賈俊斌 顧巖,2

據(jù)2018年全球腫瘤統(tǒng)計(jì)分析報(bào)告顯示，肺癌是全球發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌病理分類為非小細(xì)胞肺癌(Non-Small-Cell Lung，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(Small-Cell Lung，SCLC)，其中NSCLC是最常見的病理組織學(xué)類型，包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌,大細(xì)胞癌和鱗腺癌等，占到所有肺癌的85% , 其5年生存率僅為16%[2]。NSCLC早期時(shí)缺乏典型臨床癥狀，不易被察覺，多數(shù)的NSCLC患者確診時(shí)已處于晚期，預(yù)后較差。盡管肺癌治療的方法不斷在進(jìn)展，除傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療外，本世紀(jì)初，針對(duì)驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性靶向治療的問(wèn)世，顯著延長(zhǎng)了患者的總生存期，但其遠(yuǎn)期療效仍有待提高，目前，免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ICIs)已被用作晚期NSCLC的一線治療藥物，其具有代表性的PD-1/PD-LI單抗，能夠抑制腫瘤應(yīng)答T 細(xì)胞表面的PD-1受體與腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1配體結(jié)合，再次激活T細(xì)胞，發(fā)揮殺死腫瘤細(xì)胞的作用。ICIs被批準(zhǔn)用于肺癌的治療為NSCLC患者帶來(lái)了新的希望，且取得了突破性的進(jìn)展，但僅約20%患者在接受治療后獲得了長(zhǎng)期療效,且多數(shù)患者后期復(fù)發(fā)，預(yù)測(cè)免疫治療療效生物標(biāo)志物的不足與腫瘤免疫微環(huán)境的復(fù)雜和免疫逃逸，是導(dǎo)致療效不理想的重要原因。近年研究表明，腫瘤源性外泌體(tumor-derived exosome，TEX)對(duì)腫瘤發(fā)生、腫瘤生長(zhǎng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和進(jìn)展有巨大的影響。它們?cè)诩?xì)胞間通信和在癌細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間運(yùn)輸豐富的小分子和信號(hào)分子(組成腫瘤微環(huán)境(TME)中發(fā)揮重要作用[3-4]。因此探究非小細(xì)胞肺癌來(lái)源外泌體的免疫效應(yīng)，對(duì)NSCLC免疫治療的作用變得至關(guān)重要，本綜述主要對(duì)非小細(xì)胞肺癌來(lái)源外泌體參與NSCLC腫瘤免疫微環(huán)境中的作用和潛在生物標(biāo)志物探索的近年研究進(jìn)展進(jìn)行歸納綜述。

腫瘤源性外泌體簡(jiǎn)介

細(xì)胞外囊泡通常分為兩類，即胞外體和外泌體，胞外體是由質(zhì)膜直接向外出芽產(chǎn)生的囊泡，可以產(chǎn)生微囊泡、微粒和大囊泡，直徑范圍為50nm～1000nm，外泌體起源于核內(nèi)體，由脂質(zhì)雙層膜組成，直徑范圍為40～160nm(平均100nm)。外泌體的產(chǎn)生過(guò)程包括質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷和細(xì)胞內(nèi)多泡體(multivesicular bodies，MVBs)的形成，其中包含腔內(nèi)小泡(intraluminal vesicles，ILVs)，通過(guò)MVB與質(zhì)膜融合和胞外分泌，ILVs最終作為外泌體分泌[5]。外泌體包含膜蛋白、胞質(zhì)及核蛋白質(zhì),細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,代謝物,核酸,即mRNA、非編碼RNA和DNA[6-7]，可反映它們的來(lái)源細(xì)胞。外泌體是細(xì)胞間通訊的中介，與免疫反應(yīng)、病毒致病性、妊娠、心血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病和癌癥進(jìn)展相關(guān)[5]。腫瘤與免疫相關(guān)研究成為熱點(diǎn)領(lǐng)域，源自腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體，稱為腫瘤源性外泌體(TEX)，同樣擁有上述結(jié)構(gòu)和遺傳特性。腫瘤源性外泌體是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間細(xì)胞內(nèi)通訊的主要機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)周圍環(huán)境，為腫瘤的發(fā)生和發(fā)展創(chuàng)造最佳的微環(huán)境[8]；Weidle和 Lobb的研究表明腫瘤源性外泌體在腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著重要的中介作用[9-10]；同時(shí)腫瘤源性外泌體含有多種免疫刺激和免疫抑制因子，通過(guò)影響受體細(xì)胞的基因表達(dá)和信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫反應(yīng)參與細(xì)胞的重編碼，在多種類型癌中被證明：如晚期宮頸鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞分泌的外泌體將miR-142-5p傳遞給淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，并通過(guò)ARID2-DNMT1-IFN-γ信號(hào)通路誘導(dǎo)吲哚胺2,3-雙加氧酶表達(dá)，從而抑制和消耗CD8(+) T細(xì)胞[11]調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，胰腺癌來(lái)源的外泌體miR-212 3p下調(diào)樹突狀細(xì)胞中MHC-Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子RFXAP(調(diào)控因子X相關(guān)蛋白)，可能促進(jìn)癌細(xì)胞的免疫逃逸[12]。因此腫瘤源性外泌體與腫瘤免疫微環(huán)境密切相關(guān)，近年來(lái)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)來(lái)源外泌體的研究也得到了廣泛重視。

NSCLC來(lái)源外泌體在腫瘤免疫微環(huán)境中的作用

腫瘤微環(huán)境是指腫瘤或癌癥干細(xì)胞存在的細(xì)胞環(huán)境，包括周圍的免疫細(xì)胞、血管、細(xì)胞外基質(zhì)、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓源性炎癥細(xì)胞和信號(hào)分子[13]。隨著腫瘤與宿主之間免疫反應(yīng)的研究，對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫環(huán)境(腫瘤免疫微環(huán)境)多樣性和復(fù)雜性有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，可能影響腫瘤的發(fā)生和治療[14]。

一、NSCLC來(lái)源外泌體參與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)

NSCLC免疫治療的抗腫瘤作用是免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互作用的結(jié)果，而NSCLC來(lái)源的外泌體對(duì)免疫微環(huán)境中多種免疫細(xì)胞有直接或間接的影響。在腫瘤微環(huán)境中，樹突狀細(xì)胞促進(jìn)腫瘤的發(fā)生起重要作用，將腫瘤細(xì)胞釋放的抗原提呈給免疫效應(yīng)細(xì)胞，有研究指出肺癌活檢分離出的外泌體中，大約80%含有表皮生長(zhǎng)因子受體(Endothelial Growth Factor Receptor，EGFR)， EGFR具有誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的潛力，最終導(dǎo)致腫瘤抗原特異性CD8+T細(xì)胞的抑制,[15]造成腫瘤免疫逃逸。巨噬細(xì)胞可被腫瘤細(xì)胞分泌的某些因子馴化，成為免疫抑制性腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages，TAM)，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，循環(huán)的單核細(xì)胞和其他炎性淋巴細(xì)胞被招募到腫瘤組織中,改變腫瘤微環(huán)境。單核細(xì)胞是TAM的前體，能夠在炎性腫瘤微環(huán)境中持續(xù)生存并產(chǎn)生TAM[16]。腫瘤源性外泌體在單核細(xì)胞存活和腫瘤炎性微環(huán)境內(nèi)TAM生成中具有關(guān)鍵作用[8]，在NSCLC患者的TAM分泌TNFα促進(jìn)腫瘤細(xì)胞糖酵解，增加腺苷酸激活蛋白激酶和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體共激活因子1- α促進(jìn)腫瘤缺氧[17]，可能阻礙抗PD-L1治療NSCLC的療效。腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1與免疫細(xì)胞上的PD-1受體結(jié)合時(shí)，這種相互作用導(dǎo)致細(xì)胞毒性CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖、存活和效應(yīng)功能受到抑制，從而誘導(dǎo)腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞凋亡。最新的研究表明NSCLC分泌的含PD-L1的外泌體可能通過(guò)PD-1/PD-L1相互作用調(diào)節(jié)T細(xì)胞中的IFN-γ信號(hào)通路從而抑制T細(xì)胞的活性和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]。

二、NSCLC來(lái)源外泌體調(diào)節(jié)微環(huán)境促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial MesenchymalTransition，EMT)是上皮細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性的過(guò)程，使細(xì)胞具有侵襲性。從晚期NSCLC患者血清中分離出的TEX，與高度轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞一樣，含有高水平的波形蛋白，并可誘導(dǎo)受體人支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT[19]從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)展。NSCLC的TEX對(duì)腫瘤血管的生成以及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成起重要作用，金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1表達(dá)在肺癌的所有分期和類型中都升高，特別是在肺腺癌中，在PI3K/Akt/HIF-1通路的控制下，過(guò)表達(dá)TIMP-1可誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞及其分泌的外泌體中致瘤miR-210的表達(dá)，而這些表達(dá)miR-210的TEX下調(diào)了內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)中的促紅細(xì)胞生成素肝細(xì)胞受體配體A3(EphrinA3)，促進(jìn)血管生成[20]。非小細(xì)胞肺癌源性外泌體的微小RNA(MicroRNA,miRNA)通過(guò)選擇性靶向和激活肺上皮細(xì)胞中的TLR3促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成，這導(dǎo)致了增強(qiáng)的趨化因子分泌和隨后的中性粒細(xì)胞募集到肺，共同促進(jìn)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[21]。因此，NSCLC源性外泌體對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境，介導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及免疫逃逸，發(fā)揮重要作用，這可能是造成NSCLC的免疫治療特異性差的重要原因。

NSCLC來(lái)源外泌體有成為NSCLC免疫治療生物標(biāo)志物的潛力

ICIs在NSCLC治療取得了良好療效，對(duì)于預(yù)測(cè)免疫治療療效的生物標(biāo)志物，以更好選擇合適的患者獲得長(zhǎng)久療效方面，仍需要進(jìn)一步研究，目前用于預(yù)測(cè)NSCLC免疫治療療效的主要生物標(biāo)志物有腫瘤組織PD-L1的表達(dá)和腫瘤突變負(fù)荷(TMB)，但各有其不足[22]，且與療效的相關(guān)性并不高。腫瘤源性外泌體攜帶蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，與腫瘤細(xì)胞性質(zhì)關(guān)系密切，參與腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞的相互交流，越來(lái)越多的證據(jù)表明腫瘤源性外泌體內(nèi)容物，有可能成為新的預(yù)測(cè)免疫治療療效的生物標(biāo)志物[23]。腫瘤源性外泌體miRNA和PD-L1，在腫瘤免疫微環(huán)境的獨(dú)特性使得其得到廣泛關(guān)注與重視。

一、NSCLC來(lái)源外泌體miRNA的表達(dá)

非編碼RNA (Non-coding RNAs, ncRNAs)是一類不能被翻譯成蛋白質(zhì)的功能性RNA分子。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是一類特征明確的長(zhǎng)約22nt的ncRNAs ，可以調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá),通常通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)錄后 3′-非翻譯區(qū) (3′-UTRs)來(lái)調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，大量研究表明miRNA可能成為肺腫瘤新的生物標(biāo)志物[24]，以及對(duì)治療有潛在價(jià)值。miRNA在腫瘤源性外泌體中表達(dá)豐富，用于NSCLC早期診斷及預(yù)后已被大量研究。部分外泌體miRNA與肺癌患者PD-L1的表達(dá)相關(guān)，影響腫瘤的治療，如腫瘤源性外泌體miR200b低表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后不良有關(guān)，在NSCLC患者標(biāo)本中，miR200b與PD-L1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miRNA-200b可能是肺癌患者PD-L1表達(dá)的潛在生物標(biāo)志物[25]，PD-L1的表達(dá)仍是臨床常用的預(yù)測(cè)療效的常用指標(biāo)，miRNA-200b可能成為預(yù)測(cè)NSCLC免疫治療療效的一種輔助因子。NSCLC源性外泌體miRNA可能通過(guò)調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，有研究指出非小細(xì)胞肺癌來(lái)源的低表達(dá)miR-34c-3p的外泌體，通過(guò)上調(diào)整合素α2β1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移[26]。Kim等研究指出非小細(xì)胞肺癌中，腫瘤中RCAN1.4的表達(dá)水平明顯低于正常肺組織，miR-619-5p的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，腫瘤來(lái)源的外泌體miR-619-5p通過(guò)抑制RCAN1.4促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[27]。推測(cè)這些腫瘤源性的外泌體miRNA在正常組織與肺癌組織中表達(dá)差異，較大影響腫瘤的進(jìn)展，可能會(huì)導(dǎo)致NSCLC治療療效及預(yù)后不良，很有可能成為新的生物標(biāo)志物。

二、NSCLC來(lái)源外泌體PD-L1的表達(dá)

部分PD-L1陽(yáng)性表達(dá)的NSCLC患者并沒有從免疫治療中獲益。導(dǎo)致這種令人失望的治療反應(yīng)的原因尚不清楚，但可能是腫瘤微環(huán)境中PD-L1驅(qū)動(dòng)通路的綜合機(jī)制，包括循環(huán)PD-L1的意義尚未完全了解。新的研究表明多種腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體表達(dá)PD-L1已被證實(shí)，如黑色素瘤、前列腺癌、小鼠腫瘤細(xì)胞系等[28-30]，參與腫瘤免疫抑制調(diào)節(jié)通過(guò)抑制T細(xì)胞活性促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，與抗PD-L1/PD-1治療耐藥性相關(guān)。在NSCLC中腫瘤源性的外泌體表達(dá)PD-L1也已被證實(shí)，并且這些外泌體參與腫瘤進(jìn)展[18,31]。此外，PD-L1存在于從NSCLC患者血液中分離出來(lái)的外泌體上，PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的外泌體通過(guò)抑制細(xì)胞因子和誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞凋亡在腫瘤免疫逃避中比腫瘤相關(guān)組織PD-L1發(fā)揮更重要作用[18]。另一研究也指出在NSCLC患者，特別是晚期NSCLC患者的Exo-PD-L1(21.10±11.63 pg/mL 血清)水平高于健康對(duì)照組(15.91±6.45 pg/mL 血清)，此外，在NSCLC患者中，較高的Exo-PD-L1含量與腫瘤大小、陽(yáng)性淋巴結(jié)狀態(tài)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM晚期相關(guān)，而腫瘤組織免疫組化PD-L1的表達(dá)僅與吸煙狀態(tài)與組織學(xué)亞型顯著相關(guān)[31]，這可能解釋了PD-L1免疫組化表達(dá)量預(yù)測(cè)抗PD-L1/PD-1治療NSCLC療效差的原因，這也為腫瘤源性外泌體PD-L1作為抗PD-L1/PD-1治療新的預(yù)測(cè)因子提供理論依據(jù)。關(guān)于腫瘤源性外泌體PD-L1預(yù)測(cè)療效，已有臨床相關(guān)研究，Del等通過(guò)PCR檢測(cè)黑色素瘤和肺癌血漿源性外泌體PD-L1 mRNA觀察與對(duì)nivolumab 和pembrolizumab應(yīng)答的關(guān)系發(fā)現(xiàn)血漿源外泌體中PD-L1 mRNA的表達(dá)與黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌中抗PD-1抗體的應(yīng)答相關(guān)[32]。近期Shimada等在對(duì)120例肺癌患者隨訪過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)肺癌患者血清源性外泌體PD-L1≥166 pg/mL與CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增加(P=0.014)和腫瘤表面PD-L1陽(yáng)性(P=0.031)顯著相關(guān)，在17例復(fù)發(fā)肺癌患者接受PD-1抑制劑治療，PD-1抑制劑包括9種派姆單抗單藥方案、6種尼魯單抗單藥方案和2種聯(lián)合免疫治療方案中，所有血清源性外泌體PD-L1≥166pg/mL的患者對(duì)PD-1抑制劑均有疾病控制作用[33]。

NSCLC來(lái)源外泌體在免疫治療方面的潛在價(jià)值

腫瘤源性外泌體的生物學(xué)特性使它們?cè)贜SCLC的免疫治療方面有潛在的價(jià)值。腫瘤來(lái)源的外泌體在腫瘤微環(huán)境中往返于腫瘤和免疫細(xì)胞，提供腫瘤特異性抗原，是很有希望的抗癌疫苗候選體，參與腫瘤的免疫治療[22]。Besse[34]等一項(xiàng)研究表明了樹突狀細(xì)胞來(lái)源外泌體用于NSCLC一線化療后免疫維持治療的價(jià)值，證實(shí)了樹突狀細(xì)胞外泌體疫苗的可行性。NSCLC來(lái)源外泌體參與腫瘤的免疫調(diào)控，影響NSCLC的免疫治療，主要包括免疫抑制和免疫激活兩個(gè)方面。Liu[35]等研究指出，在NSCLC中，腫瘤源性外泌體microRNA-433通過(guò)增加CD4+T和CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)抑制腫瘤的發(fā)生，腫瘤浸潤(rùn)性CD8細(xì)胞與腫瘤免疫治療效應(yīng)密切相關(guān)，其可能是增強(qiáng)免疫治療的關(guān)鍵因子；多項(xiàng)研究也表明NSCLC來(lái)源外泌體PD-L1與腫瘤免疫治療療效差和預(yù)后不良相關(guān)，腫瘤源性外泌體PD-L1可能與免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥相關(guān)[18,31-32]，可能是免疫治療的新靶點(diǎn)。在晚期NSCLC患者中，裝載有IFN-γ、MHCⅠ和MHCⅡ限制性癌抗原的樹突狀細(xì)胞外泌體增強(qiáng)NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫功能[34]；另一方面，腫瘤源性外泌體可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的抗炎信號(hào)，從而有效提高肺癌免疫治療的療效[36]，因此通過(guò)阻斷或促進(jìn)相關(guān)腫瘤源性外泌體釋放有利于優(yōu)化腫瘤微環(huán)境的抗腫瘤免疫反應(yīng)，增強(qiáng)免疫治療的療效?？傊?，NSCLC來(lái)源外泌體參與腫瘤免疫調(diào)控，影響腫瘤免疫治療，NSCLC源性外泌體miRNA和PD-L1可能是一個(gè)尚未探索的免疫治療靶點(diǎn)，這可能是克服當(dāng)前免疫治療耐藥性的突破口，也為NSCLC的治療開創(chuàng)了新思路。

總結(jié)與展望

在正常和病理?xiàng)l件下，外泌體介導(dǎo)細(xì)胞與其周圍環(huán)境之間信息交流。腫瘤源性外泌體作為腫瘤細(xì)胞與腫瘤免疫微環(huán)境之間的重要溝通機(jī)制，在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。隨著對(duì)NSCLC來(lái)源外泌體，在腫瘤免疫微環(huán)境中調(diào)控機(jī)制的研究，人們?cè)絹?lái)越清晰NSCLC來(lái)源外泌體在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要性。迄今為止很多數(shù)據(jù)表明NSCLC來(lái)源外泌體有成為NSCLC免疫治療新的預(yù)測(cè)療效生物標(biāo)志物的潛力，用單一的NSCLC源性外泌體miRNA/PD-L1預(yù)測(cè)療效可能存在一定異質(zhì)性，可將敏感性及特異性較高的一組腫瘤源性外泌體與現(xiàn)有生物標(biāo)志物結(jié)合更好將NSCLC患者分層對(duì)于指導(dǎo)治療及預(yù)后可能會(huì)有突破性的意義。隨著對(duì)NSCLC源性外泌體免疫效應(yīng)與分子機(jī)制研究的不斷完善，NSCLC來(lái)源的外泌體也可能會(huì)成為一種新的免疫治療手段，但腫瘤源性外泌體的使用有一些局限性，如它們的分離、純化和鑒定方法的復(fù)雜性，以及其異質(zhì)性，但是隨著技術(shù)的進(jìn)步以及完善不是其發(fā)展的主要阻礙。然而，要將基于外泌體的技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，還需要更復(fù)雜的臨床研究來(lái)解決目前外泌體生物學(xué)的局限性。隨著NSCLC來(lái)源的外泌體在免疫效應(yīng)以及生物標(biāo)志物方面的進(jìn)一步探索，對(duì)NSCLC的治療有巨大的潛在價(jià)值。