PAX8與上皮性卵巢癌的關系研究

唐 帆，郭桂蘭

（1.青海大學研究生院，青海 西寧 810000；2.青海大學附屬醫(yī)院婦科，青海 西寧 810000）

上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）在所有卵巢癌中大約占90%，其致死率在婦科腫瘤中居首位。EOC 按照組織類型主要可以分為漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌、透明細胞性癌和粘液性癌[1]，其中卵巢高級別漿液性癌（high-grade serous ovarian carcinoma，HGSC）占卵巢癌的80%，是EOC 中最致命的組織學亞型，也是惡性程度和致死率最高的婦科腫瘤[2]。目前，越來越多的組織學、分子和動物模型證據(jù)表明[3-5]，大多數(shù)EOC 病例來源于輸卵管上皮（fallopian tube epithelium，F(xiàn)TE）。配對盒基因8 抗原（paired box gene 8，PAX8）是目前卵巢癌中公認的可用于診斷的生物標志物，是EOC 中典型的譜系存活癌基因，其在HGSC 中表達，并與輸卵管上皮發(fā)育有關[6]。PAX8 通過限制基因轉(zhuǎn)錄在維持細胞功能上扮演重要角色，近年在基因靶向治療方面?zhèn)涫荜P注。因此，研究PAX8 有助于了解卵巢癌的起源部位和致癌特性，并有望為治療EOC 提供期望藥物靶標。本文主要就PAX8 與上皮性卵巢癌的關系進行綜述，以期為上皮性卵巢癌的臨床診斷、評估病情進展及預后、指導個體化治療提供參考。

1 PAX8的生物學特性

1.1 PAX8的結(jié)構(gòu)與功能 PAX8 位于人染色體2q12-q14 上，是配對盒基因（paired boxgene，PAX）家族中的一員，該家族共有9 個基因，每個基因都編碼1 個含有配對盒DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和（或）1 個八肽域，和（或）1 個同源域的轉(zhuǎn)錄因子蛋白。這9 個基因根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為4組：Ⅰ組（PAX1/PAX9）、Ⅱ組（PAX2/PAX5/PAX8）、Ⅲ組（PAX3/PAX7）和Ⅳ組（PAX4/PAX6）[7]。PAX 基因家族是胚胎組織發(fā)育和細胞分化的調(diào)節(jié)因子，起著促進細胞增殖、細胞譜系特異性維持、細胞遷移和細胞存活的作用。當發(fā)育完成后，PAX 基因的表達會減弱。但是在一些組織中PAX 基因的表達仍會持續(xù)到成年，或者其重新表達也是可能的。組成Ⅱ組（PAX2/PAX5/PAX8）的3 個基因在多種類型的癌癥中表達，因此有可能作為腫瘤標志物。

有學者用染色質(zhì)免疫沉淀偶聯(lián)測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技術證明PAX8 傾向于結(jié)合內(nèi)含子區(qū)域（82%）超過5’-UTR調(diào)節(jié)區(qū)域（2%），這表明PAX8 可能與調(diào)控基因表達的其他啟動子或非編碼RNA 結(jié)合[8]。此外，PAX8 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CTCF 和轉(zhuǎn)錄因子SP1，兩者均參與染色質(zhì)重塑。這些數(shù)據(jù)表明PAX8 既可以直接增加轉(zhuǎn)錄，也可以重塑染色質(zhì)。另有研究表明[9]，PAX8 已顯示出直接結(jié)合并增加驅(qū)動HGSC的基因（如E2F1和p53）的轉(zhuǎn)錄，這說明PAX8 既可以作為規(guī)范轉(zhuǎn)錄因子，又可以作為表觀遺傳調(diào)節(jié)劑。

1.2 PAX8的作用

1.2.1 PAX8 對生長發(fā)育的作用 PAX8 在胎兒器官形成中具有重要作用[10]。在甲狀腺、苗勒管（苗勒管最終會發(fā)育形成輸卵管、子宮、子宮頸和陰道的上三分之一）和腎臟的器官形成中起著重要的作用，而且PAX8 在成年的甲狀腺和腎臟組織中仍然表達[11-14]。PAX8 是甲狀腺特異性基因甲狀腺球蛋白（thyroglobulin，TG）、甲狀腺過氧化物酶（thyroid peroxidase，TPO）和鈉/碘化物同向轉(zhuǎn)運蛋白基因（Solute carrier family 5 member 5，SLC5A5）表達所必需的[15]。研究發(fā)現(xiàn)，敲除小鼠的PAX8 基因后，小鼠甲狀腺較對照組小，且只有能分泌降血鈣素的濾泡旁C 細胞而沒有濾泡上皮細胞，因此不能產(chǎn)生甲狀腺激素，最終出現(xiàn)嚴重的甲狀腺功能減退癥。進一步的分子機制研究發(fā)現(xiàn)，PAX8 可以直接結(jié)合到甲狀腺特異性基因的啟動子區(qū)域，促進它們的轉(zhuǎn)錄表達。PAX8 敲除的小鼠在斷奶后會死亡，但如果持續(xù)補充甲狀腺素，小鼠仍能繼續(xù)存活6 個月，但有雌鼠會因沒有正常功能的子宮和陰道開口失去生育能力，且雌鼠會出現(xiàn)輸卵管積液和膨大[16]。研究認為，PAX8 屬于主要調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控包括甲狀腺特異性基因之外的其他基因。PAX8 主要在女性生殖系統(tǒng)內(nèi)的異位子宮內(nèi)膜細胞、子宮腺體細胞內(nèi)彌散性分布，在分泌細胞中表達，在正常輸卵管與其傘端處的上皮細胞中呈現(xiàn)斑塊狀表達，在輸卵管型包涵體內(nèi)表達[17]。

1.2.2 PAX8 促進細胞遷移 師凱旋[18]在4 種卵巢癌細胞系中（KURAMOCHI、HEY、SKOV3 和OVTOKO）利用CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9，Cas9）基因組編輯技術，用2 條獨立的單鏈導向RNA 來敲除PAX8 基因，發(fā)現(xiàn)PAX8 處于調(diào)節(jié)子網(wǎng)絡中的核心位置。同時，敲除PAX8 基因不僅抑制了細胞的增殖，而且抑制了細胞的遷移。為了排除細胞增殖和細胞運動之間的交叉影響，該研究進行了活細胞實時成像實驗，發(fā)現(xiàn)敲除PAX8的細胞隨機運動能力下降。另外，Paxillin 和F-actin的免疫熒光染色實驗證實了PAX8 敲除的細胞黏著斑增加。這些研究結(jié)果表明，PAX8 在功能上可以促進卵巢癌細胞的增殖及遷移，且PAX8-FGF18 信號通路以一種自分泌的方式促進腫瘤細胞的遷移。

1.2.3 PAX8 在各類腫瘤中的表達 子宮內(nèi)膜癌、甲腺癌、卵巢癌、腎氣管癌等中均有PAX8 高表達[19]。在約36%的濾泡狀甲狀腺癌中，PAX8 會和氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）發(fā)生重排，成為1 個致癌的融合基因，仍然保留PAX8的DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，調(diào)控細胞周期，促進細胞的增殖[20，21]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著PAX8 表達的升高，患者罹患上皮性卵巢癌以及輸卵管上皮癌的概率會明顯增加。另外，PAX8 在89%的內(nèi)膜樣卵巢癌、100%的透明細胞和96%的甲狀腺癌中均存在高表達，且與患者的預后密切相關[22]。有研究結(jié)果證實[23]，PAX8 參與了婦科惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以及介導了腫瘤的惡性生物學行為，尤其是在苗勒上皮來源惡性腫瘤中高表達，對FTE 源性的惡性腫瘤尤為明顯。

2 PAX8 與上皮性卵巢癌

2.1 PAX8 在上皮性卵巢癌中的機制及高表達PAX8 屬于核蛋白，為苗勒氏腫瘤標記物，具有良好的特異性與敏感性，且在卵巢癌內(nèi)的表達存在高特異性與敏感性[24，25]，在判斷腫瘤細胞來源及鑒別細胞類型上有一定價值，可用于鑒別EOC。癌細胞系的全基因組RNA 干擾篩選是第一個確定PAX8 在卵巢癌中的重要性的方法。在卵巢癌細胞系和非卵巢癌細胞系之間的篩選中，PAX8 是排名最高的差異表達基因。敲低PAX8 可減少卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并增加細胞凋亡[26]。PAX8 可直接結(jié)合并增加p53的轉(zhuǎn)錄，然后增加p21 誘導增殖[27]。PAX8 還通過與RB 蛋白復合的E2f1 啟動子直接結(jié)合增加細胞周期調(diào)節(jié)因子E2f1的轉(zhuǎn)錄，從而促進腫瘤細胞的生長[28]。研究認為[29]，PAX8 病態(tài)的改變是導致輸卵管產(chǎn)生HGSC的基因表達變化的原因。在輸卵管和漿液性腫瘤細胞之間，PAX8 共有結(jié)合基序發(fā)生改變可能會影響下游調(diào)控的基因。

與正常的卵巢組織相比，PAX8 在EOC組織中呈高表達，而在卵巢上皮內(nèi)包含囊腫的無纖毛上皮細胞和3 種上皮性卵巢癌亞型細胞（漿液、子宮內(nèi)膜和透明細胞）中，PAX8 表達并且定位于細胞核中；此外，PAX8 在健康輸卵管粘膜的非纖毛的分泌細胞中表達，而在鄰近的纖毛上皮細胞中不表達[30]。有學者通過全基因組范圍內(nèi)的RNA 干擾篩選來尋找不同類型癌細胞系的遺傳學敏感靶基因，進而在卵巢癌細胞系中發(fā)現(xiàn)了PAX8 對卵巢癌的增殖和存活起著至關重要的作用，并且在16%的原位卵巢腫瘤中出現(xiàn)拷貝數(shù)的增加，因此認為PAX8 是上皮性卵巢癌中1 個典型的譜系存活癌基因。關于PAX8 在上皮性卵巢癌中的表達尚存在爭議，有研究認為PAX8 未在上皮性卵巢癌中明顯表達，而有研究則認為其不僅在卵巢癌中呈陽性表達，還可作為上皮來源和盆腔間皮來源卵巢癌的重要鑒別標志[31，32]。不同的研究的差異可能是由于各個機構(gòu)的病理標本選樣、手術方式、樣本含量等不同所致。鑒于PAX8是FTE 譜系特異性標記物，且大多數(shù)EOC 病例來自輸卵管上皮，因此可以認為PAX8 在EOC 中呈陽性表達。

2.2 PAX8 與上皮性卵巢癌預后的相關性 上皮性卵巢癌細胞的遷移與其預后密切相關。正常卵巢上皮（ovarian surface epithelium，OSE）最初被認為是卵巢癌祖細胞的位點，但是最新的證據(jù)表明正常FTE 是主要的祖細胞位點[33]。有研究使用蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析PAX8 在人類卵巢癌模型以及OSE組織和FTE組織衍生的腫瘤模型中導致遷移能力增強的作用，發(fā)現(xiàn)PAX8 是遷移的主要調(diào)節(jié)劑，其獨特的下游轉(zhuǎn)錄靶標取決于細胞的起源部位[34]。HGSC中的PAX8 敲低可降低細胞增殖、遷移和侵襲，同時誘導細胞死亡[35]。卵巢癌細胞中PAX8 敲低后，腫瘤進展能力減弱[36]。需要說明的是，從健康的FTE 中敲除PAX8 幾乎沒有功能作用，也沒有顯著改變基因表達[37]。因此，在卵巢癌中抑制PAX8的表達能減少癌細胞的轉(zhuǎn)移，有利于卵巢癌的預后，因為卵巢腫瘤細胞依賴于PAX8，而正常FTE 不受PAX8 減少的影響。

2.3 PAX8 在上皮性卵巢癌治療中的作用 鑒于上述PAX8的功能和作用，可以考慮利用其特性來達到治療EOC的目的。唐海峰等[38]采用RNA 干擾技術分別處理HE4、PAX8 及HE4+PAX8 基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶向沉默HE4 和PAX8 基因可增強卵巢癌細胞的化療敏感性。因此，靶向敲降PAX8 基因可協(xié)同化療抑制上皮性卵巢癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力并促進其凋亡，為上皮性卵巢癌的個體化精準治療提供了實驗依據(jù)。PAX8 和Yes 相關蛋白（YAP1）亦存在聯(lián)系，YAP1 是進化保守的Hippo 途徑的主要下游調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)器官大小，細胞增殖和凋亡[37]。而PAX8 主要在非啟動子位點結(jié)合，并在超級增強子中富集，可以全局調(diào)節(jié)參與腫瘤發(fā)生的基因[36]。上述研究表明，PAX8 可以用于藥物開發(fā)，以減少腫瘤細胞的增殖、遷移和存活，同時不影響其他器官。

另外，實驗發(fā)現(xiàn)[39]，廣譜組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑能通過重塑表觀遺傳標記，破壞PAX8 轉(zhuǎn)錄及其下游基因表達，表明PAX8 是對HDAC 抑制劑超敏的基因之一。HDAC抑制和PAX8 消耗均可引起基因表達的整體變化，包括PAX8 調(diào)節(jié)劑。該試驗還組裝了一個患者衍生的異種移植隊列，其中包含來自七種不同類型實體癌的221 個模型，測序轉(zhuǎn)錄組分析表明，PAX8 在兩個EOC的異種移植中表達受限。建立了2 個卵巢異種移植模型，每個模型隨機分為4 個研究組，分別接受媒介物對照，順鉑，潘諾匹司他和組合療法。經(jīng)過約4 周的治療，與單一藥物相比，順鉑+潘諾匹司他組合對腫瘤進展的抑制作用更為明顯，在EOC-002中實現(xiàn)了癌癥消退，在EOC-004 中實現(xiàn)了穩(wěn)定的疾病。免疫組織化學染色顯示在潘諾匹司他存在下PAX8 表達減少，這與細胞增殖和存活不足有關。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，研究人員建議化學療法與HDAC 抑制劑聯(lián)用可能是有價值的治療選擇，能使以PAX8 依賴性為特征的EOC 患者產(chǎn)生強大而持久的益處。更重要的是，有研究表明[34]，通過CRISPR 基因組改變或以膠束包裹的硫鏈絲菌肽進行藥物治療，靶向PAX8 可降低腫瘤負擔。這些發(fā)現(xiàn)表明，PAX8 是卵巢腫瘤中一種統(tǒng)一的蛋白驅(qū)動轉(zhuǎn)移，可作為治療從FTE 和OSE 衍生的HGSC的有效藥物靶標。由于PAX8 在發(fā)展中的甲狀腺中起著至關重要的作用，但PAX8 缺失對成年甲狀腺的影響仍然未知。幸運的是，有FDA 批準的用于甲狀腺機能減退的激素替代療法，可以減輕PAX8 目標療法對甲狀腺上皮細胞的脫靶作用。

3 總結(jié)

由于PAX8 在卵巢癌細胞的遷移、侵襲和致瘤中的發(fā)揮重要作用，卵巢癌細胞系中PAX8的丟失在體內(nèi)和體外降低了腫瘤表型，并促進了細胞凋亡，因此，人們越來越有興趣評估PAX8，不僅將其作為診斷性生物標志物，而且還將其作為EOC的潛在治療靶標。在HGSC 中為新型癌癥治療確定藥物靶標一直是一項挑戰(zhàn)，因為它是一種異質(zhì)性疾病，幾乎沒有共同的突變。PAX 蛋白很有前景，因為PAX8 在漿液性腫瘤中普遍表達。靶向PAX8 蛋白質(zhì)可能在減少大多數(shù)患者的腫瘤生長和進展以及顯著提高患者生存率方面有希望。當務之急是進一步探索PAX8 在改變卵巢癌細胞與其腫瘤微環(huán)境相互作用中的特殊功能，因為該轉(zhuǎn)錄因子可能具有多種機制，這對于改善當前的治療方案可能至關重要。