hào)位的羰基水解形成M2，M2的脲酰胺鍵斷裂產(chǎn)生代謝物M4。異菌脲苯環(huán)上脫去Cl原子形成M5；還可以通過(guò)水解作用形成M7，M7的咪唑烷繼續(xù)水解形成代謝物M8，最終水解形成代謝物3,5-DCA（M9）。

2.2 異菌脲在油菜植株中代謝產(chǎn)物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲及其代謝產(chǎn)物在油菜植株上的提取離子圖如圖1（b）所示。保留時(shí)間11.81、12.30、11.54和11.46 min分別為M1、M3（C11H13Cl2N3O2）、M6（C10H7Cl2N3O3）和M7這4種代謝物。M3和M6結(jié)構(gòu)式如表1所示。

植物對(duì)外源化合物的解毒代謝主要分為3個(gè)階段，其中Ⅰ相代謝是由植物酶介導(dǎo)的催化反應(yīng)和非生物降解過(guò)程，包括氧化、水解和還原等[23]。參與Ⅰ相代謝的酶主要包括植物細(xì)胞色素P450、漆酶、含銅多酚的氧化酶、羧酸酯酶和硝基還原酶等[24]。同時(shí)農(nóng)藥在植物角質(zhì)層還會(huì)發(fā)生光解和非酶介導(dǎo)的水解[25]。Ⅰ相代謝是植物代謝最重要的一步，起到解毒作用。Liu等[26]研究報(bào)道了玉米體內(nèi)P450酶參與了煙嘧磺隆的降解過(guò)程；Huang等[27]鑒定表達(dá)了水稻2個(gè)水稻漆酶基因（LOC_Os01g63180和LOC_Os12g15680），發(fā)現(xiàn)能降解莠去津和異丙隆，并檢測(cè)到相應(yīng)代謝物羥基脫氫莠去津（HDHA）和2-OH-異丙基-異丙隆。異菌脲在油菜植株中可能的代謝途徑如圖2所示。進(jìn)入油菜植株的異菌脲首先進(jìn)行Ⅰ相代謝，通過(guò)水解作用產(chǎn)生M1、M3、M6和M7共4種代謝物，后3種與Ambrus等[14]的研究結(jié)果一致，而M1首次在油菜中發(fā)現(xiàn)。代謝物M1也在水解試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，因此可能是M1由植物表面非酶介導(dǎo)的水解過(guò)程中產(chǎn)生。綜合分析異菌脲在油菜上產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，推測(cè)異菌脲在油菜上的代謝是由于多種植物酶介導(dǎo)的體內(nèi)代謝與非酶介導(dǎo)的化學(xué)降解共同作用的。

2.3 異菌脲在土壤中代謝產(chǎn)物的鑒定及代謝途徑分析

異菌脲在土壤中代謝產(chǎn)物的提取離子圖如圖1（c）所示，發(fā)現(xiàn)了5種代謝物（M1、M3、M6、M7和M8）。由圖2可知，異菌脲在土壤中的降解途徑主要是通過(guò)非生物降解為代謝物M1和M3，通過(guò)生物降解為代謝物M6、M7和M8。Athiel等[28]和Mercadier等[29]提出了土壤微生物降解異菌脲的代謝途徑，微生物可將異菌脲水解為N-（3,5-二氯苯基）-咪唑啉-2,4-二氧咪唑烷（M7）和3,5-二氯苯基脲-乙酸（M8）。Campos等[30]從土壤中分離出菌株C1通過(guò)水解可產(chǎn)生代謝物M7和M8?？梢?jiàn)，異菌脲在土壤中的降解包括水解酶參與的微生物降解，通過(guò)水解反應(yīng)形成代謝產(chǎn)物M7和M8。此外，本文還檢測(cè)出代謝產(chǎn)物M6，推測(cè)M6是降解過(guò)程中的中間產(chǎn)物。Athiel等[28]研究發(fā)現(xiàn)，異菌脲可通過(guò)非生物轉(zhuǎn)化形成N-（（3,5-二氯苯基）氨甲?；?N-（異丙基氨甲酰基）甘氨酸，與本文M1的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)式一致，因此推測(cè)代謝物M1和M3是通過(guò)化學(xué)水解形成，是非生物降解途徑。

表1 異菌脲及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜信息匯總Table 1 Summary of all MS and MS2 data for metabolites of iprodione

圖2 異菌脲在水、油菜植株和土壤中可能的代謝途徑Fig. 2 Proposed pathways of iprodione in water, rape plants and soil

通過(guò)對(duì)異菌脲在土壤、水和油菜植株中的代謝產(chǎn)物及代謝途徑研究發(fā)現(xiàn)，異菌脲在土壤中的代謝主要是微生物參與的水解反應(yīng)，在水相中的代謝主要為化學(xué)水解，在油菜植株中主要為降解酶參與的N-脫烷基化和水解反應(yīng)。因此，推測(cè)異菌脲的水解作用是其在環(huán)境和植株中代謝的主要機(jī)制。

2.4 異菌脲及其代謝產(chǎn)物3,5-DCA的細(xì)胞毒性

如表2所示，異菌脲對(duì)Hep G2的IC50為304.8 mg·L-1，代謝物3,5-DCA的IC50為99.7 mg·L-1，3,5-DCA對(duì)Hep G2細(xì)胞毒性是異菌脲的3.1倍，表明異菌脲的代謝屬于增毒代謝。3,5-DCA也是乙烯菌核利的代謝產(chǎn)物，Lee等[31]等研究發(fā)現(xiàn)3,5-DCA對(duì)Hep G2細(xì)胞株的存活率有顯著影響，IC50為70.48 mg·L-1，而經(jīng)228.89 mg·L-1乙烯菌核利暴露的Hep G2細(xì)胞的存活率沒(méi)有顯著下降，表明其對(duì)細(xì)胞的毒性也顯著高于母體。

2.5 3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓的急性毒性

參比試驗(yàn)結(jié)果顯示14 d-LC50為28.15 mg a.i.·kg-1（干質(zhì)量），達(dá)到國(guó)標(biāo)中規(guī)定的20～80 mg a.i.·kg-1（干質(zhì)量）范圍，證明實(shí)驗(yàn)蚯蚓對(duì)化合物敏感，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

人工土壤法測(cè)定3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓急性毒性結(jié)果如表3所示。結(jié)果顯示，3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓7 d、14 d-LC50分別為53.29 mg·kg-1和31.56 mg·kg-1。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》（GB/T 31270—2014）中農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性等級(jí)劃分，3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓為低毒（>10 mg·kg-1）。根據(jù)國(guó)際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC），人工土壤法下異菌脲對(duì)赤子愛(ài)勝蚓急性毒性的LC50>500 mg·kg-1，3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓急性毒性約為其母體的15倍以上。由此可知，異菌脲在代謝過(guò)程中增加了對(duì)土壤生物蚯蚓的毒性效應(yīng)。

本文通過(guò)高分辨質(zhì)譜，鑒定了異菌脲在水中的7種代謝產(chǎn)物（M1、M2、M4、M5、M7、M8和M9）、土壤中的5種代謝物（M1、M3、M6、M7和M8）和油菜植株中的4種代謝產(chǎn)物（M1、M3、M6和M7），推測(cè)了異菌脲的代謝途徑。其中，代謝產(chǎn)物M4和M5為首次在水中發(fā)現(xiàn)，M1是油菜植株中新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物，完善了異菌脲的代謝途徑。異菌脲在油菜上的代謝途徑與其在大豆、黃瓜和花生中的代謝途徑相同，主要是通過(guò)酰胺鍵的裂解（水解作用）和C—N鍵斷裂（N-脫烷基化）。細(xì)胞毒性和蚯蚓毒性試驗(yàn)結(jié)果表明異菌脲的代謝屬于增毒代謝。本文探究了異菌脲在水、土壤和油菜中的代謝產(chǎn)物和代謝途徑，明確了異菌脲在作物和環(huán)境中的代謝途徑，并為異菌脲及其代謝物3,5-DCA的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了相關(guān)理論依據(jù)。

表2 異菌脲和3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）的細(xì)胞毒性Table 2 Cytotoxicity of iprodione and 3,5-dichloroaniline （3,5-DCA）

表3 3,5-DCA對(duì)赤子愛(ài)勝蚓LC50Table 3 The LC50 of 3,5-DCA to Eisenia foetida