間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在口腔領(lǐng)域應(yīng)用的研究進(jìn)展*

劉紫微 時(shí) 權(quán) 王思拓 徐娟

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新能力、多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)特性的成體干細(xì)胞群。目前已從多種組織發(fā)現(xiàn)并分離出干細(xì)胞，如骨髓、脂肪、臍帶以及口腔組織等[1]。不同組織來源的干細(xì)胞具有不同的生物學(xué)特性。牙源性干細(xì)胞是一類從口腔組織分離出的干細(xì)胞群體，主要包括牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)、牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)、根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from apical papilla，SCAPs)、脫落乳牙干細(xì)胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs)、牙齦干細(xì)胞(gingival mesenchymal stem cells，GMSCs)以及牙槽骨骨髓干細(xì)胞(alveolar bone marrow mesenchymal stem cells，ABMSCs)等[2]。目前以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)在組織修復(fù)再生和疾病診斷及治療中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。以往研究表明，干細(xì)胞通過定植分化為相應(yīng)細(xì)胞在組織中發(fā)揮修復(fù)作用，但近期研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞發(fā)揮其組織修復(fù)功能與其旁分泌效應(yīng)相關(guān)[3]。此外，干細(xì)胞治療也存在免疫排斥、突變致瘤、倫理限制等諸多問題[4]。因此，作為干細(xì)胞旁分泌的主要物質(zhì)，外泌體成為研究的熱點(diǎn)。

外泌體是直徑為30～150nm 的膜性囊泡，由磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)及其內(nèi)容物(DNA、miRNA、mRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)組成，于20 世紀(jì)80 年代在網(wǎng)織紅細(xì)胞中被首次發(fā)現(xiàn)并被命名為“exosome”。外泌體起源于由胞內(nèi)體內(nèi)陷形成的多囊體，當(dāng)多囊體與細(xì)胞膜融合后即被釋放到細(xì)胞外，成為外泌體。此外，外泌體可由多種類型細(xì)胞(如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等)在生理或病理狀態(tài)下分泌產(chǎn)生并廣泛存在于血液、尿液、唾液、母乳、腦脊液等體液中[5]。外泌體可以通過配體/ 受體結(jié)合、膜融合以及胞吞等方式將其攜帶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用，從而影響機(jī)體的生理病理過程，具有潛在的疾病診斷和治療價(jià)值[6]。

干細(xì)胞具有促進(jìn)組織修復(fù)與再生、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功能，被認(rèn)為是外泌體分泌能力最強(qiáng)的細(xì)胞類型之一。干細(xì)胞來源外泌體(mesenchymal stem cells derived exosomes；MSCs-Exo)除具有與MSCs相似的生物學(xué)功能外，還具有低免疫原性等特性，能有效規(guī)避直接應(yīng)用干細(xì)胞治療的缺點(diǎn)，真正實(shí)現(xiàn)“無細(xì)胞治療”。目前，MSCs-Exo 由于其良好的促組織再生、免疫調(diào)節(jié)以及靶向藥物遞送功能，在口腔領(lǐng)域展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。因此，本文將就MSCs-Exo 的生物學(xué)功能及其在口腔領(lǐng)域應(yīng)用的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1.MSCs-Exo 的生物學(xué)功能

1.1 促組織再生功能 MSCs 在組織再生過程中具有積極的促進(jìn)作用，作為MSCs 的主要旁分泌物質(zhì)，MSCs-Exo 具有與其母體細(xì)胞相似的生物學(xué)功能，能夠增強(qiáng)受損組織的修復(fù)再生能力[7]。MSCs-Exo 已被證實(shí)可以促進(jìn)多種組織的修復(fù)再生，如骨與軟骨組織[8]、皮膚組織[9]、神經(jīng)組織[10]等。

MSCs-Exo 在組織中發(fā)揮相應(yīng)的功能可能與其攜帶的內(nèi)容物相關(guān)。截止2019 年1 月，已從外泌體中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道349988 種蛋白質(zhì)、27646 種mRNA 和10520 種miRNAs[11]。MSCs-Exo 通過將其攜帶的內(nèi)容物傳遞至相應(yīng)的靶細(xì)胞，從而觸發(fā)一系列的生物學(xué)反應(yīng)并改變靶細(xì)胞的表型及功能，從而發(fā)揮組織修復(fù)作用。研究表明，MSCs-Exo 可以通過傳遞miRNAs 和IL-10、TGF-β 等蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)炎性因子的分泌與表達(dá)，并能夠增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑能力，促進(jìn)組織的修復(fù)再生[12]。同時(shí)，MSCs-Exo 對(duì)相關(guān)靶細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用也是其促組織再生的重要機(jī)制之一。大量體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo 能夠刺激相應(yīng)靶細(xì)胞的增殖和趨化，增強(qiáng)靶細(xì)胞的生物學(xué)活性，從而增強(qiáng)組織的再生能力[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，GMSCs-Exo 能夠通過影響皮膚成纖維細(xì)胞的增殖和活性而促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面的修復(fù)[9]。此外，由于血管化是組織修復(fù)重建的重要環(huán)節(jié)，因此促進(jìn)受損組織的血管形成至關(guān)重要。MSCs-Exo 能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和活性以及新生血管的生成，從而為受損區(qū)域提供更多的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，加快受損組織的修復(fù)與再生[8]。

1.2 免疫調(diào)節(jié)功能 機(jī)體的免疫反應(yīng)是一項(xiàng)復(fù)雜的過程，其間不僅有炎性因子的釋放，還包括免疫細(xì)胞的參與。MSCs-Exo 在抗炎過程中能夠減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)并能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生物學(xué)活性，具有良好的免疫調(diào)節(jié)能力。MSCs-Exo 的免疫調(diào)節(jié)功能與其攜帶的免疫調(diào)節(jié)因子密切相關(guān)。MSCs-Exo 通過向炎癥區(qū)域釋放抗炎相關(guān)因子，發(fā)揮抗炎功效。此外，MSC-Exo 還可以影響多種免疫細(xì)胞的功能，調(diào)節(jié)炎癥過程。

MSCs-Exo 能夠抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)釋放促炎因子，并能夠通過影響MSCs 與PBMC 的相互作用而調(diào)節(jié)PBMC 的活性[14]。此外，MSCs-Exo 還可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及自然殺傷細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能。MSCs-Exo 能夠誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞分化為Th2 細(xì)胞，抑制Th1 細(xì)胞分化為Th17 細(xì)胞，促進(jìn)Treg 細(xì)胞的增殖從而達(dá)到抑制自身免疫的目的。此外，MSCs-Exo 還具有抑制巨噬細(xì)胞活化的能力，并且能夠刺激導(dǎo)促炎表型M1 向抗炎表型M2 的極化[15]。

1.3 靶向藥物遞送功能 作為一種新興的藥物遞送載體，外泌體不僅具有無毒性、低免疫原性等生物學(xué)特性，還能夠裝載生物活性物質(zhì)以及化學(xué)藥物(如核酸、蛋白質(zhì)、生物信號(hào)分子、天然及合成藥物等)，在發(fā)揮自身功能的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了裝載物的效能。Ma T等[16]通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-132 裝載到骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)來源外泌體，發(fā)現(xiàn)裝載miR-132 的BMSCs-Exo 能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的體外成管能力并促進(jìn)了小鼠心臟缺血區(qū)域的血管形成。Li H等[17]發(fā)現(xiàn)突變型HIF-1(缺氧誘導(dǎo)因子1)修飾的BMSCs-Exo 可通過增強(qiáng)機(jī)體的成骨和血管生成能力而改善早期類固醇激素引起的股骨頭缺血性壞死癥狀。此外，Pascucci L等[18]發(fā)現(xiàn)裝載紫杉醇的MSCs-Exo 能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的體外增殖。以上可見，MSCs-Exo 自身既可作為“藥物”使用，還能夠充分發(fā)揮其裝載物的生物學(xué)功能，具有較好的應(yīng)用前景。

2.MSCs-Exo 在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 顱頜面骨缺損再生 MSCs-Exo 在骨缺損與再生過程中具有良好的作用，已有多種MSCs-Exo 被報(bào)道能有效的促進(jìn)顱頜面骨缺損的修復(fù)。Wu J等[19]將SHEDs-Exo 與β-磷酸三鈣(β-TCP)支架結(jié)合后植入到大鼠牙槽骨缺損部位，發(fā)現(xiàn)與β-TCP 組和空白對(duì)照組相比，SHEDs-Exo/ β-TCP 組表現(xiàn)出了更好的新骨及新生血管形成能力。Yang S等[20]在大鼠顱中縫處制備直徑8mm 的顱骨缺損模型并將負(fù)載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)來源外泌體的水凝膠材料注射到顱骨缺損部位，8 周后發(fā)現(xiàn)含有hUCMSCs-Exo 的水凝膠材料組的骨修復(fù)效果最好。此外，Swanson等[21]發(fā)現(xiàn)DPSCs-Exo 與BMSCs-Exo 的體外促成骨能力相似，將DPSCs-Exo 負(fù)載于PLGA-PEG 共聚物微球材料能有效的促進(jìn)大鼠顱骨缺損修復(fù)。

2.2 顳下頜關(guān)節(jié)炎的治療 顳下頜關(guān)節(jié)炎(Temporomandibular joint osteoarthritis;TMJOA)是一種退行性疾病，通常包括顳下頜關(guān)節(jié)的軟硬組織病變，以進(jìn)行性軟骨破壞、髁突重塑和滑膜炎為主要特征，患有TMJOA 的患者通常伴有關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙，并伴有生活質(zhì)量的下降[22]。由于髁突軟骨的自愈能力有限，傳統(tǒng)治療對(duì)修復(fù)受損的軟骨和周圍組織的作用有限。MSCs-Exo 作為“無細(xì)胞治療”，能早期抑制關(guān)節(jié)疼痛和退行退變，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)基因表達(dá)，改善髁突及軟骨下骨結(jié)構(gòu)，促進(jìn)關(guān)節(jié)的修復(fù)和再生[23]。Luo P等[24]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-100-5p 的SHEDs-Exo 可通過抑制促炎因子(IL-6、IL-8)和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP1、3、9、13)的表達(dá)，從而減輕TMJOA 的炎癥反應(yīng)。Zhang S等[25]通過建立大鼠軟骨缺損模型并將MSCs-Exo 注射到關(guān)節(jié)腔內(nèi)，觀察到軟骨和軟骨下骨幾乎完全恢復(fù)，其特征包括表面具有規(guī)則的透明軟骨，與相鄰軟骨完全結(jié)合以及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。目前關(guān)于外泌體修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的機(jī)制尚不明確，部分研究表明外泌體介導(dǎo)的軟骨修復(fù)過程與AKT，ERK 和AMPK 信號(hào)通路的腺苷活化有關(guān)[23]。

2.3 口腔癌的治療 MSCs-Exo 能有效抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌的血管生成和腫瘤生長(zhǎng)。李文文等[26]發(fā)現(xiàn)口腔白斑組織來源的MSCs 分泌的外泌體能夠促進(jìn)口腔癌前病變細(xì)胞的增殖和遷移能力，此為白斑癌變的早期診斷和治療提供思路和方向。Rosenberger L等[27]將倉(cāng)鼠頰囊癌作為人口腔鱗癌的臨床前模型并向瘤內(nèi)注射MSCs-Exo，結(jié)果表明瘤內(nèi)注射外泌體具有顯著的抗腫瘤作用，這與MSCs-Exo 抑制VEGF 的分泌和血管生成有關(guān)。在腫瘤微環(huán)境中，MSCs-Exo 通過將其運(yùn)載物轉(zhuǎn)移至癌細(xì)胞，能有效抑制腫瘤的進(jìn)展[28]。此外，miRNAs 可以調(diào)控口腔癌的發(fā)展。Xie C等[29]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-101-3p 的BMSCs-Exo 通過調(diào)節(jié)COL10A1 可以抑制口腔癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)將過表達(dá)miR-101-3p的BMSCs-Exo 注射到裸鼠皮下可以有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)[30]。

2.4 牙髓組織再生 MSCs-Exo 可以通過增加特異性蛋白的表達(dá)、促進(jìn)血管形成、增強(qiáng)牙髓細(xì)胞的活力等方式促進(jìn)牙髓組織再生。Huang等[30]研究發(fā)現(xiàn)，DPSCs-Exo 可以通過激活P38 MAPK 通路而促進(jìn)DPSCs 的牙源性分化，DPSCs-Exo 誘導(dǎo)后的DPSCs 牙源性分化標(biāo)記基因及蛋白DMP1 和DPP 表達(dá)增高。同時(shí)，該研究將負(fù)載DPSCs-Exo的膠原膜材料嵌入牙根切片的根管間隙后植入到裸鼠背部皮下可以觀察到新生的牙髓樣組織。該研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)牙源性條件下提取的外泌體的促牙源性分化能力更強(qiáng)。此外，DPSCs-Exo 還可以與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(纖維連接蛋白和I 型膠原)結(jié)合，具有一定的臨床轉(zhuǎn)化能力[30]。

2.5 牙周組織再生 作為干細(xì)胞旁分泌的主要成分，MSCs-Exo 的出現(xiàn)為牙周組織再生提供了新的思路。Lei F等[31]通過建立大鼠牙周炎模型并使用負(fù)載PDLSCs-Exo 的基質(zhì)膠或β-TCP 材料修復(fù)牙周炎區(qū)域的骨缺損，與單純材料組相比，負(fù)載PDLSCs-Exo 的材料組的新生血管及新骨形成量更多。此外，PDLSCs-Exo 還可以通過抑制經(jīng)典Wnt 通路的激活，促進(jìn)炎癥環(huán)境下提取的PDLSCs的成骨分化能力[31]。Chew JRJ等[32]研究發(fā)現(xiàn)，MSCs-Exo 可以通過激活CD73 介導(dǎo)的AKT 和ERK 信號(hào)通路而促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖和遷移。該研究將負(fù)載MSCs-Exo 的膠原蛋白海綿填塞到大鼠牙周缺損部位并表現(xiàn)出了較強(qiáng)的促牙周再生能力[34]。MSCs-Exo 不僅可以作為“藥物”直接用于牙周炎的治療，還可以作為部分保守牙周治療的輔助手段而提高牙周炎的治療效果。有研究發(fā)現(xiàn)，向齦下刮治及根面平整處理后的大鼠牙周炎患牙的牙周袋內(nèi)注射脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells;ADSCs)來源外泌體可以提高牙周炎的療效[33]。

2.6 其他 MSCs-Exo 能夠加速骨骼重塑，促進(jìn)血管生成以及牙齦傷口的愈合，可以用來預(yù)防和治療藥物相關(guān)的頜骨壞死[34]。MSCs-Exo 還可以促進(jìn)味蕾的再生和神經(jīng)的支配，并有望在舌癌患者的術(shù)后舌重建中得以應(yīng)用。Zhang Y等[35]研究發(fā)現(xiàn)，GMSCs-Exo 可以促進(jìn)大鼠舌粘膜BDNF，Shh表達(dá)的升高，促進(jìn)舌體損傷后味蕾及相關(guān)神經(jīng)的再生，在舌體組織缺損修復(fù)中具有良好的應(yīng)用前景。

3.MSCs-Exo 的展望與挑戰(zhàn)

鑒于MSCs-Exo 在促組織再生、免疫調(diào)節(jié)以及靶向藥物遞送中的良好功能，其在口腔疾病治療中的應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。MSCs-Exo 不僅可以促進(jìn)顱頜面骨缺損、牙髓組織以及牙周組織的修復(fù)再生，還可以用于口腔腫瘤、頜骨相關(guān)疾病、TMJOA 等疾病的治療。

盡管MSCs-Exo 在口腔組織再生及相關(guān)疾病的診斷和治療等方面展現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景，但其在口腔疾病治療中的研究相對(duì)較少且具體機(jī)制尚不明確。同時(shí)，相比于牙源性干細(xì)胞來源外泌體，非牙源性干細(xì)胞來源外泌體在口腔領(lǐng)域的研究更少，且目前缺乏不同類型干細(xì)胞來源外泌體對(duì)于口腔疾病治療的效果對(duì)比。此外，外泌體在具體應(yīng)用中存在許多亟待解決的實(shí)際問題。如何提取高純度高產(chǎn)量的外泌體是目前面臨的難題，現(xiàn)存的提取方法都難以最大限度的同時(shí)提高外泌體的濃度和產(chǎn)量。另外，如何提高外泌體作用的靶向性及療效也是具體應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)。目前MSCs-Exo 在口腔領(lǐng)域的研究還處于基礎(chǔ)階段，要真正實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化還需要我們更多的發(fā)現(xiàn)和探索。