呼吸道張力收縮、漿液分泌的調(diào)控機制及柚皮苷在此過程中的調(diào)節(jié)作用*

師瑞，王永剛，李沛波，彭維，蘇薇薇

中山大學生命科學學院，廣東 廣州 510275

柚皮苷是本團隊研究開發(fā)的一類新藥，具有顯著的止咳、化痰、消炎作用，已實施科技成果轉(zhuǎn)化。我們的研究還證實：柚皮苷對煙熏所致的豚鼠慢性病理性咳嗽及卵白蛋白（OVA，ovalbumin）介導的豚鼠咳嗽變異性哮喘具有顯著作用，柚皮苷能顯著抑制大鼠氣道黏蛋白的合成與分泌以及氣道上皮杯狀細胞的增生。本文綜述了呼吸道平滑肌張力收縮調(diào)控機制、咳嗽變異性哮喘疾病及治療研究進展、呼吸道上皮漿液分泌調(diào)控機制，以及柚皮苷對呼吸道張力收縮及漿液分泌的調(diào)控機制研究進展，為其臨床應用提供思路與依據(jù)。

1 呼吸道平滑肌張力收縮調(diào)控機制

氣道直徑和氣流阻力與呼吸道平滑肌細胞的活性密切相關，平滑肌細胞可以通過抵抗外加負荷維持呼吸道容積的穩(wěn)定性，控制肺死腔的大小以協(xié)助肺部收縮，呼出氣體和異物，調(diào)整呼吸道直徑，并適應咳嗽［1］。

1.1 呼吸道平滑肌細胞收縮機制

呼吸道平滑肌細胞以“肌絲滑動”原理進行收縮，在收縮過程中平滑肌細胞胞內(nèi)Ca2+濃度是調(diào)控收縮的關鍵因素，它能和鈣調(diào)蛋白結(jié)合，進一步調(diào)控收縮過程［2-3］。胞內(nèi)Ca2+濃度的增加依賴于鈣庫中Ca2+的釋放以及胞外離子經(jīng)Ca2+通道的轉(zhuǎn)運［2］。質(zhì)膜受體被信號分子激活，經(jīng)G 蛋白偶聯(lián)受體調(diào)控IP3/DAG下游通路，激活鈣庫上Ca2+通道及蛋白激酶C（PKC），通過鈣庫中Ca2+釋放及PKC級聯(lián)反應升高胞內(nèi)Ca2+濃度；信號分子也可激活膜上離子通道，誘導動作電位產(chǎn)生，引起質(zhì)膜去極化，激活電壓門控Ca2+離子通道（VOCC，voltagegated calcium channel）等，引起胞外Ca2+內(nèi)流，升高胞內(nèi)Ca2+濃度，產(chǎn)生收縮效應［4］。

1.2 呼吸道平滑肌細胞舒張機制

平滑肌細胞的舒張方式可分為：上皮依賴和非上皮依賴。胞內(nèi)Ca2+濃度降低引起肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）失活，同時激活肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP），進一步導致平滑肌舒張。

1.2.1 上皮依賴研究發(fā)現(xiàn)上皮能夠緩解平滑肌收縮。上皮能夠釋放PGE2、NO 等上皮源舒張因子（EpDFR）調(diào)控平滑肌舒張［5-6］。上皮對平滑肌的舒張作用主要通過鳥苷酸（GMP）途徑，鳥苷酸環(huán)化酶（GC）分布于質(zhì)膜和胞質(zhì)中，NO 和硝基類物質(zhì)激活胞漿中的GC，心房利鈉肽（ANP）激活質(zhì)膜上的GC。通過上皮釋放的舒張因子激活GC，使之催化GTP 形成cGMP，進一步激活鉀離子通道引起質(zhì)膜超極化的同時促進Ca2+進入鈣庫降低其濃度，此外cGMP 依賴的激酶能夠改變MLCK、MLCP的活性達到舒張作用。

1.2.2 非上皮依賴呼吸道平滑肌細胞移除胞內(nèi)Ca2+的機制主要包括：cAMP 途徑和激活陽離子通道途徑。cAMP 途徑：信號分子引起胞內(nèi)cAMP 濃度增加，進一步活化蛋白激酶A（PKA），調(diào)控下游通路舒張平滑肌。這些影響主要包括：抑制磷酸肌醇水解為IP3；增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的Ca2+攝??；使MLCK 失活；激活細胞質(zhì)膜上的陽離子通道和轉(zhuǎn)運體引起膜超極化等。激活陽離子通道途徑：能使質(zhì)膜超極化，阻礙電壓門控鈣離子通道（VGCC）開放；激活鈉鉀泵（Na+/K+-ATPase），降低胞內(nèi)鈉離子，促進鈉鈣交換體（NCX）運作；調(diào)節(jié)并影響胞內(nèi)Ca2+的釋放［7］?？偟膩碚f，激活鉀離子通道使膜超極化和拮抗鈣通道阻止鈣內(nèi)流是主要的兩個舒張途徑［2，8］。

2 大電導鈣激活鉀離子通道介導的呼吸道平滑肌張力收縮調(diào)控作用

陽離子通道中鉀離子通道對平滑肌細胞電穩(wěn)定影響非常大，鉀離子通道（potassium ion channel）是指通透特異性僅允許K+通過質(zhì)膜的通道。當K+通道被激活后，引起K+外流，胞內(nèi)降低的K+濃度引起呼吸道平滑肌細胞超極化，阻礙電壓門控Ca2+通道，同時激活鈉鈣交換體運作降低胞內(nèi)鈉離子，促進Ca2+濃度降低，抑制氣道平滑肌收縮，進而促進呼吸道平滑肌舒張，降低氣道組織張力。

大電導鉀離子通道（BK）和ATP 敏感鉀離子通道（KATP）是機體中起主要作用的兩類K+通道。BK 被胞內(nèi)信使cAMP、cGMP 和鈣升高所激活，被蝎毒素（IbTX）所抑制［7，9］；ATP 敏感的K+通道被胞內(nèi)ATP 的降低所激活，被磺脲類藥物如格列本脲（Glibenclamide）所抑制［10-11］。

大電導鈣激活鉀離子通道（BKCa，largeconductance Ca2+-activated K+channel）中K+轉(zhuǎn)運孔道由4個相同的α 亞基組成［12］，同時還有一個β 亞基調(diào)控通道活性。每個α 亞基由7 個跨膜片段（S0～S6）組成［13-14］，其中S1～S6 片段與其他電壓門控鉀離子通道的S1～S6 片段類似；S5、S6 片段形成選擇性通透K+的孔道；S4 片段存在電壓敏感區(qū)域，通過其中的一系列帶電殘基感測跨膜電壓；相對獨立的S0 片段為通道提供胞外的N 末端［13-16］，并與β1 亞基形成重要的相互作用［17-21］。每個通道α亞基的剩余部分由一對串聯(lián)的K+電導調(diào)節(jié)器片段組成，該結(jié)構(gòu)域形成通道的胞質(zhì)Ca2+傳感器［22-25］。平滑肌細胞BK 通道共表達β1 亞基，有助于增強表觀Ca2+敏感性［26-32］。

BKCa能夠被胞內(nèi)Ca2+濃度和質(zhì)膜去極化協(xié)同激活，產(chǎn)生外向K+大電流使得細胞膜快速超極化，進而恢復膜電位穩(wěn)定［33-35］。BKCa在細胞生理學功能中起著連接胞質(zhì)鈣離子信號和質(zhì)膜電信號的作用，其結(jié)構(gòu)功能的異常會引起多種疾病［27，36-42］。

3 咳嗽變異性哮喘疾病及治療研究進展

隨著臨床研究的深入，發(fā)現(xiàn)很多呼吸系統(tǒng)疾病都與平滑肌細胞結(jié)構(gòu)功能改變相關。從收縮表型，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋?、合成和分泌型，通過細胞結(jié)構(gòu)的改變對呼吸功能產(chǎn)生嚴重影響。由于病毒細菌的侵入，產(chǎn)生呼吸道損傷，平滑肌自我修復功能增強，凋亡減少數(shù)目增多引起收縮張力增強，產(chǎn)生呼吸道平滑肌強直收縮，表現(xiàn)為哮喘、呼吸窘迫等癥狀。此外平滑肌收縮蛋白及激酶表達發(fā)生變化，對外界刺激產(chǎn)生的收縮反應更敏感，因此很弱的刺激都能引發(fā)呼吸道明顯的收縮現(xiàn)象，表現(xiàn)為咳嗽等癥狀。從細胞結(jié)構(gòu)和功能上表現(xiàn)為骨架蛋白和收縮蛋白結(jié)構(gòu)的重排、K+通道活性的降低以及Ca2+通道活性的增強，引起細胞收縮張力的增加以及興奮閾值的降低，從而產(chǎn)生高強直收縮及氣道高反應性等異常收縮特性，以此產(chǎn)生更早更強烈的收縮反應同時對抗生理舒張物質(zhì)的調(diào)控，表現(xiàn)為咳嗽敏感性增加、哮喘等癥狀。

咳嗽變異性哮喘（CVA，cough variant asthma）是一種變異形式的哮喘，強烈刺激性干咳是其唯一臨床表現(xiàn)，一般持續(xù)6～8 周，30%～40%的患者可能發(fā)展為典型哮喘［43-46］。CVA 患者雖然沒有氣喘、氣促等癥狀，但表現(xiàn)出氣道高反應性，并對舒張呼吸道平滑肌的支氣管擴張劑表現(xiàn)出顯著反應［47-51］。靶向作用于呼吸道平滑肌的支氣管擴張劑是目前臨床治療CVA 常用的有效策略，通過舒張平滑肌，調(diào)節(jié)呼吸道張力，起到治療的作用。對呼吸道平滑肌具有舒張作用的藥物對CVA 疾病均有一定的治療效果［47，50］。因為BKCa通道可以介導較大的外向K+電流，引起呼吸道平滑肌超極化，舒張平滑?。?2-53］，因此BKCa通道是調(diào)節(jié)支氣管舒張過程中常用的藥物靶點［7］。針對于支氣管收縮異常，最常見的治療方法是激活BKCa通道。

近年來，開發(fā)小分子靶點支氣管擴張劑的研究正在興起，天然產(chǎn)物作為豐富的化合物資源庫，是CVA治療的有效策略，其研究廣受關注。

4 呼吸道上皮漿液分泌調(diào)控機制

覆蓋在呼吸道表面具有黏附功能的呼吸道表面液體（ASL，airway surface liquid）在機體防御功能中發(fā)揮重要作用。ASL 分為黏液層（ML，mucus layer）和纖毛周液層（PCL，periciliary fluid layer），具有黏性的ML 覆蓋在與上皮細胞接觸的PCL上［54］。ML 約厚5～10 μm，含有大量的水、鹽、黏膜下腺體及杯狀細胞分泌的黏蛋白等物質(zhì)，具有一定黏彈性，能夠捕捉吸入的異物，黏蛋白含量決定了ASL的黏稠度。同時ML中含有大量防御素能夠抑制細菌增長，保護機體。PCL 由呼吸道上皮細胞和黏膜下腺體分泌，因含水量較高而具有較ML低的黏度，因此具有流動性，是纖毛清除呼吸道塵埃和細菌的介質(zhì)。PCL 約厚6 μm，高度與纖毛一致，纖毛穿過PCL 后尖端接觸到黏液層，通過定向擺動能夠有效地帶動ML流動，排出黏附的粉塵細菌等異物。ASL 的深度、成分和黏度是纖毛清除、殺菌活性、上皮細胞和免疫細胞功能的重要決定因素［54］。

按照分泌部位和黏蛋白含量的不同，在臨床上又將氣道分泌液分為漿液和黏液，對應ASL，漿液即為PCL 由上皮細胞和黏膜下腺體分泌，黏液即為ML由杯狀細胞及腺體分泌。黏膜下腺體中的漿液細胞處于腺泡結(jié)構(gòu)最遠端，能夠分泌Cl-和，引起漿液分泌增加，分泌的漿液是黏液流動排出的載體。在漿液分泌過程中離子轉(zhuǎn)運所引起的滲透壓改變起著至關重要的作用，其中Cl-占主要地位，通過離子轉(zhuǎn)運體將胞內(nèi)離子定向排出到細胞頂膜面引起滲透壓梯度改變，從而引起水分通過細胞旁路以及水通道蛋白（AQPs）發(fā)生自滲透壓低濃度向高濃度的定向擴散，完成漿液分泌過程。由此可知，Cl-通道和AQPs對呼吸道漿液分泌起重要地位，由于Cl-濃度的改變才能引起水分經(jīng)AQPs 的轉(zhuǎn)運，因此Cl-通道的活性及表達對于漿液分泌來說占主導地位。

5 囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白介導的呼吸道上皮漿液分泌調(diào)控作用

離子通道、轉(zhuǎn)運蛋白以及質(zhì)子泵位于上皮細胞頂膜面和基底膜面上，共同決定了電解質(zhì)的吸收和分泌以及上皮細胞分泌的液體體積。Cl-分泌吸收對于呼吸道漿液調(diào)控起著關鍵作用，呼吸道上皮細胞存在Cl-的雙向流動，細胞間Cl-通透性較大，頂膜面分布著囊性纖維化跨膜傳導調(diào)節(jié)蛋白（CFTR，cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）和Ca2+激活Cl-通道（CaCC，Ca2+-activated Cl-channel），基底膜主要由鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運體（NKCC，sodium potassium chloride cotransporter）組成。NKCC 將Cl-經(jīng)基底膜轉(zhuǎn)運入胞內(nèi)，引起胞內(nèi)Cl-濃度增加，Cl-順濃度梯度擴散至頂膜面，經(jīng)頂膜面CFTR 及CaCC 排出細胞，完成Cl-定向跨膜分泌過程。此時基底膜面的Na+經(jīng)鈉鉀泵（Na+/K+-ATPase）轉(zhuǎn)運排出胞外，以維持胞內(nèi)Na+低濃度，為底膜Cl-吸收提供能量。K+經(jīng)基底膜面K+通道排出胞外，建立了電化學梯度，為Cl-從頂膜排出提供動力。頂膜面分泌的Cl-增加引起滲透壓梯度改變，從而引起水分通過細胞旁路以及AQPs 發(fā)生自滲透壓低濃度向高濃度的定向擴散，完成漿液分泌過程［55］。

呼吸道上皮細胞頂膜面CFTR 是Cl-分泌的主要通路，是電解質(zhì)轉(zhuǎn)運和液體分泌的關鍵通道［56］。CFTR 主要表達在黏膜下腺的漿液細胞頂膜面，由1 480個氨基酸組成，共形成5個區(qū)域，包括2個跨膜區(qū)，其中各區(qū)由6 個跨膜段組成［57］。CFTR 能夠被cAMP 依賴的PKA 的共價修飾，使得功能活化，具有分泌Cl-的功能和對上皮鈉離子通道（ENaC，epithelial sodium channel）活性的調(diào)控功能。同時，CFTR 508位絲氨酸的磷酸化程度能夠調(diào)控其活性，決定分泌效率。PKA 能夠?qū)FTR 中508 位的絲氨酸磷酸化，進而調(diào)控CFTR 活性。胞內(nèi)cAMP 濃度增加可以激活PKA，而cAMP 濃度降低后CFTR 隨即失活，因此胞內(nèi)cAMP 濃度是調(diào)控CFTR 功能的重要靶點。腺苷酸環(huán)化酶（AC，adenylate cyclase）能夠增加cAMP 合成，提高其濃度；磷酸二酯酶（PDE，phosphodiesterase） 能夠降解胞內(nèi)cAMP，降低其濃度。因此藥物能夠調(diào)節(jié)AC 或是PDE的活性就能調(diào)控CFTR 功能，影響呼吸道漿液分泌。此外，在一些種屬中，cAMP 濃度的增加可以促進含有CFTR 的囊泡與細胞膜結(jié)合，提高膜蛋白表達，增加通道密度，增大分泌量。合成的CFTR 與其他膜蛋白類似，能夠由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過囊泡分泌結(jié)合到細胞頂膜面，又能夠在某些刺激時由頂膜面脫落結(jié)合至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或經(jīng)溶酶體降解。因此對于CFTR，從cAMP 濃度依賴的功能上，還是從蛋白表達結(jié)合上，都能多角度調(diào)節(jié)上皮細胞頂膜面Cl-分泌，影響漿液分泌。

6 脂多糖及PM2.5對呼吸道漿液分泌的影響

呼吸道漿液分泌異常是臨床呼吸系統(tǒng)發(fā)病率增加、病程加劇的主要誘因。其分泌功能異常會導致痰液分泌增加，產(chǎn)生咽炎、肺炎及肺癌等疾病。當漿液分泌減少時，纖毛運動受阻，黏液無法排出，痰液分泌增加積累在氣道，其中黏附的細菌微生物不斷增殖，引起組織炎癥，加重呼吸道疾病癥狀，進而引起肺炎等疾病，長期發(fā)展容易造成肺癌，危及人體健康。同時誘發(fā)的各種炎癥因子、污染物粉塵顆粒、細菌病毒等又會刺激上皮細胞，降低某些離子轉(zhuǎn)運體功能，抑制轉(zhuǎn)錄表達，或是增加受體敏感性，進一步抑制漿液分泌，從多角度損傷呼吸系統(tǒng)生理功能。研究表明多種外界刺激［58-59］可抑制呼吸道上皮細胞CFTR與AQPs表達，不僅能夠抑制mRNA 轉(zhuǎn)錄，降低蛋白翻譯，還能誘導已結(jié)合的CFTR 從質(zhì)膜上脫落，減少膜蛋白結(jié)合數(shù)量，從而減弱細胞滲透性，降低漿液分泌體積，影響呼吸系統(tǒng)正常生理功能。在CFTR mRNA 表達過程中，調(diào)控受多種因素影響，如miR-138 （一種microRNA） 的豐度［60］，NF-κB 的 激 活［61］，經(jīng)JAK/STAT 通 路 而 激 活 的JAK2［62］以及血管升壓素（vasopressin）的活性［63］等。Akt是CFTR 合成中信號轉(zhuǎn)導的關鍵介質(zhì)［64-65］，脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）可以結(jié)合Toll 樣受體4（TLR4，Toll-like receptor 4）并磷酸化Akt來激活phosphoinositide3-kinase（PI3K）-Akt 通路，從而導致CFTR 表達下調(diào)［66-67］。針對于此，LY294002（a PI3K/Akt 抑制劑）可以消除這種影響［67］。此外，CFTR表達異常被認為是一種廣泛存在于白種人中的遺傳性疾病——囊性纖維化疾?。–F，cystic fibrosis）的主要原因［68］。雖然頂膜面的CaCC 能夠一定程度地補償CFTR 缺失造成的損傷，在CF疾病中CaCC活性上調(diào)，能夠彌補CFTR介導的Cl-分泌，但是這種輕度外線整流Cl-通道與CFTR相比作用仍顯得很弱。因此對于CFTR來說，功能或是表達的損傷對呼吸道漿液分泌都會產(chǎn)生嚴重影響。

6.1 脂多糖的影響

脂多糖（LPS，lipopolysaccharide）是存在于革蘭氏陰性細菌細胞壁中的有毒物質(zhì)。在呼吸系統(tǒng)中，LPS 能夠誘導炎性介質(zhì)分泌并激活炎癥通路，產(chǎn)生組織炎癥［69］；同時活化MAPKs信號通路，誘導黏蛋白分泌增加，引起痰液黏稠，影響痰液排出［70］。此外，LPS 還可以結(jié)合TLR4并通過磷酸化Akt 激活phosphoinositide3-kinase（PI3K）-Akt 通路，從而導致CFTR 表達下調(diào)［66-67］，使得呼吸道漿液分泌減少，纖毛擺動受阻，加重組織炎癥反應?？梢钥闯?，LPS不僅能夠增加黏蛋白分泌，還能減少CFTR 表達，從黏液分泌和漿液分泌兩個角度影響呼吸道分泌功能，產(chǎn)生痰液增多及炎癥等病癥。

6.2 PM2.5的影響

細顆粒物（PM2.5）是評價大氣污染的重要標志，它與呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率及死亡率密切相關［71-74］。通過評估PM2.5暴露所引起的相對風險，發(fā)現(xiàn)PM2.5更容易引起成人局部缺血性心臟病、慢性阻塞性肺病、肺癌及中風；而對于5歲以下的兒童而言，急性下呼吸道感染的風險則會更高［74-76］。Global Burden of Disease 的研究認為，僅在2010 年全球就有超過300 萬人因PM2.5所引起的各種疾病而過早死亡［77］。在中國，PM2.5每年會引起120 萬人死亡，PM2.5污染是造成死亡的第四大危險因素，超過55 歲后慢性呼吸系統(tǒng)疾病致死率會隨著年齡的增長而越來越高［78］。呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率隨著PM2.5污染的加重而逐年增加，故研究抗PM2.5所致肺損傷的治療藥物及其作用機制，很有必要。

PM2.5粒徑微小，能夠通過損傷呼吸道黏膜上皮細胞，沉積在肺泡內(nèi)或肺間質(zhì)內(nèi)，激活肺內(nèi)的免疫細胞，引起氣道炎性反應、氧化損傷、肺泡上皮細胞DNA 損傷、周期阻滯及細胞凋亡，最終造成肺損傷［79-88］。近期研究表明：①PM2.5通過影響TRPA1 和TRPV1 表達，上調(diào)小鼠OVA 敏感性，增加氣道阻力和肺順應性，惡化哮喘發(fā)病癥狀［89］；②PM2.5能夠上調(diào)黏蛋白MUC4 與MUC5AC 表達，增加漿液分泌黏性［90-91］；③PM2.5能夠通過激活TLR4/MyD88通路及NLRP3炎癥小體誘導IL-1β分泌，并在升高肺組織巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸細胞活化趨化因子、IL-5 水平的同時，增加小鼠肺泡灌洗液及血液中IL-6和TNFα水平，引起呼吸系統(tǒng)及全身炎癥反應［92-94］；④PM2.5能夠在升高肺組織LDH 及ROS 的同時降低肺上皮細胞CAT 與SOD 活性，并引起細胞自噬，產(chǎn)生組織氧化損傷［95-96］?？梢钥闯?，PM2.5對肺的損傷是多方面的，既影響肺功能，又影響呼吸道漿液及黏液分泌，還會引起組織炎癥及氧化損傷。

7 柚皮苷的藥理研究進展

7.1 柚皮苷的鎮(zhèn)咳、祛痰、消炎作用

7.1.1 鎮(zhèn)咳作用方面柚皮苷的鎮(zhèn)咳機制與KATP 開放、C 纖維和P 物質(zhì)釋放無關，而是通過抑制RARs放電進而產(chǎn)生外周性鎮(zhèn)咳；柚皮苷能夠顯著抑制煙熏所致豚鼠慢性病理性咳嗽及OVA 介導的豚鼠CVA疾病［97-99］。

7.1.2 祛痰作用方面柚皮苷對痰液中的黏液成分與漿液成分均具有調(diào)節(jié)作用。一方面，能顯著抑制LPS 和EGF 誘導的氣道黏蛋白的合成、分泌以及氣道上皮杯狀細胞的增生；另一方面，它能通過活化氣道上皮細胞基頂膜CFTR 的表達與功能，促進Cl-分泌到氣道腔，進而通過滲透壓活化AQPs 促進氣道內(nèi)漿液分泌，同時上調(diào)LPS 抑制的AQP1與AQP5表達［100-102］。

7.1.3 消炎作用方面柚皮苷對LPS 誘導的急性肺部炎癥、CS 暴露誘導的慢性氣道炎癥均具有很好的抑制作用，不僅對LPS 誘導的急性肺損傷小鼠急性氣道炎癥有顯著抑制效果，還可以顯著抑制煙熏誘導的COPD大鼠及豚鼠慢性氣道炎癥、黏液高分泌、咳嗽高反應性及氣道高反應性等COPD典型癥狀，并且其對慢性氣道炎癥的抑制作用與氣道中促炎癥消退介質(zhì)LXA4含量呈正相關；一方面，柚皮苷顯著抑制BALF 中促炎因子IL-8 水平、減少中性粒細胞浸潤，同時抑制抗炎因子IL-10 的降低，促進ALX 受體表達；另一方面，柚皮苷具有一定促進炎癥消退的作用，可以通過調(diào)控NO 釋放和同型半胱氨酸代謝促進炎癥消退，在此過程中Arg1、Bhmt、Gnmt等可能是藥物抗炎的作用靶點［98-99，103-108］。

7.2 柚皮苷主要代謝產(chǎn)物柚皮素對呼吸道張力收縮及漿液分泌的調(diào)控機制研究進展

7.2.1 在呼吸道張力收縮調(diào)控方面柚皮苷在體內(nèi)代謝為柚皮素，能激活大鼠結(jié)腸平滑肌BKCa通道，引起細胞膜超極化，減少Ca2+內(nèi)流，從而對大鼠結(jié)腸平滑肌產(chǎn)生舒張效應［109］。同樣的，柚皮素能夠劑量依賴地激活血管平滑肌細胞BKCa通道，產(chǎn)生舒張血管的作用，柚皮苷與其作用一致，但是舒張效果較弱［110］。此外，柚皮素還能增加HEK293T細胞中BKCa通道活性［111］。以上結(jié)果可以提示柚皮苷和柚皮素可能通過調(diào)控呼吸道平滑肌BKCa通道介導的超極化狀態(tài)，調(diào)節(jié)呼吸道平滑肌收縮，產(chǎn)生舒張作用。然而目前沒有針對呼吸道平滑肌研究柚皮苷對BKCa通道的調(diào)控作用，鑒于不同部位組織結(jié)構(gòu)功能差異，此研究十分必要。

我們構(gòu)建了CCh 和KCl 誘導的體外呼吸道張力收縮異常疾病病理模型，考察了柚皮素對呼吸道張力和平滑肌胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。柚皮素主要通過激活BKCa通道直接舒張呼吸道平滑肌，引起平滑肌細胞膜超極化，降低胞內(nèi)Ca2+濃度，產(chǎn)生呼吸道舒張作用。這一研究結(jié)果科學闡釋了柚皮素對呼吸道平滑肌張力變化的調(diào)控作用及機制，為柚皮素在呼吸系統(tǒng)疾病CVA 中的臨床應用提供了實驗數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

因柚皮素能夠抑制CVA 豚鼠咳嗽次數(shù)及氣道高反應性，提示柚皮素對呼吸道平滑肌具有調(diào)控作用，能夠降低呼吸道張力，舒張呼吸道平滑肌。我們從組織與細胞兩個層面分別考察柚皮素對呼吸道平滑肌張力變化的影響。在考察對組織張力收縮的調(diào)控作用時，使用CCh 誘導呼吸道張力收縮模型，通過去除上皮，使用離子通道抑制劑等方法，篩選了柚皮素對呼吸道平滑肌的作用通路；在考察對胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控作用時，分別使用CCh 及高濃度KCl 誘導胞內(nèi)Ca2+濃度升高模型，通過離子通道抑制劑對組織舒張實驗結(jié)果進行驗證，從細胞層面揭示藥物舒張作用機制。

在采用CCh 誘導呼吸道張力收縮模型研究柚皮素對組織張力收縮的調(diào)控作用時，使用肌張力測定系統(tǒng)檢測急性分離的呼吸道組織張力變化。研究結(jié)果表明：柚皮素能夠劑量依賴性地降低CCh 誘導的呼吸道張力增加，恢復組織舒張狀態(tài)；柚皮素引起的呼吸道舒張作用不受上皮調(diào)控，直接作用于呼吸道平滑肌，是一種非上皮依賴的舒張效應；柚皮素產(chǎn)生的舒張作用主要由BKCa通道介導，通過激活BKCa通道引起平滑肌細胞膜超極化，產(chǎn)生舒張效應。

在采用CCh及高濃度KCl誘導胞內(nèi)Ca2+濃度升高模型研究柚皮素對胞內(nèi)Ca2+濃度的調(diào)控作用時，使用實時定量Ca2+成像系統(tǒng)檢測原代培養(yǎng)呼吸道平滑肌細胞胞內(nèi)Ca2+濃度變化。研究結(jié)果表明：柚皮素能夠降低CCh及高濃度KCl誘導的胞內(nèi)Ca2+濃度升高，恢復胞內(nèi)Ca2+濃度水平；柚皮素產(chǎn)生的Ca2+濃度調(diào)控作用受BKCa通道影響；柚皮素主要通過激活BKCa通道開放，引起K+外流，胞內(nèi)降低的K+濃度引起呼吸道平滑肌細胞超極化，阻礙電壓門控Ca2+通道，激活鈉鈣交換體運作，促進Ca2+濃度降低，抑制氣道平滑肌收縮，進而促進呼吸道平滑肌舒張，降低氣道組織張力。

以上研究結(jié)果系統(tǒng)解釋了柚皮苷調(diào)節(jié)呼吸道平滑肌張力的作用與機制，為其在臨床CVA 疾病治療中的應用提供了實驗數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。

7.2.2 在呼吸道漿液分泌調(diào)控方面柚皮苷能顯著抑制LPS 和EGF 誘導的氣道黏蛋白的合成與分泌以及氣道上皮杯狀細胞的增生，調(diào)控痰液黏稠度。然而柚皮苷對呼吸道漿液分泌的調(diào)控作用還是一個空白，目前沒有研究從CFTR 功能、表達，以及AQPs 表達的角度分析柚皮苷祛痰的藥理活性，我們考察了柚皮苷/柚皮素對上皮漿液分泌的調(diào)控作用，為揭示柚皮苷祛痰的藥理活性及其臨床研究與應用提供理論依據(jù)。

我們構(gòu)建了LPS 與PM2.5誘導的體內(nèi)、外呼吸道漿液分泌異常疾病病理模型，考察了柚皮素對呼吸道漿液分泌離子轉(zhuǎn)運和通道表達的影響。結(jié)果表明柚皮素能通過增加胞內(nèi)cAMP 濃度，激活CFTR 通道，引起Cl-定向轉(zhuǎn)運，促進水分轉(zhuǎn)運漿液分泌，恢復LPS 和PM2.5損傷的呼吸道CFTR、AQP1、AQP5 表達，降低溶菌酶及蛋白質(zhì)濃度，改善漿液黏稠度，同時調(diào)節(jié)LPS 與PM2.5所致的漿液分泌異常。這一研究結(jié)果科學闡釋了柚皮苷對呼吸道上皮漿液分泌的調(diào)控作用及機制，為其在呼吸系統(tǒng)疾病中的應用提供了依據(jù)。

祛痰作用包括對黏液分泌調(diào)控和漿液分泌調(diào)控兩個方面，本團隊前期已證實柚皮苷能顯著抑制LPS 和EGF 誘導的氣道黏蛋白的合成與分泌以及氣道上皮杯狀細胞的增生，但柚皮苷對漿液分泌的調(diào)控機制還是一個空白點。我們從動物、組織與細胞3 個層面分別考察柚皮苷/柚皮素對呼吸道漿液分泌的影響。在考察對呼吸道上皮Cl-轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用時，采用急性分離大鼠呼吸道組織，通過短路電流技術，使用離子通道抑制劑等方法，篩選了藥物對呼吸道上皮Cl-轉(zhuǎn)運的作用通路，驗證了藥物調(diào)控機制；在考察藥物對LPS 與PM2.5誘導的體內(nèi)、外呼吸系統(tǒng)疾病的影響時，分別使用LPS 與PM2.5誘導漿液分泌異常模型，通過氣液分界培養(yǎng)，分泌漿液檢查等分子生物學檢測技術，研究了藥物對LPS 與PM2.5誘導漿液分泌異常的調(diào)控作用。

在采用急性分離的大鼠呼吸道組織研究柚皮素對呼吸道離子轉(zhuǎn)運的調(diào)控作用時，使用短路電流及Elisa 技術檢測呼吸道組織Cl-轉(zhuǎn)運及cAMP 濃度變化。研究結(jié)果表明：柚皮素能夠增加呼吸道上皮細胞胞內(nèi)cAMP 濃度，激活頂膜面CFTR 通道，引起Cl-分泌，基底膜面NKCC 和K+通道參與調(diào)控此過程；通過基底膜面NKCC 吸收及頂膜面CFTR 分泌定向轉(zhuǎn)運Cl-，柚皮素能夠增加Cl-跨上皮分泌，促進水分轉(zhuǎn)運漿液分泌。

在采用LPS 及PM2.5誘導呼吸道上皮細胞漿液分泌異常模型研究柚皮素對離子漿液轉(zhuǎn)運分泌功能及通道表達的影響時，使用氣液分界培養(yǎng)、qRT-PCR 及Elisa 技術，檢測呼吸道上皮細胞漿液分泌Na+、Cl-、溶菌酶、蛋白質(zhì)濃度，胞內(nèi)cAMP濃度以及CFTR、AQP1 與AQP5 基因表達的變化。研究結(jié)果表明：LPS及PM2.5可誘導呼吸道上皮細胞漿液分泌異常；柚皮素增加呼吸道漿液分泌，在激活CFTR功能的同時降低LPS及PM2.5誘導的溶菌酶及蛋白質(zhì)高分泌，增加Na+、Cl-分泌，且升高細胞受LPS 及PM2.5誘導所致的CFTR、AQP1 與AQP5 mRNA 及蛋白低表達；柚皮素具有改善LPS 及PM2.5誘導的呼吸道上皮細胞漿液分泌異常的作用。

在采用PM2.5誘導BALB/c 小鼠肺水腫模型研究柚皮苷對PM2.5致小鼠呼吸道漿液分泌異常的影響時，使用小鼠肺組織滴注、組織干濕重測定、qRT-PCR 及Elisa 技術，檢測肺組織干濕重比、黏蛋白與總蛋白分泌量以及肺組織CFTR、AQP1 與AQP5基因表達的變化。研究結(jié)果表明：PM2.5能夠誘導小鼠肺損傷，產(chǎn)生肺水腫；柚皮苷能夠減弱PM2.5誘導的小鼠肺水腫，降低總蛋白分泌，改善漿液黏度。

總之，上述研究填補了國內(nèi)外柚皮苷相關作用機制的研究空白，為臨床應用提供了理論和實驗依據(jù)，為創(chuàng)新藥物的研發(fā)提供了思路。