離體胎盤灌注模型應(yīng)用的研究進展

唐代鈺 董曉靜

胎盤是連接母胎的重要部分，有屏障作用、物質(zhì)交換、分泌激素、免疫調(diào)控等功能。各種妊娠期母兒疾病均與胎盤功能密切相關(guān)。涉及到胎盤的許多研究因倫理問題無法直接在人體開展，動物實驗的結(jié)果雖有一定參考意義，但又難以全面外推至人體。離體胎盤灌注模型的提出解決了這一難題。

離體胎盤灌注模型最早是由Panigel等[1]提出的，通過灌流管連接供應(yīng)同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈建立胎兒側(cè)循環(huán)，灌流管插入螺旋動脈殘端建立母體側(cè)循環(huán)，主要用于藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運的相關(guān)研究。后經(jīng)過Schneider等[2]和Miller等[3]的改進，逐漸形成了如下成熟的離體胎盤灌注模型。

收集胎盤并進行灌洗后，在保留完整胎盤的基礎(chǔ)上，確定供應(yīng)同一胎盤小葉的臍靜脈與臍動脈，結(jié)扎其分支，穿刺置管建立該小葉的胎兒循環(huán)，當(dāng)臍動脈端灌入量與臍靜脈端流出量相等時說明該胎盤小葉無滲漏，去除多余的胎盤組織，在該胎盤母體側(cè)絨毛間隙內(nèi)插入兩灌流管2～3 mm建立母體循環(huán)。離體胎盤灌注模型建立后，母體側(cè)灌注液用95%的O2和5%的CO2混合氣體進行氧合，胎兒側(cè)則用95%的N2和5%的CO2混合氣體充氣，以模擬母體血與胎兒臍動脈血的體內(nèi)狀態(tài)[4]。實驗過程中可通過測量胎兒循環(huán)側(cè)pH、溫度、壓力、耗氧量、胎兒凈氧轉(zhuǎn)移、乳酸產(chǎn)量等指標(biāo)來衡量離體組織活性，但胎兒側(cè)灌注液體積損失測量則被認(rèn)為是最佳的評價指標(biāo)，考慮液體殘留及水分蒸發(fā)，通常胎兒側(cè)灌注液損失量不超過2～4 mL/min提示該循環(huán)建立成功。安替比林是一種親水性的小分子化合物，通過被動擴散進入胎盤，因此常被作為胎盤轉(zhuǎn)運研究的陽性參照物，在母體側(cè)以100%的濃度加入安替比林，灌注2.5 h后安替比林的F/M值>0.75才能說明模型建立成功[4]。經(jīng)不斷改進后的離體胎盤灌注模型，被應(yīng)用于藥物與疾病的各方面研究。

一、藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運

有研究發(fā)現(xiàn)，約23%～85%的妊娠婦女在妊娠期間需要進行藥物治療[5]，但胎盤屏障作用有限，部分對胚胎有毒性作用的藥物進入母體循環(huán)后可能通過胎盤進入胎兒循環(huán)，從而影響胎兒的生長發(fā)育，甚至產(chǎn)生致畸或致死作用。因此，評估胎兒的藥物暴露水平成為衡量妊娠期用藥安全的重要指標(biāo)。離體胎盤灌注模型保留了完整的胎盤結(jié)構(gòu)，是評估藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運的最經(jīng)典的方法。

藥物胎盤轉(zhuǎn)運機制包括被動擴散、主動運輸、易化擴散、過濾和胞飲作用。其中被動擴散是胎盤轉(zhuǎn)運的重要機制，受物質(zhì)分子量大小、離子化程度、脂溶性高低等因素影響。通過在開放或封閉離體胎盤灌注系統(tǒng)中進行藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運實驗發(fā)現(xiàn)，部分藥物以被動擴散形式通過胎盤屏障進入母胎循環(huán)，例如抗病毒藥物替諾福韋[6]、阿昔洛韋[7]，內(nèi)分泌用藥溴隱亭[8]等。這些被動擴散物質(zhì)游離與結(jié)合狀態(tài)的平衡很大程度上影響其經(jīng)胎盤的運輸，故而母體側(cè)血清白蛋白與胎兒側(cè)血清白蛋白濃度是該類物質(zhì)經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運的重要限制因素。例如溴隱亭與母體側(cè)蛋白結(jié)合率高，其分子量較大，研究顯示只有微量溴隱亭通過胎盤轉(zhuǎn)運，其胎兒轉(zhuǎn)移率約6%[8]。而Lee等[9]的研究則表明，降糖藥物二甲雙胍的胎盤轉(zhuǎn)運是由OCT3(organic cation transporter)介導(dǎo)的。Kurosawa等[10]和Freriksen等[11]通過采集不同藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運的數(shù)據(jù)結(jié)合藥代動力學(xué)模型分析以及hutson等[12]進行的一項meta分析(n=26)均表明，離體胎盤灌注模型進行藥物實驗所得數(shù)據(jù)與臨床觀察臍血中相關(guān)藥物數(shù)據(jù)高度一致，這表明離體胎盤灌注模型是研究藥物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運的理想模型。

既往研究證實，萬古霉素[13]、羅格列酮[14]、人胰島素[15]、溴隱亭[8]等藥物極少甚至不透過胎盤，在孕期使用有較高的安全性；而縮宮素即使在低于生理濃度的條件下，仍可以由母體側(cè)轉(zhuǎn)運至胎兒側(cè)[16]，故在臨床上使用縮宮素進行催產(chǎn)時，應(yīng)以與生理分娩進展速率相適應(yīng)的最低劑量給藥；西地那非是一種通過增強一氧化氮(NO)途徑介導(dǎo)血管舒張的藥物，動物實驗證明其可通過改善子宮胎盤血供從而改善子癇前期母胎結(jié)局[17]，但在一項大型臨床實驗研究中發(fā)現(xiàn)，西地那非的應(yīng)用可能導(dǎo)致一些新生兒疾病甚至新生兒死亡[18]，后利用體外胎盤灌注證實，西地那非可通過健康婦女胎盤，且在子癇前期婦女胎盤中，越早孕周西地那非透過胎盤的劑量越大[14]。這些結(jié)果對于指導(dǎo)西地那非的臨床用藥有很大參考價值。

二、毒物經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運

甲醛是常見的家居污染物，動物實驗證實暴露于甲醛的小鼠均出現(xiàn)了生殖系統(tǒng)損害以及胎兒畸形[19]和胎盤損傷[20]，人離體胎盤灌注模型實驗證實，甲醛從母體側(cè)經(jīng)胎盤迅速轉(zhuǎn)移至胎兒側(cè)，通過與蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸等多種生物分子代謝并發(fā)生反應(yīng)，引起DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)，從而在胎盤和胎兒組織中積累，造成胎盤滋養(yǎng)細胞層出現(xiàn)氧化應(yīng)激樣反應(yīng)，導(dǎo)致胎盤功能障礙[21]。對羥基苯甲酸酯是一類廣泛用于日常用品的防腐劑，存在潛在的內(nèi)分泌干擾作用，孕期苯甲酸酯的暴露可能導(dǎo)致胎兒體重過度增長[22]，而體外胎盤實驗則證實，不同種類苯甲酸酯以及不同濃度苯甲酸酯經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運時無明顯運輸動力學(xué)差異[23]，但其對胎兒的影響仍需進一步實驗研究。草甘膦是眾多除草劑的有效成分，既往也被認(rèn)為是除草劑毒性的主要成分，但在離體胎盤模型實驗中發(fā)現(xiàn)，以草甘膦為基礎(chǔ)的復(fù)方農(nóng)藥比單獨的草甘膦對胎盤循環(huán)和其完整性有更嚴(yán)重的損害，這些復(fù)方農(nóng)藥的配方里含有聚氧乙醇胺、多環(huán)芳烴或重金屬等，這可能是其對胎盤毒性高于單獨草甘膦的原因，這也解釋了暴露于不含草甘膦的殺蟲劑或其他環(huán)境污染物的孕婦亦出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的原因[24]。因此，僅以草甘膦作為除草劑毒性所在的說法有待商榷。大量研究表明，空氣污染與不良妊娠結(jié)局之間存在一定關(guān)聯(lián)，但對于污染顆粒毒性背后機制以及是否能穿過胎盤進入胎兒循環(huán)仍未可知。Bongaerts等[25]利用離體胎盤灌注模型進行柴油尾氣顆粒(diesel exhaust particles,DEPs)的轉(zhuǎn)運和積累研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過6 h灌注后，DEPs的胎母比值接近于零，在胎兒側(cè)灌注液中沒有檢測到明顯DEPs顆粒，但在胎盤組織，尤其是合胞滋養(yǎng)層中，檢測到大量DEPs顆粒蓄積，并在胎兒側(cè)上皮細胞中檢測到少量DEPs顆粒，表明其毒性作用主要是對胎盤功能影響，但該實驗在胎兒側(cè)上皮細胞檢測到少量的DEPs，故亦不排除其直接的胎兒毒性作用。氯氰菊酯、唑丙環(huán)唑、比特醇等農(nóng)藥中含有的化學(xué)物品[26]、納米級粒子[27]等均可通過胎盤屏障進入胎兒循環(huán)。人離體胎盤灌注模型是一個有價值的研究環(huán)境污染物對母胎影響的系統(tǒng)，值得在環(huán)境化學(xué)物質(zhì)研究中得到越來越多關(guān)注。

三、建立疾病胎盤模型及研究相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機制

妊娠合并癥與并發(fā)癥多通過影響胎盤功能從而影響胎兒的生長發(fā)育，建立體外的胎盤疾病模型有助于進一步研究的開展。子癇前期(preeclampsia,PE)是一種嚴(yán)重影響母胎安全的妊娠期高血壓疾病，目前其發(fā)病機制被認(rèn)為與孕早期胎盤淺著床以及孕中晚期胎盤氧化應(yīng)激反應(yīng)高度相關(guān)，建立PE的體外胎盤模型有助于更加透徹的研究其發(fā)病機制。對健康離體胎盤組織進行缺氧灌注后發(fā)現(xiàn)，母體側(cè)及胎兒側(cè)不同炎癥因子、氧化應(yīng)激標(biāo)志物，例如內(nèi)皮素-1(ET-1)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)均有不同水平的升高，很好的模擬了PE的胎盤炎癥反應(yīng)[28]；通過對比PE產(chǎn)婦及正常產(chǎn)婦離體胎盤的三維血管模型發(fā)現(xiàn)，PE產(chǎn)婦胎盤血管床體積較正常產(chǎn)婦減少，1～3級靜脈和2～3級動脈管徑變小，外周動靜脈比增高，這可能是導(dǎo)致PE胎盤灌注不足的原因之一[29]。PE離體胎盤微囊泡結(jié)合的一氧化氮合酶(STBEV-eNOS)水平較低導(dǎo)致NO減少[30]，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKCA通道)的表達下調(diào)[17]都可能是導(dǎo)致胎盤血管收縮的原因。從PE離體胎盤分離的微囊泡(STBEV)能導(dǎo)致血小板的活化[31]，這可能是PE患者血液高凝的原因。妊娠期糖尿病可能導(dǎo)致早期流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎兒生長受限、胎兒畸形、巨大兒等不良妊娠結(jié)局，在高糖灌注液模擬的妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)胎盤模型中，發(fā)現(xiàn)胎兒血管阻力顯著增加，同時檢測到內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和蛋白激酶(Akt)磷酸化水平降低，這一結(jié)果提示高糖通過降低NO的生成，導(dǎo)致血管阻力升高[32]。被瘧原蟲感染的紅細胞表面表達惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1(PfEMP1)，介導(dǎo)細胞與內(nèi)皮細胞、血小板、紅細胞和合胞滋養(yǎng)細胞的粘附，從而逃避循環(huán)和免疫，VAR2CSA作為PfEMP1家族的一員，與硫酸軟骨素A(chondroitin sulfuric A,CSA)結(jié)合，從而在體外胎盤灌注模型中積累，其分布與自然感染相似，而可溶性CSA和抗VAR2CSA抗體抑制了感染紅細胞的結(jié)合[33]，這一發(fā)現(xiàn)為胎盤瘧疾疫苗的開發(fā)提供了新的研究方案?；诖耍琍ehrson等[34]在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，一種脂質(zhì)體制劑中的ID1-ID2a蛋白(目前處于I期試驗)有效地誘導(dǎo)了抑制胎盤組織中感染紅細胞粘附的抗體。在對胎兒生長受限(fetal growth restriction,FGR)胎盤的研究中發(fā)現(xiàn)，吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)的缺乏會導(dǎo)致色氨酸降解減少，其產(chǎn)生的免疫抑制及胎盤血管舒張作用減弱[35]，與FGR的發(fā)生密切相關(guān)[36]。FGR也可能與胎兒-胎盤血管反應(yīng)性改變有關(guān)[37]，在對比正常胎盤與FGR胎盤離體條件下對前列腺素E2(PGE2)的反應(yīng)性的實驗中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GR胎盤對PGE2反應(yīng)性較正常組降低[38]，證實了上述可能。灌注液中加入?；悄懰釀t可建立妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥(Intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)模型[39]。利用離體胎盤灌注模型還可建立更多疾病胎盤模型，以助于更好的進行相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展機制的研究。

四、研究相關(guān)治療方案

針對妊娠期疾病的部分治療措施在動物實驗中有較好效果，但難以在人體直接開展實驗進行驗證，且相關(guān)治療的機制亦有待明確。例如在PE和正常的離體胎盤灌注模型的母體灌流液中加入硫酸鎂，PE組可溶性FMS樣酪氨酸激酶-1(sflt-1)濃度較正常對照組并未增加[40]，提示硫酸鎂對子癇前期的治療作用僅在于預(yù)防子癇，而與PE相關(guān)的抗血管生成狀態(tài)無關(guān)。使用編碼VEGF異構(gòu)體的腺病毒(Ad)在動物模型中轉(zhuǎn)導(dǎo)子宮動脈可以增加子宮-胎盤血液灌注量(utero-placental blood perfusion,UBF)并改善胎兒在子宮內(nèi)的生長[41]，但應(yīng)用于人體需驗證其安全性，在離體胎盤的實驗中發(fā)現(xiàn)，胎兒側(cè)靜脈灌流液中很少檢測到病毒載體，檢測到病毒載體時滴度也非常低[42]，這一結(jié)果為該治療方法應(yīng)用于人體提供了一定的依據(jù)。雙胎輸血綜合征(twin to twin transfusion syndrome,TTTS)的治療十分有限，激光治療是目前較好的辦法，利用離體胎盤灌注模型研究TTTS激光治療時相關(guān)因素的影響可為治療細節(jié)提供更多的指導(dǎo)[43]。干細胞的移植是治療妊娠期相關(guān)疾病的研究熱點，體外胎盤灌注模型是研究間充質(zhì)干細胞的胎盤遷移和定植的良好工具，將熒光標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞注入離體胎盤灌注模型的血管，從胎盤中將注射后的血管分離、培養(yǎng)、制作切片，可見間充質(zhì)干細胞穿過血管內(nèi)皮屏障，實驗中同樣發(fā)現(xiàn)，穿過血管壁遷移的間充質(zhì)干細胞仍在血管生態(tài)位內(nèi)，并不遷移至周圍組織中，相關(guān)機制有待進一步研究明確[44]。

五、離體胎盤灌注的代謝

進入胎盤的物質(zhì)并非均以原型進入胎兒循環(huán)，胎盤的代謝功能對于物質(zhì)經(jīng)胎盤轉(zhuǎn)運有一定影響。例如雌激素玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)進入胎盤后，經(jīng)代謝形成活性較高的雌激素及活性較低的ZEN-14-硫酸鹽結(jié)合物釋放入母體和胎兒循環(huán)[45]。皮質(zhì)醇在胎盤中被11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase 2,11β-HSD2)快速代謝為可的松，而皮質(zhì)醇亦會影響色氨酸在胎盤中的代謝[46]。吲哚胺2,3-雙加氧酶-1(IDO1)是色氨酸(TRP)分解過程中的一種酶，絨毛膜的血管內(nèi)皮細胞和蛻膜螺旋動脈的內(nèi)皮細胞有其定值。IDO1介導(dǎo)的TRP在內(nèi)皮細胞分解代謝可能產(chǎn)生抗菌活性和免疫抑制，以及胎盤血管緊張的松弛，從而促進胎盤灌注和胎盤及胎兒的生長。但胎盤中的TRP降解酶也會導(dǎo)致色氨酸的缺乏，這兩個過程的結(jié)合對建立和維持胎兒-母體免疫耐受具有重要意義[36]。胎盤對于不同物質(zhì)的代謝與其含有的特殊的酶及相關(guān)蛋白有關(guān)，離體胎盤灌注模型可讓研究者更徹底地研究胎盤的代謝功能。

綜上所述，離體胎盤灌注模型在研究疾病、藥物、環(huán)境等對母胎的影響上有很高應(yīng)用價值。其作為最接近生理條件的模型，是用于研究胎盤功能最經(jīng)典的方法，但也存在一定的局限。例如實驗中多采用的是妊娠晚期剖宮產(chǎn)或順產(chǎn)的胎盤，妊娠晚期隨著妊娠進展，胎盤功能逐漸減退，實驗所得出相關(guān)結(jié)果難以完全代表妊娠早期的胎盤狀況；離體后的胎盤雖在接近于生理的條件下進行試驗，但在例如酶活性、轉(zhuǎn)運體數(shù)量、胎盤組織在制備過程中缺血缺氧所致本身損傷等方面與體內(nèi)均有一定差異。基于此，近來有學(xué)者將離體胎盤灌注與數(shù)學(xué)建模相結(jié)合[47]，進一步明確胎盤灌注系統(tǒng)的各種實驗條件控制及相關(guān)影響因素，這使得研究者可更加便利地模擬各種條件下胎盤功能的研究。盡管離體胎盤灌注存在一定不足，但作為目前研究胎盤功能最經(jīng)典的方法，仍然是眾多研究者的選擇，在今后的研究中，可對影響離體胎盤灌注的各項因素進行更深入的了解，以提供更加接近體內(nèi)環(huán)境的離體胎盤灌注模型。