一種新型纖維素基吸附劑的制備及其對漆酶的固定化性能研究

呂靜思魯 鵬肖興曉彭傳博李 娜，，平清偉，

（1.大連工業(yè)大學(xué)輕工與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧大連，116034；2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西清潔化制漿造紙與污染控制重點實驗室，廣西南寧，530004）

漆酶［1］作為一種含有4個銅離子的多酚類單電子氧化酶，可作用的底物非常廣泛［2］。漆酶具有特征性吸收光譜，在有氧條件下，可通過銅離子在氧化反應(yīng)中協(xié)同傳遞電子的作用氧化酚類和芳香類化合物，從而實現(xiàn)廢水中木質(zhì)素［3］及氯代酚［4］、多氯聯(lián)酚［5］、二氯苯胺［6］等多種酚類化合物的降解。氧化酚類和芳香類化合物由于具有長期殘留性及毒性，已經(jīng)被列為持久性有機(jī)污染物（POPs）的范疇。游離漆酶具有價格昂貴且不可重復(fù)利用的缺點，限制了其在廢水處理領(lǐng)域的應(yīng)用［7］。而相比于游離漆酶，雖然固定化漆酶活性有一定的損失，但能夠提高酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性［8］，是很有前途的一種漆酶使用方法。因此，開發(fā)綠色的、固定漆酶的吸附劑，并提高固定化漆酶活性，對促進(jìn)漆酶在廢水處理的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義［9-10］。

纖維素是由多個D-吡喃葡萄糖酐（AGU）以β-（1-4）苷鍵連接而成的線形聚合物，是自然界中廣泛存在的可再生天然聚合物之一，以纖維素作為漆酶的載體具有價格便宜、可生物降解的特點［11］。此外纖維素的多孔結(jié)構(gòu)以及其含有的大量羥基（可通過氧化反應(yīng)、接枝共聚反應(yīng)等［12］改性手段在羥基位置上引入各種基團(tuán)），使其在作為酶的載體時具備高吸附性優(yōu)勢［13］，且以纖維素為原料制備球形載體固定漆酶，還具有便于后續(xù)分離以實現(xiàn)多次循環(huán)利用的環(huán)境友好價值［14-15］。

本課題利用綠色材料纖維素，通過再生并改性的方法制備了一種新型吸附劑，并用于固定漆酶。此外，探索了固定化條件對漆酶固定化率和固定化漆酶活性以及相關(guān)性質(zhì)的影響。研究對拓展纖維素的應(yīng)用領(lǐng)域及促進(jìn)漆酶在廢水處理的工業(yè)化應(yīng)用進(jìn)展方面具有一定的實用價值。

1 實驗

1.1 實驗材料

濾紙（新星，杭州特種紙業(yè)有限公司），尿素、氫氧化鈉（NaOH）、鹽酸（HCl）、磷酸氫二鈉、醋酸和磷酸均購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，硝酸鈰銨、丙烯酰胺（AM）購于上海麥克林生化有限公司，檸檬酸購于國藥化學(xué)試劑有限公司，牛血清蛋白（BSA）購于上海天朗科技有限公司，雙酚A購于上海阿拉丁生化科技有限公司，納米碳酸鈣（CaCO3）、漆酶和2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）均購于Sigma（中國）Chemical。

1.2 實驗方法

1.2.1 改性纖維素小球的制備

在-10℃的條件下，將2 g濾紙溶解于NaOH（7 wt%）/尿素（12 wt%）水溶液中，配制成4%的纖維素溶液［16］。然后加入0.4 g納米碳酸鈣，混合均勻。用一次性注射器將混合物滴入1 mol/L鹽酸溶液中，制備成球形纖維素吸附劑。吸附劑中的CaCO3與HCl反應(yīng)產(chǎn)生CO2并逸出，使吸附劑內(nèi)部形成多孔結(jié)構(gòu)。隨后濾出纖維素小球，在蒸餾水中浸泡12 h，除去反應(yīng)過程中產(chǎn)生的CaCl2，再將其轉(zhuǎn)移至濃度為10%~20%的乙醇溶液中浸泡6 h，之后冷凍干燥備用。

在三頸燒瓶中加入質(zhì)量比為6∶5的AM和纖維素小球及濃度為0.06%的硝酸鈰銨（CAN）引發(fā)劑，通入氮氣，60℃下反應(yīng)6 h［17-18］。反應(yīng)后，利用乙酸/乙二醇混合液抽提產(chǎn)物，以去除殘留藥品及反應(yīng)中產(chǎn)生的聚丙烯酰胺。在此步驟中，丙烯酰胺與纖維素小球上的羥基接枝，形成帶有酰胺基團(tuán)的3個碳的支鏈結(jié)構(gòu)。之后將接枝后的小球在堿性條件下水解，酰胺基被水解為羧基；反應(yīng)過程如圖1所示。

圖1 改性纖維素小球的制備Fig.1 Preparation of modified cellulose microspheres

1.2.2 漆酶活性的測定

采用ABTS法［19］測定游離漆酶和固定化漆酶的酶活。分別將0.5 mL游離漆酶、固定化漆酶加入含有0.2 mL ABTS溶液和2.3 mL（游離漆酶）/2.8 mL（固定化漆酶）磷酸鹽緩沖溶液（pH值=5.0）的混合溶液中，在420 nm處測定混合溶液的吸光度，每30 s記錄1次數(shù)據(jù)。游離漆酶酶活和固定化漆酶酶活的計算分別如式（1）和式（2）所示。

式中，?A為t時間內(nèi)混合溶液在420 nm處吸光度的增加值；V總為混合溶液總體積，mL；V酶為反應(yīng)體系中加入的游離漆酶的體積，mL；ε（L/(mol·cm)）=36.000，是420 nm處氧化態(tài)ABTS的摩爾吸光系數(shù)［20］；M表示每份纖維素小球負(fù)載漆酶的質(zhì)量，g。

1.2.3 漆酶的固定化

漆酶的固定化過程如圖2所示。在一定條件（見圖2）下，將纖維素小球置于漆酶溶液中并進(jìn)行磁力攪拌。固定化后，用pH值=5.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，得到的纖維素-漆酶小球（即固定化漆酶）用于后續(xù)實驗。

圖2 漆酶的固定化Fig.2 Immobilization of laccase

1.2.4 漆酶負(fù)載量的測定

利用考馬斯亮藍(lán)法測定纖維素小球上漆酶的負(fù)載量［21］。利用UH5300型紫外分光光度計（日本日立株式會社），在特征波長為595 nm的條件下測量漆酶與考馬斯亮藍(lán)結(jié)合物的吸光度，根據(jù)BSA做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算漆酶濃度，漆酶負(fù)載量的計算如式（3）所示。

漆酶固定化率的計算如式（4）所示。

式中，Q為漆酶負(fù)載量，表示每克纖維素小球負(fù)載漆酶的量，mg/g；C1為固定化前溶液中漆酶濃度，g/L；C2為固定化后溶液中漆酶濃度，g/L；V為溶液的總體積，mL；W表示固定化體系中纖維素小球的質(zhì)量，mg。

1.2.5 漆酶動力學(xué)常數(shù)

米氏常數(shù)Km是酶極為重要的動力學(xué)參數(shù)，表示酶促反應(yīng)達(dá)到最大速度（Vmax）一半時底物的濃度（S）。反應(yīng)速度和底物濃度之間的關(guān)系用Michaelis-Menten公式表示（見式（5））。

式中，以漆酶與底物反應(yīng)初速度的倒數(shù)1/V為y軸（計算時以1/A表示1/V），底物濃度的倒數(shù)1/S為x軸作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，計算出游離漆酶和固定化漆酶的Km值。

1.2.6 元素分析

元素分析法是依據(jù)杜馬定氮法測定氮元素含量的方法，具有操作簡便、樣品用量少、準(zhǔn)確度比凱式定氮法高的優(yōu)點［22］。利用元素分析法測定接枝后纖維素小球吸附劑的氮元素含量，由此確定接枝丙烯酰胺的最佳條件。稱取2~3 mg改性纖維素小球，用錫舟包好并壓實，放入元素分析儀（ario MICRO cube V，德國Elementar公司）進(jìn)行測試，每個樣品平行測2組。

1.2.7 紅外光譜分析與羧基含量的測定

利用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，F(xiàn)rontier型，美國PerkinElmer公司）對改性纖維素小球進(jìn)行紅外光譜分析，通過分析改性前后纖維素小球官能團(tuán)的變化來檢測改性是否成功。提前在120℃烘箱中烘干樣品和溴化鉀24 h以上，按照樣品∶溴化鉀=1∶100的質(zhì)量比制樣，壓片后快速放入紅外分析儀中進(jìn)行檢測。

利用酸堿滴定法測定纖維素小球改性前后增加的羧基含量。稱取相同質(zhì)量改性前后的纖維素小球，分別在30℃的條件下與過量的0.5 mol/L NaOH溶液反應(yīng)0.5 h，然后用0.5 mol/L的HCl溶液滴定剩余堿液到終點［23］；平行檢測3次取平均值。羧基含量（X，mmol/g）計算如式（7）所示。

式中，C為HCl的濃度，mol/L；V0為未改性纖維素小球消耗的HCl溶液體積，mL；V為改性纖維素小球消耗的HCl溶液體積，mL；W為纖維素小球的質(zhì)量，g。

1.2.8 X射線衍射分析

利用X射線在晶體物質(zhì)中的衍射效應(yīng)，對改性前后纖維素小球的晶體變化進(jìn)行分析。取少量干燥樣品鋪滿模具，放置于X射線衍射儀（XRD，XRD-6100，日本株式會社島津制作所）中開始測試。通過測定衍射角位置和譜線的積分強(qiáng)度對化合物進(jìn)行定性及定量分析。衍射X射線滿足如下布拉格方程。

式中，λ為X射線的波長；θ是衍射角；d是結(jié)晶面間隔；n是整數(shù)。

1.2.9 比表面積與掃描電子顯微鏡分析

稱取0.1~0.12 g干燥樣品置于BET測試管中，利用BET比表面分析儀（ASAP-2020，麥克默瑞提克（上海）儀器有限公司）進(jìn)行測試。利用測試得到的數(shù)據(jù)對纖維素小球的孔徑和比表面積進(jìn)行分析。

將改性前后的干燥纖維素小球固定在掃描電子顯微鏡樣品臺，在其表面噴滿金箔，抽真空完成后利用掃描電子顯微鏡（SEM，S-3400N，日本日立公司）對樣品表面進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 纖維素小球的改性

2.1.1 最佳改性條件

通過4因素3水平正交實驗確定纖維素小球的最佳改性條件，以改性后纖維素小球的氮元素含量為指標(biāo)進(jìn)一步確定最佳改性條件，實驗結(jié)果如表1所示。由表1可知，第9組的氮元素含量最高，第1組的氮元素含量最低，說明升高溫度可以促進(jìn)改性反應(yīng)。對比極差Rj發(fā)現(xiàn)，實驗條件的影響順序是：溫度>單體配比>時間>引發(fā)劑濃度。由實驗結(jié)果確定的最佳改性條件為：時間6 h、溫度50℃、單體配比8∶5（質(zhì)量比）、引發(fā)劑濃度0.08%。

表1 正交實驗結(jié)果表Table 1 Orthogonal experimental results

2.1.2 FT-IR光譜分析

圖3是改性前后纖維素小球的FT-IR譜圖。由圖3可知，纖維素分子骨架結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯的改變，基本保持了纖維素的結(jié)構(gòu)。在1589和1418 cm-1處的吸收峰是典型的酰胺基特征吸收峰，1634 cm-1處的吸收峰是—C==C的振動吸收峰，1685 cm-1附近的吸收峰是羧基與酰胺基—C==O的特征吸收峰。2900 cm-1附近的吸收峰為—CH2的振動吸收峰。通過對FT-IR譜圖的分析可知，改性后產(chǎn)物是纖維素和丙烯酰胺的接枝共聚物和部分水解物［24］。由圖3可知，3000~3500 cm-1范圍內(nèi)—OH的特征峰在改性后峰型變寬且強(qiáng)度減弱，可能是由于接枝支鏈上的羧基負(fù)離子與纖維素分子鏈上的氫原子形成氫鍵，說明接枝反應(yīng)發(fā)生在纖維素的羥基上［25］。

圖3 改性前后纖維素小球的FT-IR譜圖Fig.3 FT-IR spectra of cellulose microspheres before and after modification

根據(jù)式（7）計算得到改性纖維素小球增加的羧基含量為2.25 mmol/g，結(jié)合FT-IR譜圖可以證明改性成功。

2.1.3 XRD分析

通過對比改性前后纖維素小球的XRD譜圖（見圖4）可知，在2θ=12.36°和20.36°處的衍射峰分別是纖維素?zé)o定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)的特征衍射峰。改性纖維素小球的吸收峰強(qiáng)度較大，說明改性纖維素小球的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)都有所減少；原有結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致改性纖維素小球的結(jié)晶度降低。以X射線結(jié)晶度指數(shù)表示樣品的結(jié)晶度，其計算如式（9）所示。

圖4 改性前后纖維素小球的XRD譜圖Fig.4 XRD spectra of cellulose microspheres before and after modification

式中，I20.36°是2θ=20.36°衍射峰的強(qiáng)度（結(jié)晶區(qū)），I12.36°是2θ=12.36°衍射峰的強(qiáng)度（非結(jié)晶區(qū)）。計算得到改性纖維素小球的結(jié)晶度指數(shù)為0.74，未改性纖維素小球的結(jié)晶度指數(shù)為0.81，說明改性過程中纖維素的結(jié)晶區(qū)發(fā)生了破壞，可能是由于在結(jié)晶區(qū)成功接枝了丙烯酰胺鏈所致［26］。

2.1.4 BET數(shù)據(jù)分析

根據(jù)BET比表面積測試法，測得改性前后纖維素小球的比表面積及孔徑，結(jié)果如表2所示。國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）將孔徑在2~50 nm范圍內(nèi)的多孔材料定義為介孔材料，孔徑小于2 nm的定義為微孔材料。微孔材料的吸附性能穩(wěn)定，而介孔材料達(dá)到吸附平衡的時間短［27］。由表2可知，接枝改性前后纖維素小球的比表面積變化較??；但孔徑變化較大，改性纖維素小球的孔徑處于介孔范圍內(nèi)且接近微孔，說明接枝改性可提高纖維素小球的吸附性能，進(jìn)而提高纖維素小球?qū)ζ崦傅呢?fù)載率。

表2 纖維素小球BET測試結(jié)果Table 2 BET test results of cellulose microspheres

2.1.5 SEM分析

圖5是改性前后纖維素小球的SEM圖。從圖5可以看出，改性前后纖維素小球的表面形貌發(fā)生明顯變化。未改性纖維素小球表面呈鱗片形的孔狀結(jié)構(gòu)，而改性纖維素小球孔隙表面有微小柱狀結(jié)構(gòu)；對比未改性纖維素小球，改性纖維素小球的空心結(jié)構(gòu)和通道增多。制備纖維素小球過程中添加了納米碳酸鈣，其在HCl溶液中反應(yīng)生成CO2，促進(jìn)了纖維素小球中空心結(jié)構(gòu)和通道的形成。結(jié)合BET數(shù)據(jù)可知，改性纖維素小球更有利于吸附漆酶。

圖5 改性前后纖維素小球的SEM圖Fig.5 SEM images of cellulose microspheres before(a)and after(b)modification

2.2 漆酶的固定化

2.2.1 固定化時間

探究固定化時間（0.5、1、2、3、4、5 h）對漆酶固定化率的影響，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出，0.5~3 h內(nèi)，漆酶的固定化率迅速提高，3~5 h內(nèi)，漆酶固定化率的增速變緩。在固定化初期，纖維素小球結(jié)構(gòu)中的固定化位點較多，因此漆酶迅速“占據(jù)”纖維素小球中的空隙和通道，固定化率迅速提高；而隨著時間的進(jìn)一步延長（3~5 h），纖維素小球的大部分固定化位點被“占據(jù)”，漆酶的固定化率提高趨勢趨于平緩。綜上，確定最佳固定化時間為3 h［28］。

圖6 固定化時間對漆酶固定化率的影響Fig.6 Effect of time on the immobilization rate of laccase

2.2.2 固定化pH值

為確定固定化漆酶的最佳pH值，配制5種不同pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）的磷酸鹽緩沖溶液［28］，在最佳固定化時間3 h的條件下負(fù)載漆酶，以酶活最高者為100%作為基準(zhǔn)以確定各pH值條件下漆酶相對酶活的變化趨勢。在固定化過程中，磷酸鹽緩沖溶液的pH值影響纖維素小球與酶的結(jié)合程度，且漆酶與纖維素小球間存在靜電作用，纖維素小球所帶電荷和漆酶所帶電荷受溶液酸堿性的影響。此外，漆酶的蛋白質(zhì)在一定pH值范圍內(nèi)會失活，因此固定化漆酶（與纖維素小球作用后）在不同pH值下的酶活不同。由圖7可知，當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH值=5.0時，固定化漆酶的相對酶活最高［29］。

圖7 pH值對固定化漆酶相對酶活的影響Fig.7 Effect of pH value on relative enzyme activity of the immobilized laccase

2.2.3 初始酶濃度

控制固定化條件為pH值=5.0、固定化時間3 h，配制5種不同初始濃度（1、5、10、15、20 g/L）的酶溶液進(jìn)行漆酶固定化，根據(jù)固定化率確定最佳初始酶濃度，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，固定化率隨著初始酶濃度的增加快速提高，當(dāng)初始酶濃度>10 g/L，漆酶的固定化率增速變緩，說明高初始酶濃度對漆酶與纖維素小球的反應(yīng)有促進(jìn)作用，因為初始酶濃度較高時，漆酶可覆蓋纖維素小球的整個表面，甚至可能會誘導(dǎo)多層吸附［30］。

圖8 初始酶濃度對漆酶固定化的影響Fig.8 Effect of initial laccase concentration on the immobilization of laccase

此外，固定化漆酶的相對酶活隨初始酶濃度的增加而提高，在10 g/L時達(dá)到最大值，但隨著初始酶濃度的進(jìn)一步增加而急劇下降。在初始酶濃度為10 g/L時，固定化漆酶分子可能覆蓋了整個纖維素小球表面。但隨著溶液中酶濃度的進(jìn)一步增加，富余的漆酶被負(fù)載在其他漆酶上，形成多層吸附。在這種情況下，雖然纖維素小球上負(fù)載的漆酶較多，但第一層的活性位點被第二層所覆蓋，導(dǎo)致漆酶相對酶活降低［31］。綜上，最佳初始酶濃度為10 g/L。

2.3 熱穩(wěn)定性

酶分子三級結(jié)構(gòu)的改變是引起漆酶變性的原因之一，利用纖維素小球吸附漆酶此種固定化方法可增強(qiáng)漆酶分子的剛性，從而提高其熱穩(wěn)定性。在不同溫度下分別對固定化漆酶和游離漆酶保溫2 h，以最高酶活者為100%作為基準(zhǔn)以計算其他溫度下的相對酶活，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，游離漆酶和固定化漆酶的最適溫度分別是40℃和50℃，在最適溫度下，二者的相對酶活均為100%；游離漆酶的相對酶活在溫度>40℃時急劇下降，而固定化漆酶的相對酶活在溫度>50℃時的下降速度則相對較緩慢；70℃時，游離漆酶和固定化漆酶的相對酶活分別為38%和55%。因此可知，固定化漆酶的熱穩(wěn)定性遠(yuǎn)優(yōu)于游離漆酶，固定化作用使漆酶分子剛性增強(qiáng)，結(jié)構(gòu)不易被破壞，因而熱穩(wěn)定性更好［32］。

圖9 游離漆酶和固定化漆酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stabilities of free and immobilized laccase

2.4 固定化漆酶可重復(fù)使用性

纖維素基吸附劑是一種新型的漆酶固定化載體，從節(jié)約成本考慮，固定化漆酶與游離漆酶相比具有可重復(fù)使用的優(yōu)點。因此對最佳固定化條件下（固定化時間3 h、pH值=5.0、初始酶濃度10 g/L）得到的固定化漆酶進(jìn)行了循環(huán)使用性能的研究，通過測定每次循環(huán)使用后固定化漆酶的相對酶活以評價其可重復(fù)使用性，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，循環(huán)使用固定化漆酶6次，其相對酶活迅速降低，在第7次使用固定化漆酶后，其相對酶活下降趨勢變緩并在第9次使用后趨于穩(wěn)定，完成10次循環(huán)使用后，固定化漆酶的相對酶活仍可保持在初始酶活的60%左右。因此可知，固定化漆酶具備一定的可重復(fù)使用性能，可被重復(fù)利用，具有綠色可再生資源的優(yōu)點及廣闊的發(fā)展前景［33］。

圖10 固定化漆酶的可重復(fù)使用性Fig.10 Reusability of immobilized laccase

2.5 漆酶動力學(xué)常數(shù)

將底物ABTS配制成不同濃度的溶液，并分別添加游離漆酶和固定化漆酶與底物反應(yīng)，測定其吸光度值。以吸光度值的倒數(shù)1/A代替反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V，與底物ABTS濃度的倒數(shù)1/S進(jìn)行線性擬合，即可代入式（6）計算二者的Km值，結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，游離漆酶的Km值為0.42 mmol/L，固定化漆酶的Km值為0.50 mmol/L，表明固定化漆酶與底物反應(yīng)的親和作用低于游離漆酶。這是因為，游離漆酶能夠與底物充分接觸，而被固定化的漆酶分布在纖維素小球表面及內(nèi)部，需要一定時間才能與底物充分反應(yīng)［34］。此外，固定化漆酶自由度變小，因此，其與底物反應(yīng)親和力下降［35］。

圖11 漆酶的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖Fig.11 Lineweaver-Burk plots of free and immobilized laccase

2.6 改性前后纖維素小球?qū)潭ɑ崦该富畹挠绊?/h3>

對改性前后的纖維素小球固定化漆酶的酶活進(jìn)行了比較研究，結(jié)果如表3所示。由表3可知，未改性纖維素小球固定化漆酶的酶活為27.28 U/g，改性纖維素小球固定化漆酶的酶活為41.50 U/g，較前者提高了52%。改性纖維素小球固定漆酶時，漆酶固定于纖維素支鏈結(jié)構(gòu)末端，而未改性纖維素小球固定漆酶時，漆酶只能固定在纖維素表面；相比之下，在支鏈結(jié)構(gòu)末端的漆酶自由度相對較大，因此其酶活較高。因此，筆者認(rèn)為對纖維素進(jìn)行改性時，接入長鏈對增加固定化漆酶的自由度、提高漆酶酶活具有積極作用。

表3 改性前后纖維素小球固定化漆酶酶活Table 3 Enzyme activity of laccase immobilized by original and modified celloluse microsphere

3 結(jié)論

本研究以可再生的天然聚合物——纖維素為原料，通過接枝改性成功制備了一種多孔的新型纖維素基吸附劑（纖維素小球），并將其用于漆酶的固定化。該吸附劑在提高固定化漆酶酶活方面表現(xiàn)出良好性能，固定化漆酶表現(xiàn)出優(yōu)良的重復(fù)使用性能和熱穩(wěn)定性。纖維素小球作為綠色基質(zhì)材料，可以作為固定化漆酶的合適載體，具有良好的發(fā)展前景。后續(xù)工作中將進(jìn)一步研究固定化漆酶對造紙漂白廢水中的難處理酚類化合物（如氯代酚、多氯聯(lián)酚等）的降解效果。