王豪杰，李旭妮，彭小兵，馮 妍，張 賀，朱良全

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

乳制品已成為人民日常生活不可或缺的主要食品，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展與奶牛養(yǎng)殖業(yè)密不可分。奶牛乳房炎(bovine mastitis，BM)是嚴(yán)重危害奶牛養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病之一[1]，其診斷技術(shù)水平直接反映國(guó)家畜牧業(yè)發(fā)展水平和科技實(shí)力。本文主要論述了不同診斷方法的優(yōu)缺點(diǎn)，并思考了如何將診斷技術(shù)更好地應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，以期為防治該病和開發(fā)診斷新技術(shù)提供參考。

1 奶牛乳房炎概況

1.1 流行現(xiàn)狀及危害

奶牛乳房炎又稱奶牛乳腺炎，是乳腺受到物理、化學(xué)、致病微生物以及其他因素所引起的一種炎性變化，主要表現(xiàn)為乳汁理化性質(zhì)改變、體細(xì)胞數(shù)變化以及乳腺組織病理學(xué)變化。據(jù)報(bào)道，全世界每年因乳房炎經(jīng)濟(jì)損失達(dá)350億美元，僅美國(guó)奶業(yè)損失每年可達(dá)20多億美元，在我國(guó)奶牛乳房炎發(fā)病率約為46%～70%[2]。其危害主要體現(xiàn)在以下幾方面：(1)可致泌乳量降低10%～15%及乳質(zhì)量變差，治療不當(dāng)可致終身不產(chǎn)乳[3]。(2)影響繁殖性能且導(dǎo)致奶牛淘汰率達(dá)9%～10%[4]。(3)病牛乳汁含有非乳源性雜質(zhì)或治療的抗生素等藥物殘留，影響食品安全。

1.2 分類及發(fā)病機(jī)制

根據(jù)乳汁肉眼可見變化，可分為臨床型乳房炎(clinical mastitis，CM)、隱性乳房炎(subclinical mastitis，SM)和慢性乳房炎。根據(jù)發(fā)病特點(diǎn)和病理變化又分為漿液性乳房炎、卡他性乳房炎、纖維蛋性乳房炎、出血性乳房炎、化膿性乳房炎、壞疸性乳房炎。

乳房炎發(fā)生主要包括3個(gè)時(shí)期[5]：(1)因各種不良因素，致使病原菌從乳頭口入侵乳頭管；(2)病原菌侵入乳腺組織后，在乳房?jī)?nèi)繁殖進(jìn)而導(dǎo)致重復(fù)感染；(3)乳腺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)。

2 奶牛乳房炎診斷技術(shù)

2.1 病原菌分離

病原菌分離常被認(rèn)為是傳統(tǒng)診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，分離培養(yǎng)出的病原菌對(duì)于抗生素選擇使用有許多優(yōu)勢(shì)。但該方法對(duì)隱性乳房炎鑒定準(zhǔn)確性低、耗時(shí)長(zhǎng)、變異性較大，易出現(xiàn)假陰性。

2.2 體細(xì)胞計(jì)數(shù)法

體細(xì)胞計(jì)數(shù)法有直接和間接計(jì)數(shù)法兩種。直接計(jì)數(shù)法主要用儀器進(jìn)行測(cè)定，如利拉伐細(xì)胞計(jì)數(shù)器、Fossomatic 細(xì)胞計(jì)數(shù)器等簡(jiǎn)單準(zhǔn)確，可自動(dòng)地分析大量樣本。但花費(fèi)高，使用不普遍。

間接計(jì)數(shù)法主要是破壞乳汁中體細(xì)胞，使其釋放核酸物質(zhì)，進(jìn)一步反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生沉淀或凝膠。研究表明，乳汁體細(xì)胞數(shù)低于2×105個(gè)/mL為陰性，在2×105個(gè)/mL～5×105個(gè)/mL之間為可疑，大于或等于5×105個(gè)/mL則判定為隱性乳房炎[6]?；诖嗽?，常用的有美國(guó)加州乳房炎診斷試劑(CMT)，但其準(zhǔn)確度(87.4%～90.8%)較低。在我國(guó)也有蘭州(LMT)、北京(BMT)和杭州(HMT)等診斷試劑。該方法較為費(fèi)力且不適合初乳期和泌乳后期，在大型奶牛場(chǎng)中可作為輔助診斷。

2.3 分子生物學(xué)診斷

分子生物學(xué)技術(shù)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和多重實(shí)時(shí)PCR等，可檢測(cè)引起亞臨床乳房炎的病原體或其遺傳物質(zhì)。PCR一般以16S～23S rRNA間隔保守區(qū)為擴(kuò)增序列。希尼尼根等[7]建立了可同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、牛支原體的多重PCR方法，該方法敏感性分別為10 pg/μL、1 pg/μL和10 pg/μL。

LAMP具有鈣黃綠素介導(dǎo)的量熱無線檢測(cè)系統(tǒng)，可在65 min內(nèi)有效檢測(cè)病原體，更適用于金黃色葡萄球菌快速檢測(cè)[8]。Kawai等[9]選擇引起乳房炎的12個(gè)屬的病原微生物，利用32個(gè)引物以及能同時(shí)檢測(cè)所有病原的DNA芯片，通過LAMP優(yōu)化DNA擴(kuò)增條件，與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果相比，當(dāng)培養(yǎng)法設(shè)置為100%時(shí)，DNA芯片的總陽性率為85.0%，總陰性率為86.9%，此方法可快速準(zhǔn)確檢測(cè)到乳房炎的病原。

多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR是傳統(tǒng)PCR的改進(jìn)，利用熒光信號(hào)積累對(duì)擴(kuò)增的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。張莉莉等[10]針對(duì)大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的保守序列設(shè)計(jì)合成了3套特異性引物,通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,建立的多重TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法,最低檢測(cè)濃度分別為102、103、104拷貝數(shù)/μL,敏感性較高，DNA各個(gè)拷貝數(shù)濃度變異系數(shù)均低于2.02%，重復(fù)性良好，具有良好的推廣應(yīng)用價(jià)值。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，PCR診斷技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高、操作方便、耗時(shí)短且誤差小。

2.4 生物物理技術(shù)診斷

電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)、傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和紅外熱成像(IRT)均能顯著促進(jìn)乳腺炎相關(guān)病原菌的鑒定，允許從物種水平對(duì)細(xì)菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。Magro等[11]研究，基于質(zhì)譜原理的MALDI-TOFMS可在極短時(shí)間內(nèi)測(cè)定細(xì)菌種類或其蛋白質(zhì)。該技術(shù)特異性強(qiáng)和靈敏度高，能替代或補(bǔ)充通過表型方法進(jìn)行鑒定，但僅適用于現(xiàn)有細(xì)菌蛋白質(zhì)譜的特定光譜數(shù)據(jù)庫，如廣泛使用不太經(jīng)濟(jì)。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)技術(shù)基于對(duì)全生物體DNA鑒定，通過被測(cè)物種的光譜與參考數(shù)據(jù)庫中已知物種的光譜進(jìn)行比對(duì)，可在亞種或品系水平上區(qū)分乳房炎病原體生物，分別使用FTIR和MALDI-TOF MS方法鑒定牛乳腺炎相關(guān)的革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性球菌，其正確率分別為100%和90.5%，前者略優(yōu)于質(zhì)譜法[12-13]。

紅外熱成像(IRT)基于皮膚或乳房表面的熱或溫差，以圖像形式反映。其高靈敏度熱感相機(jī)可檢測(cè)乳房表面溫度的微小變化或炎癥，通過移動(dòng)信息技術(shù)應(yīng)用，可以成為一個(gè)便攜式診斷工具[14]，其敏感性和特異性分別為95.6%和93.6%[15]。其敏感性和特異性雖然很高，但在實(shí)際操作中難度大，有待進(jìn)一步研究。

2.5 基于傳感器的乳房炎診斷

在診斷領(lǐng)域，監(jiān)測(cè)奶牛乳房炎發(fā)病時(shí)或發(fā)病前行為變化極其重要。奶牛在采食量和整體活動(dòng)方面變化顯著，這些疾病跡象在臨床癥狀出現(xiàn)前幾天就很明顯，因此可作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)。Chinnappan等[16]基于磁性納米顆粒，通過使用纖溶酶的蛋白水解活性作為生物標(biāo)記，開發(fā)了一種特異性檢測(cè)金黃色葡萄球菌和其他葡萄球菌的比色生物傳感器，其靈敏度在體外測(cè)定為1 ng/mL纖溶酶。該方法能區(qū)分健康乳和病乳，且在乳房炎診斷過程中反應(yīng)迅速、簡(jiǎn)單、靈敏、潛力大，可用作初始診斷。

2.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析

蛋白質(zhì)組學(xué)方法在診斷、預(yù)測(cè)和預(yù)防奶牛乳房炎以及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量方面非常有用。這種方法有助于鑒定乳房?jī)?nèi)感染(IMI)生物標(biāo)志物[17-19]。研究表明，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)就是一種重要的BM炎癥標(biāo)志物，基于此可對(duì)全乳復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行分析[20]。一些組合策略液已被用于奶牛乳房炎期間牛奶的蛋白質(zhì)組分析，如雙向凝膠電泳后的MALDI-TOFMS(2D-GE)，液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜的聯(lián)合應(yīng)用。Abdelmegid等[17]采用二維差異凝膠電泳(2D-DIGE )結(jié)合液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，從具有肥大癥狀的病乳中檢測(cè)到28種高豐度蛋白，其中9種具有宿主防御功能，這些蛋白包括參與先天免疫和抗菌功能的急性期蛋白以及與病原體免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白，可成為奶牛隱性乳房炎潛在的候選生物標(biāo)志物。

2.7 特異性免疫分析

根據(jù)抗原抗體反應(yīng)特性，免疫檢測(cè)成為診斷亞臨床乳腺炎的有效方法，如乳膠凝集法、免疫層析法[21]。Jaeger等[22]利用牛乳淀粉樣蛋白A作為檢測(cè)亞臨床乳房炎的生物標(biāo)志物，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果對(duì)主要病原體檢測(cè)靈敏度為81.4%、特異性為93.4%，對(duì)全病原體檢測(cè)靈敏度為88.0%、特異性為65.2%。與常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)相比，基于磁珠的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)具有快速、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)試劑少的優(yōu)勢(shì)。但可能存在由于交叉反應(yīng)導(dǎo)致非特異性高缺點(diǎn)。此外，成本較高，對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施和人員技術(shù)熟練的要求高。

2.8 基因測(cè)序分析

基因分型、指紋識(shí)別已經(jīng)成為一種重要的奶牛乳房炎診斷工具，不僅用于微生物的種、亞種、菌株水平鑒定，還用于流行病學(xué)研究。核糖分型、脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)和多位點(diǎn)序列分型(MLST)經(jīng)常被用于基因分型[23,24]。Pumipuntu等[25]使用PFGE和MLST進(jìn)行金黃色葡萄球菌引起牛乳房炎的各菌株基因分型鑒定，發(fā)現(xiàn)凝固酶陽性分離株具有11 種不同的PFGE模式和一種不可分型模式，其中個(gè)別模式與多位點(diǎn)ST無關(guān)，在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的ST隔離。陳婷婷等[26]利用多位點(diǎn)序列分型(MLST)對(duì)甘肅部分地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)26株金黃色葡萄球菌中存在9種ST序列型，其中ST59為優(yōu)勢(shì)序列型。本方法具有方便、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但因其成本昂貴、耗時(shí)長(zhǎng)，現(xiàn)階段難以投入臨床使用。

3 奶牛乳房炎診斷在防治中應(yīng)用的思考

3.1 早期快速準(zhǔn)確診斷是做好防治工作的重要前提

奶牛乳房炎因素多，涉及病原廣，以分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)，開發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速及實(shí)驗(yàn)室高通量快速準(zhǔn)確診斷技術(shù)將是未來發(fā)展趨勢(shì)，如多病原基因芯片或蛋白芯片技術(shù)，基因組、蛋白質(zhì)組及代謝組學(xué)技術(shù)。此外，智能化、信息化技術(shù)結(jié)合也是診斷領(lǐng)域研發(fā)熱點(diǎn)，如生物傳感器技術(shù)有望成為檢測(cè)奶牛乳腺炎的重要工具。各方法優(yōu)缺點(diǎn)不同，單一應(yīng)用無法達(dá)到理想目標(biāo)。因此，多種方法聯(lián)合應(yīng)用可更準(zhǔn)確的防治，如以PCR檢測(cè)為主，體細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)相結(jié)合的應(yīng)用。

3.2 特征性生理指標(biāo)及代謝產(chǎn)物等檢測(cè)技術(shù)開發(fā)是做好防治工作的重要支撐

隱性乳房炎系診斷領(lǐng)域重要課題。及時(shí)監(jiān)測(cè)奶牛采食量及整體活動(dòng)方面的變化，如用IRT技術(shù)監(jiān)測(cè)奶牛乳房表面溫度，再通過檢測(cè)乳汁中一些酶活性物質(zhì)的活性或代謝產(chǎn)生的微量元素來客觀評(píng)估乳房炎的病程情況，為實(shí)施綜合治療方案提供支撐。

3.3 簡(jiǎn)便、快捷的適用技術(shù)廣泛推廣是臨床診斷的迫切要求

不同規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)采取相適應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，在大型規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)中，奶牛數(shù)量多，若用常規(guī)檢測(cè)，則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，貽誤病情。應(yīng)利用數(shù)字化、信息化、人工智能等相關(guān)技術(shù)使用傳感器數(shù)據(jù)來改善乳房炎管理的新方法。在小型養(yǎng)殖場(chǎng)中，飼養(yǎng)及相關(guān)獸醫(yī)技術(shù)人員層次不齊，開發(fā)類似乳汁電導(dǎo)率檢測(cè)、乳汁pH測(cè)定、乳清中蛋白含量測(cè)定以及現(xiàn)場(chǎng)熒光定量PCR、試紙條、LAMP等簡(jiǎn)便、適用技術(shù)，是進(jìn)行快速推廣和實(shí)現(xiàn)及時(shí)快速處置的有效手段。