曾祥標(biāo)，陳逸文，陳曉峰，劉仕軍，白志毅，2，李文娟，2

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.上海牧高生物科技有限公司，上海 201306)

在大力發(fā)展優(yōu)質(zhì)、綠色、生態(tài)的水產(chǎn)養(yǎng)殖背景下，水產(chǎn)養(yǎng)殖的污染處理問題已經(jīng)成為限制其發(fā)展的重要因素[1]。目前急需開發(fā)更多安全、清潔、高效的功能性產(chǎn)品，來(lái)緩解養(yǎng)殖水環(huán)境的壓力，并同時(shí)增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體免疫從而達(dá)到健康養(yǎng)殖的目的，這也是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究熱點(diǎn)之一[2]。葫蘆巴作為一種藥用植物，其種子含有豐富的甾體皂苷和生物堿[3]，能夠有效增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力[4]。用添加葫蘆巴籽提取物(fenugreek seed extract，F(xiàn)SE)的飼料喂養(yǎng)養(yǎng)殖動(dòng)物能調(diào)節(jié)其腸道微生物菌群，通過(guò)增加有益菌總量從而減少動(dòng)物糞便中氨氣、甲烷等有害氣體的排放[5]，而水體中有益菌的含量與水體中總磷的含量密切相關(guān)[6]，這為FSE在水體凈化的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但尚未有相關(guān)報(bào)道。

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)俗稱河蚌、珍珠蚌等，屬雙殼綱(Bivalvia)蚌科(Unionidae)帆蚌屬(Hyriosis)，喜歡在水質(zhì)清新的湖泊河流中生活[7]。三角帆蚌是我國(guó)生產(chǎn)淡水珍珠的主要育珠蚌，其珍珠產(chǎn)量占我國(guó)淡水珍珠的80%，占據(jù)重要的國(guó)際戰(zhàn)略及經(jīng)濟(jì)地位[8]。目前我國(guó)養(yǎng)殖三角帆蚌培育淡水珍珠的方式多為施有機(jī)肥進(jìn)行肥水養(yǎng)殖，這往往導(dǎo)致養(yǎng)殖水域水體的惡化，對(duì)三角帆蚌經(jīng)濟(jì)效益和機(jī)體健康產(chǎn)生了不利影響[9]。本實(shí)驗(yàn)研究了在養(yǎng)殖水體中添加FSE對(duì)水質(zhì)的作用和對(duì)三角帆蚌抗氧化活性的影響，旨為FSE在凈化養(yǎng)殖水體水質(zhì)和三角帆蚌健康養(yǎng)殖兩方面的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三角帆蚌采購(gòu)于上海濱海生產(chǎn)基地，選取大小均一、噴水有力、體質(zhì)健康的1齡蚌[長(zhǎng)寬高分別為：(5.96±0.24) cm；(1.31±0.03) cm；(3.19±0.19) cm，體重：(17.49±0.96) g]，飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室玻璃缸內(nèi)，以豆?jié){投喂并24 h不斷充氧。養(yǎng)殖水體來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室鯽魚養(yǎng)殖水。養(yǎng)殖全程投喂鯽魚配合飼料(通威股份有限公司)，每日早晚各投喂1次。FSE由上海牧高科技有限公司提供，成分分析見表1。

表1 FSE成分分析表

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采集1.1中的養(yǎng)殖水體，相同環(huán)境條件下，分別設(shè)5個(gè)FSE濃度處理組(0.02‰、0.04‰、0.06‰、0.08‰、0.10‰)和1個(gè)對(duì)照組(不添加FSE)，每組設(shè)3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中進(jìn)行，養(yǎng)殖水體為10 L，全過(guò)程保持充氧，不換水，后采集水體樣本分析其對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響。

根據(jù)FSE對(duì)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，選擇添加0.06‰濃度FSE進(jìn)行進(jìn)一步養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。同樣采集1.1中的養(yǎng)殖水體，以僅在該水體中放置三角帆蚌為對(duì)照組，以放置三角帆蚌并添加0.06‰濃度FSE為處理組，采集樣品，分析水質(zhì)指標(biāo)和三角帆蚌血清的抗氧化活性。其中，每組設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行放入10 L養(yǎng)殖水體和6只三角帆蚌。每個(gè)平行中取6個(gè)樣品作為生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)全程均在在玻璃缸(30 cm×30 cm×30 cm)中進(jìn)行且保持充氧，不換水。

1.3 樣品采集

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 水質(zhì)測(cè)定方法

1.4.2 三角帆蚌血清抗氧化活性測(cè)定方法

超氧化物歧化酶(SOD)和堿性磷酸酶(ALP)采用碧云天公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定，丙二醛(MDA)采用索萊寶公司試劑盒進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定方法均參照試劑盒說(shuō)明書。

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用單因素方差分析(One-way ANOVA)及Duncan法進(jìn)行多重比較，P<0.05時(shí)表示差異顯著。采用Excel和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖處理。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度FSE對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化效果

添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體pH的影響如圖1所示。在96 h時(shí)0.02‰濃度組pH顯著低于對(duì)照組，其它時(shí)間點(diǎn)無(wú)顯著性差異；而其它濃度組在24 h和48 h時(shí)pH顯著低于對(duì)照組，在72 h和96 h時(shí)無(wú)顯著性差異。

圖1 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中pH的影響

圖2 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中的影響

添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中NO2-N含量的影響如圖3所示。在72 h和96 h時(shí)，各濃度組NO2-N含量均顯著低于對(duì)照組；在24 h時(shí)，0.08‰和0.10‰濃度組的NO2-N含量顯著低于其他各濃度組；在48 h時(shí)，除0.02‰濃度組外，其余各濃度組的NO2-N含量均顯著低于對(duì)照組。

圖3 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中NO2-N的影響

添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中TN含量的影響如圖4所示。在24 h時(shí)，0.08‰濃度組TN含量顯著高于其它各濃度組。

圖4 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中TN的影響

添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中TP含量的影響如圖5所示。除在72 h時(shí)0.04‰濃度組與對(duì)照組的TP含量無(wú)顯著性差異，其余時(shí)間點(diǎn)各濃度組TP含量與對(duì)照組相比均有顯著性差異；0.08‰和0.10‰濃度組的TP含量始終顯著高于對(duì)照組，而0.02‰濃度組TP含量始終顯著低于對(duì)照組；在72 h和96 h時(shí)，0.06‰濃度組的TP含量最低。

圖5 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中TP的影響

添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中PO4-P含量的影響如圖6所示。在24 h和72 h時(shí)，0.08‰和0.10‰濃度組的PO4-P含量顯著低于其它各濃度組。且隨著時(shí)間的推進(jìn)，各組水體中PO4-P的含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。0.10‰濃度組在96 h時(shí)的PO4-P含量降至最低。

圖6 不同濃度FSE處理對(duì)養(yǎng)殖水體中PO4-P的影響

2.2 添加FSE對(duì)三角帆蚌養(yǎng)殖水體的凈化效果

在養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加0.06‰FSE時(shí)，對(duì)養(yǎng)殖水體中pH以及PO4-P含量有顯著影響，但對(duì)NO2-N含量無(wú)顯著影響。如圖7所示，在24 h時(shí)，處理組pH顯著低于對(duì)照組，其余時(shí)間均無(wú)顯著性差異。處理組PO4-P含量均低于對(duì)照組，且后者在48 h時(shí)的PO4-P含量較前者高出76.32%，差異顯著。對(duì)照組和處理組NO2-N含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，但二者之間無(wú)顯著性差異。

圖7 三角帆蚌養(yǎng)殖添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中pH、PO4-P、NO2-N的影響

圖8 三角帆蚌養(yǎng)殖添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體中的影響

2.3 養(yǎng)殖水體中添加FSE對(duì)三角帆蚌抗氧化酶活性的影響

養(yǎng)殖水體中添加FSE對(duì)三角帆蚌機(jī)體SOD活性以及MDA含量均有顯著影響，而對(duì)ALP活性無(wú)顯著影響。如圖9所示，對(duì)照組與處理組三角帆蚌SOD活性隨測(cè)定時(shí)間呈現(xiàn)不同的規(guī)律，對(duì)照組SOD活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，而處理組反之，且在48 h及96 h時(shí)，處理組SOD活性均顯著高于對(duì)照組；MDA含量測(cè)定結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，處理組MDA含量呈現(xiàn)持續(xù)下降趨勢(shì)，且在96 h時(shí)處理組MDA含量顯著低于對(duì)照組；對(duì)照組和處理組各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)及組間ALP活性均無(wú)顯著性差異。

圖9 添加FSE對(duì)三角帆蚌SOD活性、MDA含量、ALP活性的影響

3 討論

3.1 FSE對(duì)養(yǎng)殖水體的凈化作用

葫蘆巴是一種在我國(guó)廣泛生長(zhǎng)的植物，其種子提取物具有降血糖和血脂、抗氧化、抗菌、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫力等多種功效[11-12]。目前葫蘆巴作為飼料添加劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)業(yè)，具有廣闊的前景，但在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的研究較少，在水質(zhì)凈化方面的研究尚未報(bào)道。

漁業(yè)養(yǎng)殖水質(zhì)pH值一般控制在6.5～8.5之間，pH值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)抑制水中的微生物活動(dòng)，導(dǎo)致水體中有機(jī)物不易分解、自凈能力減弱[13]。本研究結(jié)果表明，添加高濃度FSE在72 h之內(nèi)有降低養(yǎng)殖水體pH的作用，在72 h和96 h時(shí)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異，初次添加FSE對(duì)養(yǎng)殖水體pH的作用時(shí)效為72 h左右。

氨氮作為水體最重要的環(huán)境污染因子之一，濃度過(guò)高時(shí)會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生很強(qiáng)的毒害作用[14]。研究表明絲蘭提取物可以顯著降低水體中的氨氮含量[15]，而本研究結(jié)果顯示FSE僅在24 h時(shí)顯著降低了養(yǎng)殖水體中的氨氮含量。水體中氨氮含量與FSE添加濃度和取樣時(shí)間均有密切聯(lián)系，二者對(duì)氨氮作用的差異可能是其成分不同所導(dǎo)致。絲蘭提取物含甾體皂苷類天然的表面活化劑、具有捕氨能力的多糖物質(zhì)以及對(duì)氨基具有強(qiáng)烈結(jié)合能力的多酚物質(zhì)，因此其具有很強(qiáng)的吸附作用[16]；而FSE主要成分為甾體皂苷、黃酮、葫蘆巴堿等物質(zhì)[17]，故二者對(duì)水中氨氮的吸收凈化能力有所不同。

水體中的亞硝酸鹽濃度過(guò)高會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生明顯的毒害作用[18]。本研究結(jié)果表明，在72 h和96 h時(shí)各濃度組亞硝酸鹽含量均顯著低于對(duì)照組，其原因可能是FSE增加了水體中的有益菌數(shù)量，改變了水中微生物的穩(wěn)態(tài)，從而降低了水體中亞硝酸鹽的含量，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。磷是水生生物生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，也是衡量水質(zhì)好壞的關(guān)鍵因子，水體中磷循環(huán)是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程[19]。本研究結(jié)果表明添加高濃度的FSE能降低養(yǎng)殖水體中的磷酸鹽含量卻使總磷含量上升，但已有研究[19]發(fā)現(xiàn)水體中磷酸鹽與總磷的變化趨勢(shì)總是相似，這與本研究結(jié)果并不一致，其原因可能是高濃度的FSE能與水體中游離的磷酸根發(fā)生反應(yīng)從而降低水中磷酸鹽含量，而FSE本身含磷元素，加入水中導(dǎo)致總磷含量上升。

3.2 添加FSE對(duì)三角帆蚌養(yǎng)殖水體的凈化效果

研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖水體的水質(zhì)是影響三角帆蚌生長(zhǎng)和機(jī)體健康的重要因素，養(yǎng)殖水體中磷含量過(guò)高時(shí)往往會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化從而不利于三角帆蚌生長(zhǎng)[20，21]。本研究結(jié)果表明向養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加FSE后總磷和磷酸鹽含量顯著下降，推測(cè)原因是FSE中的某些活性物質(zhì)能加強(qiáng)三角帆蚌對(duì)藻類的濾食作用，具體調(diào)控機(jī)理仍需進(jìn)一步研究。水體中總磷和磷酸鹽的變化趨勢(shì)分別為先降后升和先升后降，這與之前的報(bào)道并不類似，這可能與本研究所采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)。毛成責(zé)等[22]發(fā)現(xiàn)藻類總量的平均濃度與總磷呈顯著正相關(guān)，暗示總磷含量的升高可能與蚌自身附著的藻類生長(zhǎng)有關(guān)。本研究結(jié)果表明向養(yǎng)殖三角帆蚌水體中添加0.06‰濃度FSE并不影響亞硝酸鹽、總氮、氨氮含量，不會(huì)對(duì)水環(huán)境產(chǎn)生不良影響，為今后FSE在三角帆蚌健康養(yǎng)殖中的推廣奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

3.3 養(yǎng)殖水體中添加FSE對(duì)三角帆蚌抗氧化酶活性的影響

SOD對(duì)機(jī)體抗氧化活性以及免疫功能有重要調(diào)節(jié)作用，其活性的變化反映了機(jī)體抵制自由基損傷的能力[23]；MDA能反映機(jī)體潛在抗氧化能力，也能間接反映生物體細(xì)胞和組織過(guò)氧化后機(jī)體的損傷程度[24]；三角帆蚌缺乏特異性免疫反應(yīng)，大多依靠體液免疫因子來(lái)清除異物，ALP是體液免疫因子中常被用做衡量蚌免疫活力高低的參照指標(biāo)[25]。本研究選取以上指標(biāo)來(lái)反映0.06‰濃度FSE對(duì)三角帆蚌抗氧化活性的影響。全碧波[26]發(fā)現(xiàn)葫蘆巴提取物能顯著提高大鼠腎組織過(guò)氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性，從而增強(qiáng)其抗氧化能力以及免疫力，PRADEEP等[27]也證實(shí)葫蘆巴種子具有增強(qiáng)老鼠免疫力的功能，GUARDIOLA等[28]證實(shí)向金頭鯛投喂添加葫蘆巴的飼料可增強(qiáng)其免疫應(yīng)答。本研究也同樣表明FSE能增強(qiáng)三角帆蚌SOD活性，提高三角帆蚌機(jī)體的相關(guān)免疫功能，這與前人的研究結(jié)果相同。血清MDA含量越低，表明機(jī)體細(xì)胞受損傷程度較小[24]。在96 h時(shí)，處理組MDA含量顯著低于對(duì)照組。夏鑫等[29]發(fā)現(xiàn)喂食FSE后，斷奶豬仔的MDA含量顯著降低，其機(jī)體的抗氧化功能得到有效改善，張代等[30]發(fā)現(xiàn)肉雞食用含葫蘆巴的飼料后，MDA含量顯著下降，均與本研究結(jié)果類似，說(shuō)明添加FSE后三角帆蚌抗氧化能力有所增強(qiáng)。SUBRAMANIAN等[31]研究發(fā)現(xiàn)用添加葫蘆巴堿的飼料喂養(yǎng)大鼠后其ALP活性顯著降低，從而增強(qiáng)其抗炎及免疫能力，但本研究發(fā)現(xiàn)三角帆蚌養(yǎng)殖中添加FSE對(duì)蚌機(jī)體ALP活性并無(wú)顯著影響，可能是由于研究動(dòng)物自身種屬差異性所致。三角帆蚌是無(wú)脊椎動(dòng)物，為開放式循環(huán)系統(tǒng)，自身缺乏特異性免疫反應(yīng)，相比脊椎動(dòng)物更依賴于細(xì)胞防御[32]，但具體原因需要進(jìn)一步研究探討。