納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌的毒性研究及機制初探

高藝凡，毛步云，王藝，程遠，袁青彬,*

1. 南京工業(yè)大學環(huán)境科學與工程學院，南京 211816 2. 南京水務集團有限公司，南京 210000

納米材料的大量生產(chǎn)、使用和排放使其在環(huán)境中大量存在，已經(jīng)成為不可忽視的一類環(huán)境污染物[1]。各種環(huán)境中已經(jīng)檢出了各類納米材料殘留[2-3]，其中城市污水廠是重要的儲存庫之一，據(jù)報道污水中納米材料的檢出濃度可達μg·L-1至mg·L-1[4-7]。如Tan等[8]報道污水中ZnO濃度的可達mg·L-1水平。環(huán)境中納米材料具有顯著的生態(tài)環(huán)境效應，如使機體產(chǎn)生氧化應激和炎癥反應，從而造成機體損傷甚至死亡[9-11]。對于細菌，納米材料如納米氧化物等可以觸發(fā)氧化應激反應使細菌破裂而引發(fā)凋亡[12-13]。納米材料對細菌的毒性一般既有本身納米級尺寸具有的毒性效應，也有納米材料溶解成為離子引發(fā)的毒性[14-17]。由于城市污水同樣是一類近年來普遍關注的新污染物耐藥細菌的重要儲存庫[18-21]，納米材料和耐藥細菌有廣泛共存，存在大量相互接觸和作用的機會，因此納米材料勢必也會對耐藥細菌造成影響，從而導致細菌耐藥性風險的變化，但目前對于納米材料對耐藥細菌影響的相關研究仍非常有限。

筆者課題組在前期研究中以耐藥性大腸桿菌為例初步考察了納米氧化物對耐藥革蘭氏陰性細菌的影響，發(fā)現(xiàn)納米氧化物造成了耐藥細菌的部分死亡以及耐藥水平等方面的變化[22]，為納米材料影響耐藥細菌的研究提供了參考。本研究從污水中分離出耐四環(huán)素性屎腸球菌，以此為例考察了3種污水中廣泛存在的納米氧化物納米氧化鈦（nTiO2）、納米氧化鋅（nZnO）和納米氧化銅（nCuO）[18]對革蘭氏陽性細菌的毒性。屎腸球菌是一種重要的人畜共患條件性致病菌，美國已將其列為引起臨床感染的第二大病原菌[23-24]，屎腸球菌在城市污水、醫(yī)院廢水等環(huán)境中也被廣泛檢出[25]。本文研究了不同種類、粒徑、濃度和在水中的賦存時間的3種納米氧化物對耐四環(huán)素性屎腸球菌的存活率的影響。在此基礎上初步考察了納米氧化物對耐藥性屎腸球菌的細胞膜影響，探索了影響機制。本研究將為闡明納米材料對各類耐藥細菌的影響及機制提供支撐。

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 納米材料及細菌

本實驗使用的納米氧化物為由上海盈承新材料有限公司購得的nZnO （30、50、90和200 nm）、nCuO （40 nm）和nTiO2（5～10、25、40和100 nm），3種純度達99.9%的商品納米氧化物材料。為避免可能存在的添加劑對實驗的影響，納米氧化物在使用前于水中超聲分散10 min后于去離子水中浸泡12 h過夜，離心回收后備用。使用前，將納米氧化物加入到經(jīng)0.45 μm和0.22 μm 2種尺寸濾膜過濾的二沉池出水，配制成濃度不同的納米顆粒懸浮液，并將其超聲混勻后靜置備用。另外，分別測定納米氧化物的水合粒徑和溶解的金屬離子濃度。將不同濃度和粒徑的納米氧化物配制成為懸浮液，使用納米粒度電位儀（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK）對nZnO的水合粒徑進行檢測。將樣品離心，棄去上清液后用稀硝酸消解后，使用ICP-OES（Avio 550, Perkinelmer, USA）測定溶解的離子濃度。

耐四環(huán)素屎腸球菌分離自于南京市某城鎮(zhèn)污水廠活性污泥，將采集的新鮮活性污泥梯度稀釋后涂板至含有四環(huán)素（36 mg·L-1）的糞腸球菌瓊脂選擇性培養(yǎng)基（HB0268-2，海博生物，中國），根據(jù)菌落特征初步篩選若干糞腸球菌菌落，純化培養(yǎng)后送至南京金思瑞生物科技公司測序鑒定細菌種類為屎腸球菌Enterococcusfaecium7039809-1（MH385356.1）。而后通過使用PCR檢測確認此菌種帶有四環(huán)素類抗性基因tetM和tetL。

1.2 納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的毒性測定

在避光條件下，將活化后的耐四環(huán)素屎腸球菌離心后重懸至經(jīng)0.45 μm和0.22 μm 2種尺寸濾膜過濾的二沉池出水（經(jīng)平板計數(shù)確認細菌被完全去除），加入一定量的納米氧化物懸浮液后在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩反應30 min。取1 mL反應后的細菌懸濁液梯度加入含有四環(huán)素（36 mg·L-1）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿加入細菌量為10 mL左右，待冷卻凝固后放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)96 h，記錄各培養(yǎng)基中菌落數(shù)（N1），同時將沒有加入納米氧化物的細菌溶液同樣參照上述步驟培養(yǎng)，記錄培養(yǎng)基中菌落數(shù)（N0），計算耐四環(huán)素屎腸球菌的存活率（式（1））。

存活率=N1/N0×100%

（1）

為考察納米氧化物種類以及粒徑對毒性的影響，分別考察nZnO、nCuO和nTiO23種納米氧化物在10 mg·L-1和100 mg·L-1和不同粒徑下的耐四環(huán)素屎腸球菌的存活率；為考察納米氧化物濃度對毒性的影響，以nZnO和nTiO2為例考察0、10、20、50和100 mg·L-1的2種納米氧化物反應后耐四環(huán)素屎腸球菌的存活率；為考察納米氧化物賦存形態(tài)對毒性的影響，將納米氧化物懸浮液靜置0、3和6 h后進行毒性測定，考察耐四環(huán)素屎腸球菌存活率。

1.3 納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌細胞膜的影響

使用乳酸脫氫酶釋放法考察納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌細胞膜的影響。其原理是細胞凋亡或壞死而造成的細胞膜結構的破壞會導致細胞漿內的酶釋放到培養(yǎng)液里，其中包括酶活性較為穩(wěn)定的乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）。通過檢測從質膜破裂的細胞中釋放到培養(yǎng)液中的LDH的活性，就可以實現(xiàn)對細胞毒性的定量分析[26]。采用試劑盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST，東仁化學科技（上海）有限公司，中國）進行測定，將接觸納米氧化物的耐四環(huán)素屎腸球菌離心后置于96孔板中作為實驗組，按照說明書提示的溶液量加入對應的樣品制成對照組和背景組，依次加入反應試劑充分反應后立即用酶標儀測定各孔在490 nm的吸光度。而后通過計算得出本實驗中的LDH活性計算式（式（2）），并采用計算出的LDH活性單位為標準，表示細胞的氧化應激作用。

LDH活性單位計算式：

LDH（U·mL-1）=ΔA÷0.725÷T×103=92×ΔA

（2）

式中：ΔA為測定吸光度與對照吸光度之差，T為每微摩爾標準品稀釋所用溶液的體積（L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用P=0.05水平考察不同處理之間的顯著性差異，當P<0.05時認為數(shù)據(jù)之間存在顯著不同。采用Pearson相關性分析考察2組數(shù)據(jù)間的相關性。上述數(shù)據(jù)處理過程均在Origin 9.0軟件中進行。

2 結果（Results）

2.1 納米氧化物種類對耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的影響

首先考察了3種常見的納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌存活率的影響（圖1）?？梢园l(fā)現(xiàn)，在暴露濃度為10 mg·L-1和100 mg·L-1時3種納米氧化物的毒性順序一致，即nCuO>nZnO>nTiO2（P<0.05）。在3種納米氧化物中nCuO的毒性最強，10 mg·L-1即造成37.03%的細菌死亡。相比之下，nTiO2毒性相對較低，在100 mg·L-1時的致死率僅為nZnO的63.72%。

2.2 濃度和粒徑對納米氧化物對于耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的影響

以nTiO2和nZnO為例考察了濃度和粒徑對納米氧化物對于耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的影響（圖2）。

圖1 不同種類納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌存活率的影響注：（a） 納米氧化物的濃度為10 mg·L-1；（b） 納米氧化物的濃度為100 mg·L-1。Fig. 1 The effect of different kinds of nano metal oxides on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） Nano-oxides at the concentration of 10 mg·L-1; （b） Nano-oxides at the concentration of 100 mg·L-1.

圖2 不同納米氧化物濃度和粒徑對耐四環(huán)素屎腸球菌存活率的影響注：（a）不同濃度的nTiO2；（b）不同濃度的nZnO；（c）不同粒徑的nTiO2；（d）不同粒徑的nZnO。Fig. 2 The influence of different nano metal oxide concentration and size on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） Different concentrations of nTiO2; （b） Different concentrations of nZnO; （c） Different size of nTiO2; （d） Different size of nZnO.

由（圖2（a））可知，10 mg·L-1相同粒徑和形態(tài)的nTiO2脅迫下，細菌存活率約為73.38%；當濃度從10 mg·L-1提高時，存活率呈降低趨勢，至50 mg·L-1時存活率僅為58.67%，表明毒性隨濃度提高而增強，但當濃度由50 mg·L-1提升至100 mg·L-1時，存活率并未出現(xiàn)繼續(xù)下降，反而有所升高，此時存活率為70.60%。nZnO的毒性隨濃度變化的趨勢與nTiO2類似，即存活率先降低到50 mg·L-1時的最低值（36.00%），繼而升高至48.85%。

從粒徑對納米氧化物的毒性影響來看，粒徑變大時，存活率呈降低趨勢，表明毒性不斷加大，如粒徑90 nm的ZnO較粒徑30 nm使耐四環(huán)素屎腸球菌的存活率降低了32%，粒徑40 nm的nTiO2的較粒徑5～10 nm的nTiO2作用下，耐藥細菌的存活率降低了16%。然而納米氧化物的毒性并不隨粒徑的增大持續(xù)增大，當nZnO的粒徑由90 nm提高到200 nm時毒性發(fā)生明顯降低，細菌存活率提高了19%；nTiO2在100 nm時的毒性比40 nm上升了9%。

2.3 賦存時間對納米氧化物對于耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的影響

實驗設置的3個賦存時間0、3和6 h，可認為反映了納米材料排放至水中的不同狀態(tài)，如賦存0 h為納米氧化物剛進入污水中，賦存3 h為含納米氧化物的污水經(jīng)排水管網(wǎng)進入污水廠的途中，賦存6 h為在污水處理廠處理的階段。以nTiO2和nZnO為例，考察上述3種賦存時間對納米氧化物毒性的影響（圖3）。nZnO懸浮液賦存時間為0 h時細菌細胞存活率為48.85%，歷經(jīng)6 h后細菌存活率下降了22.15%。同樣地，100 mg·L-1nTiO2懸浮液賦存時間為0 h時細菌細胞存活率為70.60%，歷經(jīng)6 h后細菌細胞存活率下降了8.34%，即隨著賦存時間的延長，細菌的存活率呈降低趨勢（P<0.05），表明納米氧化物的毒性不斷增大。

2.4 耐藥細菌的通透性受納米氧化物的影響規(guī)律

通過測定LDH活性值來反映細胞通透性，從而考察不同種類、粒徑、濃度和賦存時間對納米氧化物毒性的影響機制（圖4）。從種類的影響來看，對細胞通透性影響的大小順序為nZnO、nCuO和nTiO2，該順序與前述納米氧化物的毒性順序存在差異，主要是nZnO取代nCuO成為使通透性提高最多的種類。從濃度的影響看，通透性隨著濃度的提高不斷提高，如nCuO濃度從10 mg·L-1依次增加到100 mg·L-1時，LDH的值提高了1.809 U·mL-1，當nAl2O3濃度從10 mg·L-1依次增加到100 mg·L-1時，LDH的值提高了0.708 U·mL-1。從粒徑的影響看，通透性隨著納米氧化物粒徑的提高而不斷提高。如nTiO2粒徑從5 nm依次增加到100 nm，LDH提高了0.269 U·mL-1。當nZnO粒徑從30 nm增加到200 nm時，LDH提高了0.892 U·mL-1。從賦存時間的影響看，賦存時間的延長使通透性不斷提高。如nCuO（10 mg·L-1）懸浮液賦存時間從0 h到6 h，LDH提高了0.613 U·mL-1，而在100 mg·L-1的條件下提高了0.474 U·mL-1。進一步分析了細胞的存活率和通透性之間相關性（表1），發(fā)現(xiàn)在濃度和賦存時間影響因素的實驗中兩者顯著相關（P<0.05），且相關性較強；而粒徑和種類的影響因素試驗下兩者雖然同樣顯著相關（P<0.05），但相關性較弱。

圖3 不同賦存時間對耐四環(huán)素屎腸球菌存活率的影響注：（a） 100 mg·L-1 nTiO2，（b） 100 mg·L-1 nZnO。Fig. 3 Effects of different persistent period on the survival rate of tetracycline resistant Enterococcus faeciumNote: （a） 100 mg·L-1 nTiO2, （b） 100 mg·L-1 nZnO.

表1 細胞的存活率和LDH的產(chǎn)量之間相關性分析Table 1 Correlation analysis between cell survival rate and LDH production

圖4 不同種類、濃度、粒徑的納米氧化物及不同賦存時間下與耐四環(huán)素屎腸球菌反應后的LDH值 注：（a）不同種類，（b）不同濃度，（c）不同粒徑，（d）不同賦存時間；LDH為測定出的乳糖脫氫酶活性值，虛線表示未經(jīng)納米氧化物處理的耐四環(huán)素屎腸球菌的LDH值。Fig. 4 The LDH value of tetracycline resistant Enterococcus faecium after reacting with nano metal oxides of different types, concentrations, sizes and different storage timesNote: （a） Different kinds, （b） Different concentrations, （c） Different size, （d） Different storage time; LDH indicates the measured lactate dehydrogenase activity value, and the dotted line represents the LDH value of tetracycline-resistant Enterococcus faecium without nano metal oxide treatment.

3 討論（Discussion）

在nZnO、nCuO和nTiO23種納米材料中，nCuO的毒性最強，可能是因為nCuO溶解出的Cu2+具有較強的毒性，能夠進入細胞導致細胞死亡[27]。在一項針對nZnO、nCuO和nTiO2對酵母菌的毒性研究中，同樣發(fā)現(xiàn)nCuO毒性最強[28]。相近地，nZnO對耐四環(huán)素屎腸球菌也表現(xiàn)出較強毒性，在10 mg·L-1暴露時致死率達30.56%，可能是由于nZnO溶解產(chǎn)生的Zn2+具有細胞毒性導致，在本研究中nZnO在加入濃度為10 mg·L-1時溶解的Zn2+濃度達1.03 mg·L-1。Zn2+被報道可以破壞細胞膜使細胞內容物流出，同時抑制細胞壁的合成，抑制細胞的繁殖和生長，進而使細胞死亡[29]。相比之下，nTiO2的毒性相對較低可能是因為nTiO2溶解性較低，溶出的離子濃度較低。而且相應的離子的毒性低于Cu2+和Zn2+，所以表現(xiàn)出較低的毒性。如徐爭啟等[30]在研究中報道Ti的毒性系數(shù)遠小于Cu。此外，nTiO2較弱的毒性可能與其帶電性有關。據(jù)報道nTiO2表面的電荷值接近中性，不易與表面帶負電的耐藥細菌結合，因此毒性較低[31]。

在探究濃度對納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，納米氧化物濃度較低時，毒性隨納米氧化物濃度的升高而加強（P<0.05），這可能除離子溶解外，納米氧化物本身的毒性也是導致細菌死亡的因素。加入的納米氧化物濃度升高后與細菌的接觸概率提高，以及析出的離子濃度提高。然而，濃度進一步提高后盡管析出的離子濃度可能有進一步提高（如nZnO在濃度為10 mg·L-1時Zn2+析出濃度為1.03 mg·L-1，在濃度為100 mg·L-1時Zn2+析出濃度為12.16 mg·L-1），但是過高濃度的納米氧化物容易發(fā)生團聚，形成的實際粒徑遠大于低濃度時（如ZnO在濃度為10 mg·L-1時水合粒徑為401.80 nm，在濃度為100 mg·L-1時水合粒徑為917.38 nm），因此導致納米氧化物的接觸毒性變弱，使納米氧化物的總體毒性下降。這表明納米氧化物的粒徑對毒性的影響可能是粒子的接觸和溶出為金屬離子共同作用的結果。

關于粒徑對納米顆粒毒性的影響研究盡管已開展較多，但是沒有定論。很多研究認為粒徑越小，納米顆粒的毒性越大[32]，主要是由于粒徑越小分散性越好，容易與微生物接觸。此外，粒徑越小可能有利于金屬離子的溶解，因而毒性增大[33-34]。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)納米顆粒粒徑越大，毒性越大，主要是由于粒徑越小在水中越容易團聚，導致毒性降低[35]。本研究發(fā)現(xiàn)納米氧化物毒性隨粒徑增大先增大后減小的趨勢，可能再次驗證了納米顆粒的接觸和溶解金屬離子同時起作用，即在較小粒徑范圍時，容易溶解產(chǎn)生離子，但是納米顆粒易團聚（如粒徑為30 nm的nZnO水合粒徑為401.80 nm，團聚倍數(shù)為13.39），綜合表現(xiàn)為粒徑越小毒性越小，當粒徑范圍提高后，納米顆粒團聚趨勢減弱（如粒徑為200 nm的nZnO水合粒徑為857.49 nm，團聚倍數(shù)為4.29），因此毒性增加[36-37]。而粒徑進一步增加后，離子溶解減少，納米顆粒的接觸毒性也降低，因此毒性降低。

對于賦存時間對毒性的影響研究發(fā)現(xiàn)隨著賦存時間的延長，細菌的存活率降低，這可能是因為賦存時間的延長使納米氧化物溶出的金屬離子濃度提高（如濃度為10 mg·L-1的nZnO在0 h的溶解金屬離子總濃度為1.03 mg·L-1，在6 h的總濃度為1.62 mg·L-1），因此毒性增強。相近的結果在前人的研究中也被報道，如Ma等[38]研究了納米氧化鋅對大腸桿菌的暴露時間和抗菌率的關系，發(fā)現(xiàn)暴露時間越長，納米氧化鋅的抗菌效率越高，因為暴露時間越長溶出的金屬離子的濃度在不斷提高。

細胞通透性的提高與納米氧化物的毒性之間的變化趨勢盡管存在相似之處，但也有不少情況下偏差較大。這可能是因為同一種納米氧化物經(jīng)不同的處理后，其毒性與細胞通透性間存在較好的相關性，說明納米氧化物作用于細胞先破壞細胞膜使其通透性增大，然后金屬離子或納米氧化物顆粒進入細胞體內使其死亡；而不同種類或粒徑的納米氧化物之間差距較大，造成的通透性變化差異較大。

本研究表明，納米氧化物在污水處理過程中對耐四環(huán)素屎腸球菌表現(xiàn)出較明顯的毒性，且毒性受納米氧化物種類、粒徑、濃度和在水中的賦存時間等影響。3種納米氧化物的毒性大小為nCuO>nZnO>nTiO2；納米氧化物毒性隨濃度和粒徑的提高均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；賦存時間越長，納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌的毒性越強。從影響機理看，納米氧化物及其溶解產(chǎn)生的金屬離子共同作用，破壞細胞膜，提升了細胞膜的通透性，納米氧化物和金屬離子進入細胞進一步破壞胞內物質，導致細胞死亡。然而，納米氧化物對耐四環(huán)素屎腸球菌的毒性并不必然意味著抗生素抗性風險的降低，抗性基因可能在胞外仍保留活性。盡管納米氧化物與耐藥細菌存在廣泛的接觸和相互作用的機會，納米氧化物對耐藥細菌的影響在以往的研究中尚未被充分揭示，在未來的研究中需要繼續(xù)關注。本研究可為闡明納米材料對耐藥細菌的影響作用和機制提供理論和實驗支撐。