黃煬，馬洪，李超，周可

550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔頜面外科(黃煬、馬洪、周可)；610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 頭頸腫瘤外科(李超)

頭頸癌是全球第六大最常見的惡性腫瘤，每年約有63萬例新確診病例，超過35萬人死亡，患者5年生存率約為50%[1-2]。頭頸癌中最常見的癌癥類型為頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)，其起源于口腔、鼻腔及咽喉等部位。其中包括口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC) 及喉癌(laryngeal cancer，LC)等[3]。癌癥干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是腫瘤內(nèi)具有干細(xì)胞特性的獨(dú)特群體，存在于多種癌癥中，在HNSCC中已發(fā)現(xiàn)該干細(xì)胞亞群,其具有較高的自我更新能力、分化能力、致瘤能力和放化療抗性[4-5]。頭頸鱗癌干細(xì)胞亞群僅是小部分頭頸鱗癌細(xì)胞，但它們在腫瘤向人體其他器官的轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞特異莫洛尼鼠白血病病毒整合位點1(B cell-specific moloney murine leukemia virus insertion site 1，BMI1) 的表達(dá)與這些表型相關(guān)，在原發(fā)腫瘤中BMI1陽性表達(dá)的CSCs自我更新和分化能力增強(qiáng)，并可介導(dǎo)頭頸鱗癌 CSCs的侵襲性生長和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5]。目前，HNSCC主要應(yīng)用多學(xué)科綜合序列治療，包含手術(shù)切除、化療和放療的聯(lián)合治療方法。由于CSCs耐藥性及輻射耐受的特性，伴隨而來的是疾病的不良預(yù)后。明確BMI1作為腫瘤干細(xì)胞生物標(biāo)志物并使之成為治療靶點，對于優(yōu)化HNSCC的治療策略具有重要意義。本文將對近年來有關(guān)BMI1作為生物標(biāo)志物對頭頸鱗癌CSCs的影響的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行復(fù)習(xí)，并基于國內(nèi)外最新共識對此作一綜述。

1 BMI1的結(jié)構(gòu)與功能

PcG蛋白-多梳家族蛋白是一類在染色質(zhì)水平抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的蛋白，包含了多梳抑制復(fù)合體(polycomb repressive complex,PRC)1和PRC2兩個核心蛋白復(fù)合體，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞記憶、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和腫瘤形成等過程中起關(guān)鍵作用[6]。作為PRC1中的核心成分，BMI1是一種表觀遺傳調(diào)控因子，可通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默和組蛋白H2AK119Ub的沉積，促進(jìn)DNA末端切除，從而影響DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)進(jìn)程[7]。BMI1還可通過組蛋白的甲基化修飾過程來控制組織干細(xì)胞的細(xì)胞周期和自我更新[8]。人類BMI1基因位于10號染色體短臂1區(qū)3帶(10p13)，長約10 kb，由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成。該基因編碼3.4 kb的cDNA以及36 KDa的蛋白質(zhì)，由326個氨基酸組成[8-9]。BMI1蛋白由三個重要區(qū)域構(gòu)成,包括：1)中心部分的螺旋—轉(zhuǎn)角—螺旋—轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)域，此為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是影響B(tài)MI1轉(zhuǎn)錄活性的重要核心區(qū)域；2)氨基末端保守的指環(huán)區(qū)域，可促進(jìn)DNA同源重組修復(fù),與細(xì)胞增殖和抑制蛋白表達(dá)有關(guān)；3)羧基端的PEST樣區(qū)域，富含脯氨酸及絲氨酸殘基，與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)BMI1快速降解相關(guān)[7,10-11]。以上特征決定了BMI1作為腫瘤干細(xì)胞潛在生物標(biāo)志物發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。

2 頭頸鱗癌干細(xì)胞與BMI1

BMI1作為一種關(guān)鍵的頭頸部腫瘤干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，通過H3-K27蛋白的三甲基化和H2A-K119蛋白的泛素化，與c-Myc蛋白協(xié)同抑制Ink4a/Arf位點，負(fù)調(diào)控下游效應(yīng)分子p16INK4a、p19Arf和p53等，控制細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[6-7,12]。大量的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子也參與調(diào)節(jié)BMI1的表達(dá)，其中包括N-Myc、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)、Sp1、堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(Twist1)、叉頭蛋白M1、E2家族轉(zhuǎn)錄因子1和婆羅雙樹樣基因4[9,13-14]。研究表明，癌細(xì)胞可通過OCT4誘導(dǎo)分化抑制因子1(inhibitor of DNA binding 1，ID1)和NF-κB協(xié)同觸發(fā)BMI1和CD44 mRNA高表達(dá)，促進(jìn)頭頸部CSCs的生成[15]?？缒さ鞍證D44作為頭頸部腫瘤干細(xì)胞特性最敏感的生物標(biāo)志物之一，對于維持腫瘤異質(zhì)性必不可少[16-17]。Prince等[17]經(jīng)免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CD44+HNSCC的CSCs中表達(dá)高水平的核BMI1，并呈膜高表達(dá)CD44與核高表達(dá)BMI1基因的特點分布排列在腫瘤微域中。同時證明了HNSCC的CSCs亞群在小鼠體內(nèi)有強(qiáng)致瘤性且表現(xiàn)出異質(zhì)性表達(dá)。有證據(jù)顯示，在HNSCC中BMI1+CSCs可選擇性地獲得共刺激分子CD80的高表達(dá)以抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的活性，從而逃避免疫及化療藥物的殺傷，而當(dāng)抑制BMI1后觀察到DNA損傷的特異性標(biāo)志物pH2A.X在HNSCC中顯著升高，同時誘導(dǎo)了與CD8+T細(xì)胞募集相關(guān)的趨化因子(MIG、IP-10、I-TAC 和CCL5)的轉(zhuǎn)錄，促使其向腫瘤病灶區(qū)域的募集，殺傷腫瘤細(xì)胞[4-5,18]。乳腺癌相關(guān)研究表明BMI1、Wnt/β-catenin、Notch、PI3K-AKT-mTOR、和Hedgehog(Hh)等信號通路控制著乳腺癌干細(xì)胞在主要區(qū)域上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的激活以及腫瘤的發(fā)生與生長[19-20]。在NPC細(xì)胞中BMI1過表達(dá)可誘導(dǎo)EMT，激活NPC上皮細(xì)胞株與喉聲門下細(xì)胞(human subglottic,HSG)的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,HTERT ) ，促進(jìn)口腔上皮的異常增生[12,21-23]。而當(dāng)敲除BMI1或使用BMI1抑制劑時，可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞以上生物學(xué)進(jìn)程。隨著研究的深入，越來越多證據(jù)指向BMI1對頭頸鱗癌CSCs的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，在頭頸鱗癌的疾病進(jìn)程起著重要作用。

2.1 OSCC與BMI1

OSCC是多發(fā)于舌、頰、牙齦及唇等部位的口腔惡性腫瘤[1]，該病的主要危險因素與吸煙、飲酒和咀嚼檳郎等行為，以及由人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16和HPV18和EB病毒引起的感染密切相關(guān)[24]。OSCC中CSCs亞群的存在是其復(fù)發(fā)及不良預(yù)后的重要原因，也是其腫瘤異質(zhì)性的決定因素，調(diào)控正常干細(xì)胞分裂的信號通路(BMI1、Notch、Wnt和Hedgehog等)也參與了口腔癌的發(fā)生，細(xì)胞信號通路發(fā)生異常激活后，通路之間的串?dāng)_促使CSCs的生長，并調(diào)節(jié)OSCC細(xì)胞的活性[25]。Kalish等[26]通過4-硝基喹啉1-氧化物(4-nitro-quinoline 1-oxide,4-NQO)誘導(dǎo)舌上皮干細(xì)胞BMI1異位過表達(dá)小鼠口腔癌變模型，發(fā)現(xiàn)外源性BMI1的表達(dá)改變了正常舌上皮中蛋白質(zhì)翻譯和氧化還原的穩(wěn)態(tài)，增加了小鼠對OSCC的易感性，加強(qiáng)了BMI1作為人類OSCC治療靶點的證據(jù)。Rao等[27]研究發(fā)現(xiàn)OSCC樣本中BMI1、OCT4和乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1)三種細(xì)胞表面標(biāo)記物均陽性表達(dá)的病例生存率較單一BMI1表達(dá)病例生存率顯著降低，三者可作為一組有效標(biāo)志物預(yù)測患者的預(yù)后，提高OSCC的CSCs亞群識別準(zhǔn)確度。有趣的是，BMI1過表達(dá)還與口腔癌變過程中的上皮異常增生有關(guān)，是口腔黏膜下纖維化[28]、口腔白斑[29]、口腔紅斑[23]、口腔扁平苔蘚[30]患者向OSCC發(fā)展的預(yù)測指標(biāo)之一。

2.2 NPC與BMI1

NPC是發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，在東南亞地區(qū)及我國華南地區(qū)高發(fā)[31]。其發(fā)病解剖位置隱蔽，早期癥狀與良性病變相似，早期確診患者比例不足20%[32]。鼻咽周圍毗鄰腦干等重要器官，且對放射治療高度敏感，因此放療是無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移NPC患者的重要治療手段[31,33]。NPC患者在接受放療后，由于輻射損傷導(dǎo)致口腔上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，BMI1被募集到DNA損傷位點以促進(jìn)輻射損傷后的修復(fù)。然而BMI1的持續(xù)過表達(dá)，伴隨其下游靶基因p16、p14的下調(diào)，促進(jìn)了第二原發(fā)口腔鱗癌的發(fā)生及進(jìn)展[34]。Deng等[35]研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44高表達(dá)的NPC干細(xì)胞樣細(xì)胞(cancer stem cell-like cells,CSC-LCs) 在抑制BMI1后可顯著提高其放療敏感性，促進(jìn)CSC-LCs的細(xì)胞殺傷作用。經(jīng)BMI1 shRNA慢病毒載體特異性下調(diào)BMI1后細(xì)胞周期進(jìn)程受抑制，然而DNA DSB修復(fù)具有強(qiáng)細(xì)胞周期依賴性。sh-BMI1 CD44+NPC-CSC-LCs接受放射刺激后 G1期延長,對輻射最敏感的G2/M期阻滯，導(dǎo)致DNA DSB修復(fù)率顯著降低,細(xì)胞凋亡增加。Xu等[36]通過裸鼠體內(nèi)成瘤實驗證實了sh-BMI1可削弱CD44+NPC-CSC-LCS的體內(nèi)致瘤性。BMI1也參與EMT過程，調(diào)控癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。E-鈣粘蛋白(E-cadherin)和Twist1作為EMT的標(biāo)志物，一方面Twist1可直接增強(qiáng)BMI1的轉(zhuǎn)錄。另一方面，在鋅指轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)下，BMI1能與E-cadherin啟動子結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)同時上調(diào)纖維連接蛋白及波形蛋白,進(jìn)而導(dǎo)致鼻咽上皮細(xì)胞遷移及侵襲力增強(qiáng)[12]。此外，BMI1還可與抑癌基因PTEN位點結(jié)合，下調(diào)PTEN的表達(dá)后激活PI3K-Akt通路，促使NPC復(fù)發(fā)[37]。由此可推測BMI1是激活PI3K-Akt通路、誘導(dǎo)EMT、促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要影響因子。

2.3 LC與BMI1

LC的發(fā)病率占頭頸部惡性腫瘤的13.9%，以鱗狀細(xì)胞癌最常見[38]。Fernandes等[39]使用干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD133和CD117，將LC細(xì)胞區(qū)分為喉癌干細(xì)胞(laryngeal cancer stem cells,LCSCs)和喉癌非干細(xì)胞(non-LCSCs),證實了LC細(xì)胞株Hep-2的LCSCs亞群具有更強(qiáng)的致瘤潛能。LC常伴有低氧應(yīng)激，在低氧條件下，LC細(xì)胞株Hep-2和AMC-HN-8顯示出G0/G1期的擴(kuò)增細(xì)胞，并表現(xiàn)出缺氧誘導(dǎo)因子的上調(diào)，以及干細(xì)胞基因OCT4、SOX2和NANOG表達(dá)增加和CD133的優(yōu)先表達(dá)[40]。CD133是廣泛認(rèn)可的LCSCs標(biāo)志物之一，Wei等[41]利用殼聚糖-甲氧基聚乙烯納米粒合成了沉默BMI1基因的CD133+Hep-2腫瘤細(xì)胞(mPEG-CS-BMI1RNAi-NPs)，將其與紫杉醇共培養(yǎng)時，CD133+BMI1RNAi細(xì)胞對化療的敏感性較CD133+Hep-2腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)，侵襲能力降低，證明BMI1的表達(dá)是CD133+LCSCs致瘤性的核心。研究顯示BMI1過表達(dá)可顯著抑制喉癌細(xì)胞系Hep-2的放化療敏感性，促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展[42]。有趣的是，單獨(dú)BMI1基因的過表達(dá)并不能促使細(xì)胞癌變。Tan等[22]研究報道，單獨(dú)轉(zhuǎn)染BMI1的原代喉上皮細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)不具有活體成瘤的特征。另一項實驗證明，未經(jīng)致癌物4-NQO誘導(dǎo)的BMI1異位過表達(dá)轉(zhuǎn)基因鼠不發(fā)生癌變[26]。證明了BMI1需要與其他影響因子互相作用，發(fā)揮致癌性。大多數(shù)癌癥通過DNA的逆轉(zhuǎn)錄合成來激活端粒酶并延長端粒，以避免細(xì)胞死亡和獲得無限增殖能力。而BMI1可通過特異性激活上皮來源細(xì)胞的端粒酶，誘導(dǎo)喉上皮細(xì)胞永生化。Tan等[22]研究人員將BMI1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入HSG，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中HTERT和磷酸化Rb的表達(dá)明顯增強(qiáng)并保持穩(wěn)定，HTERT表達(dá)上調(diào)是細(xì)胞無限復(fù)制的最常見途徑，由此克服穩(wěn)定傳代的壽命限制，衰老細(xì)胞減少，細(xì)胞增殖能力顯著上升。

3 BMI1與頭頸鱗癌的治療

3.1 BMI1靶向治療

到目前為止，化療、放療和手術(shù)治療仍然是HNSCC的常規(guī)治療方法，由于CSCs存在化療耐藥和放射治療耐受性，使其能夠逃脫放化療的殺傷。已知頭頸癌干細(xì)胞對5-氟尿嘧啶、順鉑、多西紫杉醇、西妥昔單抗和PI3K抑制劑(ZSTK474和PX-866)有耐藥性[39]。目前，抗程序性死亡受體-1(programmed death-1,PD-1)的免疫檢查點抑制劑和化療藥物的聯(lián)合療法已被批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性頭頸癌的一線治療，對HNSCC的治療效果有所改善。但患者對該聯(lián)合療法的客觀應(yīng)答率不高，中位應(yīng)答持續(xù)時間相對較短[4]。此外，Jia等[4]發(fā)現(xiàn)，在HNSCC中聯(lián)合應(yīng)用抗PD-1單抗和順鉑可以促使非干細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的凋亡，卻不能有效針對可逃避CD8+T細(xì)胞殺傷作用的BMI1+CSCs，反而造成了病灶處BMI1+CSCs的富集，最后導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)機(jī)率上升。最近的一項研究表明，BMI1參與了RAD51依賴的復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)(replication stress,RS)，當(dāng)使用BMI1抑制劑時，乳腺癌干細(xì)胞(breast cancer stem cells,bCSCs)內(nèi)RS大量增加，這導(dǎo)致了bCSCs的化療敏感性上升，最終bCSCs比例降低[43]。因此，靶向破壞CSCs將成為治療的新方向。BMI1作為與CSCs密切相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，靶向BMI1小分子是控制癌癥進(jìn)展的有效途徑。2014年，Kreso研究團(tuán)隊首次發(fā)現(xiàn)BMI1特異性抑制劑PTC-209可在腫瘤組織內(nèi)負(fù)調(diào)控BMI1、抑制結(jié)腸及直腸癌細(xì)胞的生長，可對大腸癌起始細(xì)胞造成長期且不可逆轉(zhuǎn)的損害[44]。PTC209現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于膽道癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性粒細(xì)胞白血病和多發(fā)性骨髓瘤等癌癥治療的研究中[43,45]。在HNSCC中使用PTC209或敲除BMI1基因后，聯(lián)合抗PD-1單抗或順鉑治療可募集和激活CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)源性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)藥物對CSCs的殺傷作用。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，使用該聯(lián)合治療方案的HNSCC細(xì)胞中BMI1+腫瘤細(xì)胞稀少存在或未能檢測到，細(xì)胞侵襲性降低，病灶面積更小甚至無法檢測到病灶，復(fù)發(fā)率更低[4,46]。由此，筆者認(rèn)為靶向BMI1+CSCs將成為癌癥臨床治療的重要探索方向。2018年，Dey等[47]首次報道了第二代BMI1特異性抑制劑PTC-028，其通過誘導(dǎo)BMI1過度磷酸化而逐漸耗竭，激活Caspase依賴的細(xì)胞凋亡，顯著影響卵巢癌細(xì)胞的克隆生長與活力。在卵巢原位癌小鼠模型中，口服PTC-028具有單藥抗腫瘤活性，與順鉑或紫杉醇腹腔注射療效相似。而PTC-596作為另一種常用小分子BMI1抑制劑，可特異性誘導(dǎo)BMI1蛋白在納米分子水平上降解，導(dǎo)致急性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞系和原代母細(xì)胞的線粒體凋亡且對正常造血細(xì)胞無影響。目前已進(jìn)入晚期實體腫瘤患者的第一階段臨床試驗(NCT02404480)[45]。

3.2 放射治療

放化療常作為晚期及復(fù)發(fā)性惡性腫瘤的重要治療手段，但電離輻射會引起口腔黏膜炎、口干、放射性骨壞死和第二原發(fā)腫瘤等一系列并發(fā)癥[34]。有研究報道，頭頸部CSCs細(xì)胞在接受2.5 Gy至高達(dá)10 Gy劑量的電離輻射處理后，評估CSCs的球體遷移及存活率，結(jié)果顯示球體遷移區(qū)域沒有顯著變化，且細(xì)胞活性測定觀察到CSCs的高存活率，證實其極強(qiáng)的抗輻射能力[48]。Hu等[34]采用體外培養(yǎng)的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT進(jìn)行放療，經(jīng)照射后的HaCaT細(xì)胞中BMI1表達(dá)顯著上調(diào)，且與X射線照射時間成正比。多項研究報道稱，當(dāng)敲除BMI1基因或靶向BMI1高表達(dá)的 CSCs時，頭頸癌[27]、乳腺癌[9]、直腸癌[49]、肝癌[50]等CSCs的放射敏感性顯著增加。因此，減少輻射抵抗的影響因子、增強(qiáng)腫瘤放療敏感性對于提高頭頸癌臨床療效至關(guān)重要。由此可認(rèn)為，BMI1是治療頭頸癌等實體瘤的可行靶點，具有較大的研究意義。

4 總 結(jié)

迄今為止，各研究報告顯示BMI1的異常表達(dá)可對CSCs的增殖、分化、腫瘤形成和對放化療的耐受性產(chǎn)生影響，導(dǎo)致患者治療效果不佳，其作為HNSCC CSCs標(biāo)志物的證據(jù)豐富。相比于使用單個基因作為生物標(biāo)志物，將BMI1結(jié)合CD44、CD133、ALDH1及OCT4等共表達(dá)組合可提高腫瘤干細(xì)胞識別精度[27]。筆者認(rèn)為，未來仍需深入研究BMI1在p16、p53、Twist1、Snail、PTEN、RAD51及Rb等上下游調(diào)控因子中的作用及引發(fā)的后續(xù)效應(yīng)，進(jìn)一步探討B(tài)MI1與PTEN、低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)相互作用后激活的PI3K-Akt通路，以及BMI1誘導(dǎo)端粒酶活性和驅(qū)動EMT等過程對HNSCC病程發(fā)展的影響。此外，合理應(yīng)用BMI1的靶向藥物，可協(xié)同現(xiàn)有的腫瘤治療策略，優(yōu)化HNSCC治療方案，提高BMI1+CSCs細(xì)胞的殺傷率，降低疾病復(fù)發(fā)率。對于不同頭頸區(qū)域的鱗癌，其生理解剖特點及癌癥生物學(xué)特性存在差異，后續(xù)研究仍需關(guān)注BMI1對于各部位頭頸腫瘤干細(xì)胞的異質(zhì)性，以探索頭頸部鱗癌的差異化、精準(zhǔn)化治療。

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