PCSK9與高脂血癥性胰腺炎相關(guān)性機(jī)制探討

楊小妹,馬康康,高俊茶

【提要】 高脂血癥性胰腺炎在近十年中越來越受到人們的關(guān)注，與其他病因胰腺炎相比，高脂血癥性胰腺炎重癥化比例高，并發(fā)癥更多，預(yù)后更差，具有復(fù)雜的病理生理過程。雖然最新的很多研究揭示了高脂血癥性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，但是對(duì)于高脂血癥性胰腺炎的分子機(jī)制仍然知之甚少，因此，迫切需要對(duì)該病的病理生理機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型是前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族中的一種，由血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，主要通過調(diào)節(jié)肝臟低密度脂蛋白受體的表達(dá)和分泌活性來發(fā)揮作用，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。有研究發(fā)現(xiàn)，前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型可作為胰腺炎新的診斷分子，參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程，對(duì)整體預(yù)后的預(yù)測(cè)有一定的作用。遺憾的是，目前，相關(guān)報(bào)道尚不多，具體分子作用機(jī)制尚不明確，因此，本文將前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型與高脂血癥性胰腺炎的關(guān)系做一綜述。

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是一種典型的無菌性內(nèi)源性胰腺損傷形式，表現(xiàn)為局部或胰腺周圍炎癥，甚至為全身性炎癥反應(yīng)綜合征和遠(yuǎn)處多臟器損傷。盡管當(dāng)前臨床上AP的診治水平有所提高，但該病的死亡率仍保持在5%左右[1]。已知在所有病因中，高脂血癥性急性胰腺炎(hypertriglyceridemia acute pancreatitis，HLAP)的癥狀和并發(fā)癥更為嚴(yán)重，且易反復(fù)發(fā)作[2]，此外，HLAP病理分級(jí)也更為嚴(yán)重，更容易迅速進(jìn)展為壞死性胰腺炎，導(dǎo)致重癥胰腺炎[3]。已有大量研究證實(shí)，炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子激活并發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)在HLAP的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要地位[4]，在急性反應(yīng)期持續(xù)的全身炎癥反應(yīng)更容易發(fā)展為重癥化。因此，只有充分了解HLAP的病理生理機(jī)制，才能識(shí)別潛在的重癥急性胰腺炎患者，并使其盡快得到重癥監(jiān)護(hù)和恰當(dāng)治療[5]。

目前游離脂肪酸及炎癥反應(yīng)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。游離脂肪酸可通過激發(fā)炎癥反應(yīng)的惡性循環(huán)、進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜受體活性改變及細(xì)胞器破壞，造成胰腺腺泡細(xì)胞損傷進(jìn)而引發(fā)HLAP。其中由核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)引發(fā)的炎癥變化是造成AP病情加重的原因之一。已知在前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌素/kexin9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9)介導(dǎo)的炎癥研究中，Toll樣受體4(toll-likereceptor-4，TLR4)/NF-κB通路是影響炎癥的主要信號(hào)通路，可以激活NF-κB上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，攜帶PCSK9功能減弱基因的患者血漿促炎癥因子IL-6、IL-8及TNF-α水平顯著低于攜帶PCSK9功能增強(qiáng)基因的患者[7]，與全身和血管炎癥之間存在密切關(guān)系[8]。有研究報(bào)道，在AP發(fā)病過程中，由于內(nèi)毒素血癥，導(dǎo)致脂多糖升高，刺激肝細(xì)胞合成和分泌PCSK9 增加[9]，進(jìn)一步導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)的持續(xù)，引起局部并發(fā)癥的發(fā)生，最終表現(xiàn)為預(yù)后不良，臨床病程反復(fù)[10]。并且有研究提出PCSK9與甘油三酯水平存在正相關(guān)關(guān)系[11]，而甘油三酯水平升高與HLAP密切相關(guān)，這些發(fā)現(xiàn)提示PCSK9可能在HLAP炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。因此，明確PCSK9在HLAP的中病理生理機(jī)制勢(shì)在必行。

1 PCSK9結(jié)構(gòu)

PCSK9是一個(gè)74 kDa的酶原，由12個(gè)外顯子組成，全長(zhǎng)22 kb，編碼692個(gè)氨基酸。由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，即N端前結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽、催化結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。在后者中，又包含M1、M2和M3三個(gè)模塊。含組氨酸最豐富的模塊是M2，包含14個(gè)跨結(jié)構(gòu)域組氨酸中的9個(gè)(CHRD)，PCSK9由分子量為74 kDa的可溶性原PCSK9在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體中通過自催化作用，并從N端釋放分子量為14 kDa的原肽，隨后生成成熟蛋白(60 kDa)。這種自切割對(duì)PCSK9的生物學(xué)反應(yīng)和成熟度至關(guān)重要。在自催化之后，會(huì)暫時(shí)結(jié)合到催化結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn)上，護(hù)送活性的PCSK9貫穿整個(gè)細(xì)胞，這是該酶所獨(dú)有的。前結(jié)構(gòu)域N端抑制PCSK9的轉(zhuǎn)化酶活性，阻止其與周圍底物相互作用。提示前結(jié)構(gòu)域通過釋放催化結(jié)構(gòu)域來調(diào)節(jié)PCSK9的作用[12]。研究發(fā)現(xiàn)，PCSK9在肝臟、小腸和腎臟中廣泛表達(dá)，肝臟是PCSK9蛋白發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)，也是PCSK9循環(huán)的主要來源[13]。據(jù)國外研究報(bào)道，PCSK9 mRNA還表達(dá)在小鼠胰島上，不過PCSK9 mRNA是否在人體胰島上表達(dá)尚無報(bào)道[14]。

2 PCSK9功能

PCSK9是原蛋白轉(zhuǎn)換酶家族中的第九個(gè)成員，于2003年，Abifadel和他的同事在兩個(gè)家族性高膽固醇血癥常染色體顯性遺傳的法國家庭中發(fā)現(xiàn)了編碼PCSK9的基因突變，并被確定為膽固醇穩(wěn)態(tài)的參與者[15]。在大腦神經(jīng)元凋亡的情況下，PCSK9 cDNA有一定程度的上調(diào)，因此，經(jīng)鑒定，它最初被命名為神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換酶1(neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-1)[13]，是參與原蛋白激活的分泌蛋白家族的新成員[16]。

PCSK9主要生理功能是調(diào)節(jié)肝臟中低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)半衰期的循環(huán)蛋白。PCSK9在肝臟作為前體蛋白產(chǎn)生后，經(jīng)過分子內(nèi)自催化裂解，由此產(chǎn)生的異源二聚體被分泌進(jìn)入循環(huán)。PCSK9與LDLR的表皮生長(zhǎng)因子前體同源結(jié)構(gòu)域A結(jié)合，并與受體一起內(nèi)化。在酸性條件下，存在于核內(nèi)體中的LDLR和PCSK9之間的親和力增加，導(dǎo)致LDLR的構(gòu)象改變，阻止了LDLR的正常循環(huán)，促使LDLR轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體進(jìn)行降解，使血漿中LDL水平增高，在膽固醇穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。LDLR-PCSK9復(fù)合物發(fā)生細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制尚未完全闡明。該復(fù)合物可以通過細(xì)胞外核內(nèi)體-溶酶體途徑或通過細(xì)胞內(nèi)高爾基-溶酶體途徑到達(dá)溶酶體。隨著對(duì)PCSK9研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)除可調(diào)控LDLR水平之外，還具有參與炎癥反應(yīng)、介導(dǎo)細(xì)胞凋亡等生物功能。下面就PCSK9與HLAP相關(guān)的炎癥反應(yīng)、脂代謝、細(xì)胞凋亡等方面做一闡述。

3 PCSK9致HLAP可能的機(jī)制

3.1 PCSK9 與炎癥反應(yīng)

目前已經(jīng)有很多關(guān)于PCSK9對(duì)促炎細(xì)胞因子影響的研究，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染和炎癥刺激PCSK9的表達(dá)。PCSK9基因敲除小鼠表現(xiàn)出炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，對(duì)脂多糖的反應(yīng)降低，對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用，而PCSK9過表達(dá)則會(huì)加劇多器官病理損傷以及膿毒癥早期的促炎狀態(tài)。在轉(zhuǎn)基因小鼠的體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，升高 PCSK9 濃度可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞LDLR相關(guān)蛋白1的降解，而LDLR相關(guān)蛋白1缺乏則下調(diào)了巨噬細(xì)胞中抗炎表型M2表達(dá)，同時(shí)刺激巨噬細(xì)胞表達(dá)促炎表型M1，并加強(qiáng)炎癥因子的分泌[18]。

值得注意的是，NF-κB在PCSK9表達(dá)介導(dǎo)的炎癥刺激中具有重要的信號(hào)傳導(dǎo)作用。巨噬細(xì)胞中PCSK9過表達(dá)可誘導(dǎo)NF-κB核移位，增加促炎細(xì)胞因子mRNA水平和TLR4表達(dá)，促進(jìn)促炎基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致全身炎癥[12]。相比之下，在oxLDL處理后的巨噬細(xì)胞，PCSK9基因敲除顯著減弱了這些影響，有研究表明，由于PCSK9 C末端富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域與抵抗素結(jié)構(gòu)同源，推測(cè)PCSK9可能通過與TLR4的C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，上調(diào)TLR4的表達(dá)，激活TLR4/NF-κB信號(hào)通路，從而上調(diào)促炎細(xì)胞因子水平[15]。然而，還需要更多的研究來闡明PCSK9激活TLR4/NF-κB通路的機(jī)制。還有研究表明，PCSK9與氧化低密度脂蛋白受體-1(oxidized LDL receptor-1，LOX-1)以相互促進(jìn)的方式相互作用，增加對(duì)oxLDLs的攝取，oxLDLs作為配體結(jié)合TLR4，激活NF-κB從而上調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)促炎狀態(tài)[19]。這些觀察表明PCSK9調(diào)控TLR4的表達(dá)和NF-κB的激活以及與LOX-1以相互促進(jìn)的方式相互作用，促進(jìn)炎癥的表達(dá)。

近年來，大量的研究數(shù)據(jù)證實(shí)了NF-κB的激活和氧化應(yīng)激在AP發(fā)生、發(fā)展過程具有損傷和促進(jìn)作用[20]。盡管NF-κB在腺泡內(nèi)激活的機(jī)制尚不清楚，但有研究表明，病理鈣信號(hào)、蛋白C亞型激活和活性氧產(chǎn)物的生成啟動(dòng)了腺泡內(nèi)NF-κB炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且抑制該活性可減輕AP的嚴(yán)重程度[21]，因此，認(rèn)為NF-κB活化是炎癥進(jìn)展的關(guān)鍵步驟。1998年，Gukovsky等首次報(bào)道了AP期間腺泡細(xì)胞NF-κB的活化。并表明病理性胰蛋白酶原激活的缺失并不影響腺泡內(nèi)NF-κB的激活，NF-κB激活是一個(gè)獨(dú)立于胰蛋白酶原激活的早期事件，并在誘發(fā)AP中充分發(fā)揮作用[22]。然而，目前還不清楚發(fā)展為AP是否同時(shí)需要這兩個(gè)條件。正常生理?xiàng)l件下TLR4/ NF-κB通路的活化可激活機(jī)體免疫應(yīng)答，然而炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是在天然免疫反應(yīng)開始之前通過NF-κB的激活在腺泡細(xì)胞中開始的，并且通過TLR促發(fā)的髓樣分化因子88途徑啟動(dòng)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[23]，同時(shí)釋放的炎癥因子又可以作為激活物激活NF-κB，放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病情進(jìn)一步加重。此外，也研究證實(shí)，柴苗皂苷a通過與NF-κB密切相互作用，抑制其信號(hào)通路，隨后抑制AP相關(guān)促炎細(xì)胞因子的釋放，對(duì)炎癥反應(yīng)起到保護(hù)作用，減輕器官損傷[1]?？梢钥闯?，在AP的發(fā)病機(jī)制中，NF-κB在將初始腺泡損傷與全身炎癥聯(lián)系起來中起著核心作用。因此，PCSK9在NF-κB信號(hào)通路中可能作為一個(gè)新的靶點(diǎn)參與調(diào)節(jié)AP的炎癥反應(yīng)過程。

3.2 PCSK9與細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一種不引起炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡，細(xì)胞凋亡的復(fù)雜性一直是眾多研究的焦點(diǎn)，已知p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 motigen-activated protein kinase， MAPK)通路是真核生物信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中最重要的信號(hào)通路之一，參與多種細(xì)胞功能，特別是細(xì)胞增殖、分化和凋亡。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在載脂蛋白E基因敲除的小鼠中，PCSK9可通過c-Jun氨基末端激酶/MAPK信號(hào)途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[24]。Ece等[23]揭示了oxLDL刺激引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加與PCSK9過表達(dá)之間的相關(guān)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制PCSK9表達(dá)可影響B(tài)cl-2/Bax比值的變化，降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinecontaining aspartate-specific proteases9和3，Caspase9和3 ) 的活性，明顯抑制oxLDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。有研究結(jié)果表明，oxLDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及PCSK9和LOX-1的表達(dá)，用PCSK9 siRNA預(yù)處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可阻斷oxLDL的上述作用，提示PCSK9 siRNA可抑制oxLDL誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，其中Bcl/Bax-caspase9-caspase3通路可能通過降低Bcl-2/Bax比值，抑制caspase9和caspase3的激活而發(fā)揮作用[25]。PCSK9抑制也降低了c-Jun氨基末端激酶和p38的磷酸化，后者在氧化應(yīng)激、IL-1、TNF-α和G蛋白偶聯(lián)受體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[26]。另外也有研究表示，脂多糖處理培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞可刺激PCSK9的釋放，在活性氧的參與下通過p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體DNA的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞凋亡[27]。

田璐[28]等發(fā)現(xiàn)，AP時(shí)胰液異常釋放引起的胰腺細(xì)胞內(nèi)MAPK活化主要與胰腺細(xì)胞的凋亡有關(guān)。在機(jī)體受到缺氧、缺血以及炎性因子等刺激下，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間平衡的改變導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。進(jìn)一步激活下游caspase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，小鼠肝臟中p38-MAPK磷酸化和caspase-3切割與AP的誘導(dǎo)及Fas配體的上調(diào)有關(guān)，提示藍(lán)素誘導(dǎo)的AP上調(diào)肝臟中促凋亡通路，促進(jìn)肝細(xì)胞損傷和肝細(xì)胞死亡[29]。朱等[30]研究顯示，黃芩素可下調(diào)肺組織中p-p38MAPK和Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，進(jìn)而改善胰腺的病理損傷。早在1999年Gomez等人便得出，多種基因在AP發(fā)生時(shí)被激活進(jìn)而用于調(diào)控胰腺腺泡細(xì)胞凋亡。在脂多糖刺激之前給予p38抑制劑處理，脂多糖所致的中性粒細(xì)胞凋亡明顯增強(qiáng)，說明抑制p38途徑能調(diào)節(jié)脂多糖刺激后中性粒細(xì)胞內(nèi)ERK-MAPK途徑的激活，促進(jìn)急性炎細(xì)胞凋亡，從而減輕對(duì)正常組織的損傷作用[31]。

3.3 PCSK9與脂質(zhì)代謝

Shirya等[32]首次提出了PCSK9在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平驅(qū)動(dòng)腸細(xì)胞合成載脂蛋白B和甘油三酯，并表示PCSK9刺激膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1脂肪酸/甘油三酯生物合成途徑中靶基因的表達(dá)，從而增加腸細(xì)胞中間密度脂蛋白的合成，這可能是PCSK9促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯生物合成的原因之一。有研究提出血漿PCSK9和甘油三酯水平之間的正相關(guān)是間接的，PCSK9通過消耗LDLR而阻止中間密度脂蛋白和乳糜微粒殘余物的代謝從而升高甘油三脂，也可能通過對(duì)其他LDLR樣受體，如CD36、VLDL受體的降解來升高甘油三酯[10]。但也有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PCSK9抑制劑并未對(duì)VLDL載脂蛋白B和VLDL甘油三酯生成有影響，但它能增加VLDL載脂蛋白B和VLDL甘油三酯的分解代謝，表明PCSK9可能并不影響甘油三脂的脂蛋白生成，而只影響其清除[33]。而且PCSK9抑制劑對(duì)甘油三酯水平的影響，不同的研究結(jié)果差異很大，甘油三酯下降范圍從3.3%～33.7%不等[34]。Hitoshi等[35]指出，PCSK9除了作為肝臟LDL代謝的中介外，也與胰島素抵抗和甘油三酯水平呈正相關(guān)，是腸道富含甘油三酯的ApoB脂蛋白代謝的重要調(diào)節(jié)因子，通過影響富含甘油三酯顆粒的LDL代謝而影響血清甘油三酯水平。PCSK9基因的功能缺失突變也將導(dǎo)致富含甘油三酯的脂蛋白減少，甘油三酯水平降低[36]。

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia，HTG)導(dǎo)致胰腺炎的機(jī)制目前尚不完全清楚，最早由Havel提出的一個(gè)被廣泛接受的機(jī)制，即滲出到胰腺腺泡細(xì)胞外的胰脂肪酶水解胰腺內(nèi)和胰腺周圍的甘油三脂，導(dǎo)致游離脂肪酸增多引起胰腺局部缺血以及酸堿失衡，進(jìn)一步增加了游離脂肪酸的細(xì)胞毒性，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[37]。Saharia等[38]人的實(shí)驗(yàn)研究支持了這一假設(shè)，用脂肪酸灌注胰腺會(huì)導(dǎo)致胰腺制劑的水腫和出血，此外，在AP動(dòng)物模型中，HTG已被證明有助于并加速炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致HLAP。這些研究進(jìn)一步印證了HTG對(duì)胰腺的損傷，從而誘發(fā)HLAP。目前研究證實(shí)PCSK9與甘油三酯水平密切相關(guān)，因此PCSK9在HLAP的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用，有望成為HLAP相關(guān)研究的新靶點(diǎn)。

4 總結(jié)與展望

綜上所述，PCSK9可通過NF-κB通路調(diào)控炎癥反應(yīng)，以及通過MAPK通路調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，此外，還發(fā)現(xiàn)PCSK9具有參與脂代謝，調(diào)控甘油三酯水平的作用。已知HLAP的病理生理過程不僅有炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的參與，而且高甘油三脂水平也參與其中，因此，PCSK9與HLAP的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。但是相關(guān)機(jī)制是復(fù)雜的，有許多未知的病理生理機(jī)制需要去探索，需要更多的動(dòng)物及臨床實(shí)驗(yàn)進(jìn)行專門的驗(yàn)證。鑒于上述理論和實(shí)踐基礎(chǔ)，我們將在臨床上進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，為診治HLAP提供新的靶點(diǎn)，旨在為HLAP患者帶來的福音。