杜夢(mèng)卿，普珍，向蓓蓓

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

川西獐牙菜（Swertia mussotii）為一年生草本龍膽科被子植物，是常用藏藥材“桑蒂”的原植物之一[1]。在臨床中廣泛應(yīng)用于急性黃疸型肝炎、膽囊炎、病毒性肝炎、水腫、流行性感冒、痢疾等多種疾病的治療，是治療肝膽疾病的良藥，有清熱解毒、清肝利膽之功效[2-3]。川西獐牙菜的主要化學(xué)成分為萜類、三萜類、環(huán)烯醚萜類等[4-5]，其主要有效成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷等均屬于環(huán)烯醚萜類化合物[6]。此外，石崢等[7]研究表明，川西獐牙菜的化學(xué)成分具有抗腫瘤的生物活性。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是指含有MYB結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[8-9]。有研究表明，MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布于植物中，幾乎參與了植物生長(zhǎng)和代謝的每個(gè)方面[10]。通過(guò)調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物中廣泛參與了初生和次生代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程以及響應(yīng)脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程[11]，在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程中起重要調(diào)控作用[12]。

1987年，Paz-Ares首次在玉米中克隆了含有MYB結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子C1基因，之后在植物中發(fā)現(xiàn)的MYB相關(guān)基因的數(shù)量迅速增加[11]。有研究表明，MYB參與調(diào)控花青素等黃酮類化合物的次生代謝，如玉米葉、花、種子中的花青素的合成含量受MYBCl調(diào)控，蘋果MdMYB9和MdMYB11通過(guò)與花青素合成酶、花青素還原酶和無(wú)色花青素還原酶的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控花青素和原花青素的積累，擬南芥、龍膽中的MYB轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控黃酮類成分的積累[13-14]。近年來(lái)，對(duì)川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組的研究主要為MK（SmMk），而川西獐牙菜中MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究還未見報(bào)道。

本研究從川西獐牙菜幼葉中克隆MYB基因序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為川西獐牙菜中萜類化合物的合成和改良等提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

青海省玉樹縣采集野生川西獐牙菜的種子，經(jīng)青海大學(xué)董匯澤教授鑒定，試驗(yàn)材料是在溫室條件下培養(yǎng)的川西獐牙菜幼葉。

大腸桿菌Rosetta和Escherichia coliTrans 5α菌種購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)股份有限公司，用于配置大腸桿菌LB液體培養(yǎng)基。

1.2 試劑與儀器

Eastep Super總RNA提取試劑盒，普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；卡那霉素，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV （RNase H-）試劑盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTP，大連寶生物工程有限公司；5×T4 Ligase Buffer、TransStart Fast Pfu Fly DNA Polymerase、pEASY-Blunt Simple Cloning Kit、5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer、DL2000 plus（2K plus）DNA marker，北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；快速瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒，康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；引物合成和基因測(cè)序，深圳華大基因科技有限公司。

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HNT-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司 ；Alpha-1860A紫外分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司 ；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；A200 PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；HVE-50高壓蒸汽滅菌鍋，廣州深華生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

根據(jù)川西獐牙菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所獲得的MYB基因的序列和pEASY克隆載體pEASY-BluntCloning Vector的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物為cDNA模板，序列如表1所示。

表1 引物序列表

對(duì)獐牙菜MYB基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系總體積為 50 μL，含有 dNTP（2.5 mmol/L）4.5 μL，雙蒸餾水 24.5 μL，5×TransStart Fast Pfu Fly Buffer 10 μL，川西獐牙菜 cDNA模板2 μL，Pfu DNA聚合酶（50 U/μL）3 μL，上游引物（10 μmol/L）3 μL，下游引物（10 μmol/L）3 μL。PCR的反應(yīng)流程為：94 ℃變性7 min，94 ℃保護(hù)變性30 s，60 ℃引物模板退火完成30 s，72 ℃延伸并合成DNA 90 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，結(jié)束后再72 ℃延伸10 min確保延伸完整。之后將其在4 ℃下進(jìn)行儲(chǔ)存，為電泳法檢測(cè)PCR產(chǎn)物做準(zhǔn)備。

2 結(jié)果與分析

2.1 川西獐牙菜MYB基因的開放閱讀框（ORF）的克隆

根據(jù)得到的轉(zhuǎn)錄組信息設(shè)計(jì)特異性引物，以獐牙菜總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條清晰的1 158 bp的全長(zhǎng)序列，推測(cè)編碼385個(gè)氨基酸，和預(yù)期大小符合。

2.2 理化性質(zhì)分析

利用 ExPASy Proteomics tool（https://www.expasy.org/）在線工具進(jìn)行MYB蛋白氨基酸的理化性質(zhì)分析，得到MYB蛋白的分子式為C1841H2857N537O593S15，相對(duì)分子質(zhì)量為42 482.08 Da，等電點(diǎn)為6.02，帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為39，帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）為46，不穩(wěn)定系數(shù)為50.04，說(shuō)明該類蛋白不穩(wěn)定。脂溶性系數(shù)為65.12，親水性系數(shù)為-0.688，說(shuō)明該類蛋白屬于親水性蛋白質(zhì)。

2.3 MYB蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)及信號(hào)肽的預(yù)測(cè)

使用在線軟件SignalP-3.0（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-3.0）在線工具分析出了信號(hào)肽的各項(xiàng)值，結(jié)果如圖1所示。原始切割位點(diǎn)（C）評(píng)分為0.039，信號(hào)肽（S）評(píng)分為0.186，聯(lián)合切割位點(diǎn)（Y）評(píng)分為0.025，平均S評(píng)分為0.081，D分?jǐn)?shù)（辨別分?jǐn)?shù)）為0.053，表示該蛋白不含剪切位點(diǎn)，沒(méi)有信號(hào)肽。

圖1 MYB蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析

使用PSORTⅡ（https://www.genscript.com/psort.html）在線工具推測(cè)獐牙菜MYB蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞核中的可能性為95.7%，定位在線粒體的可能性為4.3%。因此，推斷MYB蛋白亞細(xì)胞定位可能在細(xì)胞核中。

2.4 MYB蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

使用在線工具TMHMM（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0） 和NCBI數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 BLASTP程 序 對(duì)MYB蛋白預(yù)測(cè)了跨膜區(qū)，結(jié)果如圖2所示。該蛋白的1-385氨基酸位于細(xì)胞膜表面，因此可以推出MYB蛋白不具有跨膜區(qū)，表明此蛋白可能是非膜結(jié)合蛋白，整條多肽鏈均處于細(xì)胞膜外。

圖2 MYB蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

2.5 MYB蛋白多序列比對(duì)

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTP程序和DNAMAN 8.0軟件對(duì)MYB蛋白進(jìn)行了多序列比對(duì)。該蛋白與三龍膽、芝麻、煙草、小葉蟬、橄欖、南美煙草及黑毛黃耆中的該蛋白都有同源性，其中與三龍膽R2R3蛋白相似性最高，為70.90%；與黑毛黃耆的相似性最低，為62.01%。川西獐牙菜MYB蛋白存在多個(gè)保守區(qū)域，序列一致性達(dá)到71.03%。

2.6 進(jìn)化樹分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索與川西獐牙菜MYB蛋白序列相似性高的7條序列，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果如圖3所示。川西獐牙菜MYB蛋白與三龍膽R2R3在同一個(gè)分支上，表明兩者之間親緣性較高。

圖3 MYB蛋白的進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論

有研究對(duì)白芷MYB蛋白家族進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，有116個(gè)MYB蛋白都定位于細(xì)胞核中[15]。本試驗(yàn)使用PSORTⅡ在線工具推測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，推斷川西獐牙菜MYB基因亞細(xì)胞定位可能在細(xì)胞核中，與前人研究結(jié)果一致；有研究表明，藏藥多刺綠絨蒿MhMYB3R蛋白沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域，其529個(gè)氨基酸殘基均位于細(xì)胞膜外[16]。番茄SlMYB44蛋白最大疏水性值為1.533，最大親水性值為-3.411，沒(méi)有潛在的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)，屬于不穩(wěn)定、親水性蛋白[17]。這些結(jié)果與本文研究一致。

本文基于轉(zhuǎn)錄學(xué)數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)手段分析了MYB基因的ORF全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)該基因進(jìn)行了克隆。從生物信息分析結(jié)果可以看出，MYB基因編碼蛋白的分子式為C1841H2857N537O593S15，等電點(diǎn)為6.02，相對(duì)分子質(zhì)量為42 482.08 Da，不穩(wěn)定系數(shù)為50.04，說(shuō)明該蛋白不穩(wěn)定；從氨基酸的組成成分看絲氨酸的占比最高（10.9%），而蛋氨酸的占比最少（1.6%）；采用PCR技術(shù)克隆的MYB基因ORF框全長(zhǎng)為1 158 bp，推測(cè)編碼385個(gè)氨基酸，屬于PLN03091超級(jí)家族成員，亞細(xì)胞可能定位于細(xì)胞核；從多重序列對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果來(lái)看，川西獐牙菜MYB蛋白與三龍膽R2R3蛋白的親緣性最高。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的功能及利用基因工程手段提高川西獐牙菜中環(huán)烯醚萜類化合物產(chǎn)量提供了理論依據(jù)。