范金平，張盈，魏進(jìn)，羅世霞，段婷婷

1. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴陽 550092 2. 貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025

二氯喹啉酸（quinclorac），又名快殺稗、稗草凈、殺稗靈和神鋤等[1]，結(jié)構(gòu)式如圖1（a）所示，是一種激素類內(nèi)吸式喹啉酸類芽前、芽后低毒性除草劑，常用于稗草的防治[2]，它的作用方式是過度刺激生長，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂。由于具有施用適期寬、劑量小、防治效果好及持效期長等優(yōu)點(diǎn)，常被廣泛運(yùn)用于防除稻田雜草[3]。據(jù)相關(guān)報(bào)道，中國使用的除草劑中二氯喹啉酸的使用量排在前十，平均每年的銷售額達(dá)4 121萬美元[4]。但由于其持效期長，在土壤中易于積累而影響后茬作物的生長發(fā)育[5-6]，導(dǎo)致后茬作物畸形生長；例如，在煙-稻輪作系統(tǒng)下，施用超過推薦劑量25%時二氯喹啉酸會增加后茬作物煙葉的畸形率，從而使煙葉產(chǎn)量降低[7]。此外，殘留在環(huán)境中的二氯喹啉酸會導(dǎo)致動物生長發(fā)育不良，生殖異常以及變態(tài)發(fā)育[8]。因此，人們也越來越重視其對動植物產(chǎn)生的危害。目前有關(guān)二氯喹啉酸代謝途徑的研究很少，在微生物降解的研究中發(fā)現(xiàn)分枝桿菌（Mycobacteriumsp.）F4可以通過脫氯的方式或羧基甲基化產(chǎn)生甲酯化合物[9]，二氯喹啉酸甲酯（quinclorac methyl ester）是二氯喹啉酸的代謝物，結(jié)構(gòu)式如圖1（b）所示，其毒性略低于母體且會使肝臟、甲狀腺等組織產(chǎn)生病理學(xué)變化，從而導(dǎo)致動物生長發(fā)育不良，且二氯喹啉酸甲酯在植物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為二氯喹啉酸，二氯喹啉酸甲酯的半致死濃度（LD50）>2 000 mg·kg-1（鼠急性經(jīng)口）[10]。

二氯喹啉酸檢測的方法有氣相色譜法[11-12]、液相色譜法[13-15]、生物測定法[16]和超高效液相色譜-質(zhì)譜法[3,17-18]等。氣相色譜法需要更換溶劑，操作比較復(fù)雜且檢出限高；高效液相色譜法受基質(zhì)干擾較大；生物測定方法受環(huán)境影響較大；液質(zhì)聯(lián)用法有檢測時間短、靈敏度高、定性能力好等特點(diǎn)。黃思琦等[3]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定處于模擬自然條件下稻田環(huán)境中的水稻植株、土壤和水中二氯喹啉酸的殘留，采用被酸化乙腈作為提取溶劑，分散固相萃取凈化，操作簡單，靈敏度高，但并未測定代謝物二氯喹啉酸甲酯的殘留量；對于二氯喹啉酸及其代謝物的檢測方法，王一茹等[11]利用氣相色譜同時檢測二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯的殘留量，但該方法需使用甲基化試劑（重氮甲烷）將樣品轉(zhuǎn)化為甲酯后進(jìn)行檢測，該方法前處理復(fù)雜，溶劑量大，分析時間長。QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged, safe）方法的樣品平均回收率高于85%，干擾物質(zhì)少，溶劑量小，操作簡便、快速。本研究運(yùn)用改進(jìn)的QuEChERS，選用不同提取劑（乙腈、含有1%乙酸的乙腈）、不同種類的凈化劑N-丙基乙二胺（PSA），C18，C18+石墨化碳黑（GCB），PSA+GCB；結(jié)合UPLC-MS/MS分析方法同時檢測旱地土、水稻土中二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯殘留，同時研究土壤中二氯喹啉酸在室內(nèi)條件下的殘留消解。明確二氯喹啉酸在土壤中的降解情況為二氯喹啉酸的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價和二氯喹啉酸的合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 儀器、試劑與材料

UItimate 3000/TSQ Vantage型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS，美國Thermo Fisher公司）；ACQUITY UPLC型HSS T3 C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；高通量組織研磨器（CK200型，北京托摩根生物有限公司，中國），電子分析天平（BSA224S-CW，精度為0.0001 g，德國Sartorius公司）；多管渦旋儀（MS200，杭州瑞誠儀器有限公司，中國）；臺式高速離心機(jī)（TG16-11型，湖南平凡科技有限公司，中國）；0.22 μm有機(jī)濾膜（日本島津公司）。

圖1 二氯喹啉酸和二氯喹啉酸甲酯結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structural formula of quinclorac and quinclorac methyl ester

二氯喹啉酸（99.2%，沈陽化工研究院農(nóng)藥檢驗(yàn)室國家農(nóng)藥質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，中國）、二氯喹啉酸甲酯（98.0%，Dr. Ehrenstorfer公司，德國）標(biāo)準(zhǔn)品。色譜純甲醇，分析純乙腈，色譜純甲酸，分析純乙酸；實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。

1.2 土壤樣品的理化性質(zhì)

旱地土和水稻土分別取200 g，分析土壤理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 Soil physical and chemical properties

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確分別稱取二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯標(biāo)樣0.0100 g （精確到0.0001 g），用色譜純甲醇配制10 mL 1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，保存于4 ℃冰箱中。取二氯喹啉酸及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，用色譜純甲醇稀釋制得二氯喹啉酸及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為30.0、3.0、0.3和0.01 mg·L-1。

1.4 設(shè)計(jì)試驗(yàn)

參考《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗(yàn)準(zhǔn)則標(biāo)準(zhǔn)》，采用室內(nèi)培養(yǎng)法，設(shè)置不同處理。將土壤樣品放在培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度25 ℃、濕度60%，預(yù)培養(yǎng)14 d[19]。根據(jù)二氯喹啉酸的田間推薦劑量去設(shè)置2個水平的二氯喹啉酸處理和空白對照組[19]。根據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)顯示，采用了40 ghm-2，總有效成分含量為70%，按照土壤密度1.5 gcm-3，采取地表10 cm厚的土層來換算成單位質(zhì)量土壤施藥劑量[19]，推薦劑量為0.3 mg·kg-1。最終用濃度為0 mg·kg-1（CK）、0.3 mg·kg-1（T1）、3 mg·kg-1（T10）。0為空白對照。T1為二氯喹啉酸田間最大田間推薦劑量，T10是10倍的推薦劑量。每個處理設(shè)置4個平行。實(shí)驗(yàn)過程中旱地土定期補(bǔ)充滅菌水，保持所有處理的土壤最大持水量維持在60%，水稻土用水淹沒即可。采樣時間1、7、15、30、60和100 d。采樣后將樣品保存于-80 ℃冰箱中。

1.5 樣品的前處理與檢測

準(zhǔn)確稱取5.00 g（精確到0.01 g）均質(zhì)土壤試樣于50 mL塑料離心管，加入5.0 mL屈臣氏蒸餾水，加入含1%乙酸的乙腈溶液10 mL，渦旋振蕩10 min，加入5.00 g NaCl混勻，渦旋振蕩5 min，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液1.5 mL到2 mL離心管（裝有50 mg C18）中，渦旋2 min，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液過0.22 μm的有機(jī)濾膜，濾液加屈臣氏蒸餾水（V∶V=1∶1）后供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.6 色譜與質(zhì)譜條件

ACQUITY UPLC型C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.3 mL·min-1；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動相A為0.1%的甲酸水，B為甲醇；洗脫程序：0～0.5 min 20% B；0.5～1.5 min 20%～95% B；1.5～3.5 min 95% B；3.5～4.5 min 95%～20% B；4.5～5.0 min 20% B。

ESI離子源，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，毛細(xì)管電壓3.2 kV，離子源溫度350 ℃，脫溶劑溫度330 ℃，輔助氣（N2）流速3 L·min-1，鞘氣（N2）流速9 L·min-1，碰撞氣為氬氣。二氯喹啉酸及其代謝物定性、定量離子對等質(zhì)譜分析參數(shù)如表2所示。

1.7 基質(zhì)效應(yīng)

為考察基質(zhì)效應(yīng)（ME）的影響，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定法來測定土壤的基質(zhì)效應(yīng)，即分析了空白土壤基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以二者的斜率比來判定基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱[20]。

式中：Sm為基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，Ss為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率[20]。

當(dāng)ME為0時，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)的影響；當(dāng)ME為-20%～20%時表明存在弱基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME為-50%～-20%或20%～50%時表明存在中等基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME≤-50%或>50%時表明存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)[21]。

2 結(jié)果與討論（Results and discussion）

2.1 色譜、質(zhì)譜條件的確定

二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯采用ESI+源，標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣，在MRM模式下進(jìn)行分析。黃思琦等[3]和梁亞杰等[22]在研究二氯喹啉酸時都采用了ESI源，在質(zhì)量過濾器（Q1）檢測母離子；碰撞反應(yīng)室（Q2）的碰撞器施加一定電壓，母離子被擊碎產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子；質(zhì)量過濾器（Q3）只檢測特征碎片。在Q1下把二氯喹啉酸和二氯喹啉酸甲酯區(qū)分開，再經(jīng)過液相色譜柱的分離，使二氯喹啉酸和二氯喹啉酸甲酯保留時間不同。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣和保留時間選擇相對豐度最高的子離子用于定量，第二高的用于定性。二氯喹啉酸及二氯喹啉酸甲酯離子的裂解方式及相應(yīng)的子離子如圖2所示。

表2 二氯喹啉酸及二氯喹啉酸甲酯的保留時間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Retention times and MS/MS parameters of quinclorac and quinclorac methyl ester

圖2 二氯喹啉酸甲酯和二氯喹啉酸分子離子的裂解方式及相應(yīng)的子離子Fig. 2 The cleavage mode of quinclorac methyl ester and quinclorac and the corresponding product ions

二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯在C18色譜柱上保留效果好，梯度洗脫，提高樣品的分析效率并減少了強(qiáng)保留雜質(zhì)在色譜柱的積累。試驗(yàn)選擇了甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水-乙腈組成的流動相體系，研究了不同流動相對二氯喹啉酸及二氯喹啉酸甲酯洗脫效果的影響。以甲醇-0.1%甲酸水為流動相時，二氯喹啉酸及二氯喹啉酸甲酯能獲得較好的色譜峰和穩(wěn)定的信號強(qiáng)度。因此流動相采用甲醇-0.1%甲酸水溶液，在梯度洗脫條件下，溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖如圖5（b）所示。

2.2 凈化方法的選擇

2.2.1 提取劑的選擇

QuEChERS方法中，乙腈為常用的提取溶劑[23]，溶解性能好，能夠溶解多種物質(zhì)包括有機(jī)、無機(jī)以及氣體等。由于不同農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的不同，pH對提取效果影響較大，實(shí)驗(yàn)人員在乙腈中加入不同比例的試劑，如乙酸，取得了更好的回收率[24-26]。參考黃思琦等[3]采用酸化的乙腈作為提取劑，比較了乙腈、1%乙酸乙腈為提取劑時2種土壤的加標(biāo)回收率。以乙腈為提取劑時（n=6），旱地土和水稻土中二氯喹啉酸的平均回收率分別為25.15%、25.21%，低于NY788—2018標(biāo)準(zhǔn)中所允許的回收率范圍（70%～120%）[27]；以1%乙酸乙腈為提取劑時，旱地土和水稻土中的二氯喹啉酸的平均回收率分別為86.17%、80.10%（圖3）；因此選擇1%乙酸乙腈為提取劑。1%乙酸乙腈的pKa值為7.642，而二氯喹啉酸的pKa值為4.34。楊麗華[28]研究了得出了高嶺石對二氯喹啉酸的吸附量隨著pH值的增加而減少，在pH值為4時，其吸附量達(dá)到最大值，再加上二氯喹啉酸具有羧基顯酸性，根據(jù)原理，所以1%乙酸乙腈有利于二氯喹被提取。

2.2.2 凈化劑的選擇

PSA中含2個氨基，屬于氨基吸附劑，通過氫鍵能夠除去有機(jī)酸、脂肪酸和糖等物質(zhì)；C18是一種非極性、廣譜性的凈化劑，能有效去除提取液中微量的非極性雜質(zhì)；GCB吸附劑表面有極強(qiáng)的吸附性，能夠去除色素。梁亞杰等[22]在測定二氯喹啉酸及其代謝物在糙米中的殘留時選用的凈化劑中含有C18；本研究分別以PSA、C18、C18+GCB，PSA+GCB為凈化劑比較其回收率（n=6）。旱地土采用C18為凈化劑時二氯喹啉酸的平均回收率（86.17%）優(yōu)于PSA、PSA+GCB、C18+GCB為凈化劑時二氯喹啉酸的平均回收率（45.84%、40.66%、46.54%），水稻土采用C18為凈化劑時二氯喹啉酸的平均回收率（80.10%）優(yōu)于PSA、PSA+GCB、C18+GCB為凈化劑時二氯喹啉酸的平均回收率（49.81%、40.46%、54.96%），如圖4所示。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)、方法的線性范圍與定量限

采用旱地土、水稻土基質(zhì)空白溶液及溶劑配制二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯質(zhì)量濃度為1 500、750、150、75、15、7.5、1.5和0.25 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在步驟1.6優(yōu)化后的試驗(yàn)條件下測定，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（x，ng·mL-1），縱坐標(biāo)（y）為相應(yīng)的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，二氯喹啉酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表3所示。結(jié)果顯示，二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯在0.25～1 500 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，回歸分析可決系數(shù)（R2）為0.9993～1.0000。通過添加回收實(shí)驗(yàn)，以最小添加濃度作為方法的定量限（LOQ），二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯方法LOQ為0.001 mg·kg-1，結(jié)果如表3所示。

圖3 不同提取劑條件下旱地土和水稻土中二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯加標(biāo)回收率Fig. 3 Recovery rates of quinclorac and quinclorac methyl ester in dryland soil and paddy soil with different extracting solution

圖4 不同凈化劑條件下旱地土和水稻土中二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯加標(biāo)回收率注：PSA表示N-丙基乙二胺；GCB表示石墨化碳黑。Fig. 4 Recovery rates of quinclorac and quinclorac methyl ester in dryland soil and paddy soil with different purifying agentNote: PSA means N-（n-propyl） ethylendiamine; GCB means graphitized carbon black.

2.4 添加回收試驗(yàn)結(jié)果

用不含二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯的水稻土和旱地土做添加回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在0.001、0.030、0.300和3.00 mg·kg-14個添加水平下，旱地土、水稻土中二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯的回收率在78.20%～110.58%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.43%～8.98%之間，表明本方法均有較好的精密度和準(zhǔn)確度，符合農(nóng)藥殘留分析的要求（表4）。水稻土（加標(biāo)濃度0.3 mg·kg-1）的MRM圖譜如圖5（c）所示。

如圖5所示，空白水稻土中不含二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯，100 d后水稻土中還有二氯喹啉酸，并且有二氯喹啉酸甲酯生成。

表3 二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯的基質(zhì)效應(yīng)、回歸方程、可決系數(shù)（R2）和定量限（LOQ）Table 3 Matrix effects, regression equations, coefficient of determination （R2） and limit of quantification （LOQ） of quinclorac and quinclorac methyl ester

表4 旱地土、水稻土中二氯喹啉酸及其代謝物二氯喹啉酸甲酯的加標(biāo)回收率和RSD （n=6）Table 4 Spiked recoveries and RSD of quinclorac and quinclorac methyl ester in dryland soil and paddy soil （n=6）

圖5 空白水稻土基質(zhì)中二氯喹啉酸及二氯喹啉酸甲酯溶劑標(biāo)和水稻土添加條件下水稻土樣品色譜圖注：（a） 水稻土空白；（b） 0.075 mg·kg-1濃度溶劑標(biāo)；（c） 0.3 mg·kg-1添加；（d） 水稻土100 d樣品。Fig. 5 Chromatography of paddy soil matrix blank, quinclorac and quinclorac methyl ester solvent standard and matrix standard, sample with quinclorac and quinclorac methyl ester in paddy soilNote: （a） Paddy soil blank; （b） 0.075 mg·kg-1 solvent standard; （c） 0.3 mg·kg-1 addition; （d） 100 d sample of paddy soil.

2.5 室內(nèi)培養(yǎng)條件下二氯喹啉酸在2種土壤中的降解動態(tài)及二氯喹啉酸基質(zhì)的生成

經(jīng)過100 d室內(nèi)培養(yǎng)，二氯喹啉酸在2種土壤中的消解情況呈現(xiàn)出先快后慢的變化趨勢。2個水平的二氯喹啉酸在水稻土中的初始沉積量分別是0.2678 mg·kg-1和2.823 mg·kg-1，在旱地土中分別是0.2519 mg·kg-1和2.387 mg·kg-1。隨著實(shí)驗(yàn)時間的延長，二氯喹啉酸的殘留量逐漸降低。施藥100 d后2個水平的二氯喹啉酸在水稻土中的消解率T1為65.09%，T10為64.32%；旱地土T1為27.03%，T10為13.99%。施藥100 d后水稻土中二氯喹啉酸最終殘留量分別為0.0935 mg·kg-1和1.007 mg·kg-1，旱地土中二氯喹啉酸最終殘留量分別為0.1838 mg·kg-1和2.053 mg·kg-1。

二氯喹啉酸的消解動態(tài)及二氯喹啉酸甲酯的生成如圖6所示。二氯喹啉酸在土壤中的消解動態(tài)參數(shù)如表5所示。二氯喹啉酸在2種土壤中的半衰期在96～702 d之間，培養(yǎng)100 d后土壤中仍有較高濃度的二氯喹啉酸殘留，7 d以后在有氧培養(yǎng)的旱地土中就有二氯喹啉酸甲酯生成，60 d后在厭氧水稻土中才有二氯喹啉酸甲酯生成。所以，殘留的二氯喹啉酸對土壤微生物長期風(fēng)險(xiǎn)是可能存在的，會導(dǎo)致動物生長發(fā)育不良、發(fā)育異常以及生殖異常，從而影響自然界動物的多樣性和豐度[29]，二氯喹啉酸甲酯的殘留量均<0.1 mg·kg-1，低于國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的二氯喹啉酸在水稻上的最大殘留量（1 mg·kg-1），但由于其在植物體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為二氯喹啉酸[30]，所以二氯喹啉酸殘留物的問題不容忽視。

圖6 二氯喹啉酸在旱地土和水稻土中的消解及二氯喹啉酸甲酯在旱地土和水稻土中的生成Fig. 6 The dissipation of quinclorac and generation of quinclorac-methyl ester in dryland soil and paddy soil

表5 二氯喹啉酸在旱地土和水稻土中的消解動態(tài)參數(shù)Table 5 Dissipation parameters of quinclorac in dryland soil and paddy soil