骨肉瘤化療多藥耐藥現(xiàn)象及中藥抗耐藥研究?

潘 雪， 石倩瑋

(1.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院， 北京 100053；2.中國中醫(yī)科學院博士后科研流動站， 北京 100700)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，該腫瘤被界定為存在產(chǎn)生類骨質(zhì)和/或未成熟骨的惡性間充質(zhì)細胞。全球范圍內(nèi)，骨肉瘤的患病率為4.3%，且呈雙峰年齡分布，于15～19歲兒童及青少年人群中達到高峰，而第二個高峰則出現(xiàn)在年齡≥75歲的老年人群中[1]。從監(jiān)測、流行病學和最終結(jié)果(surveillance, epidemiology and end results，SEER)數(shù)據(jù)庫中提取數(shù)據(jù)顯示，在過去的10年中，經(jīng)過年齡調(diào)整后，每年骨肉瘤新發(fā)病例以0.4%的速度增長[2]。骨肉瘤最常見的癥狀是骨痛，隨著病情的進展，可逐漸出現(xiàn)局部腫脹、腫塊及關(guān)節(jié)活動受限情況，對于確診時已轉(zhuǎn)移或復發(fā)的患者，其5年生存率往往低于30%[3]，嚴重影響患者的身心健康，并降低生活質(zhì)量。

目前，新輔助化療對于骨肉瘤的治療具有重要意義。但患者在長期化療后，易出現(xiàn)多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，影響化療效果。因此，為解決骨肉瘤化療的MDR問題，針對相關(guān)耐藥機制進行新藥開發(fā)、制定靶向治療策略成為骨肉瘤治療的新方向，而中醫(yī)藥具有多靶點、低毒、高效等治療優(yōu)勢，在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療的多藥耐藥現(xiàn)象方面發(fā)揮著重要作用。

1 MDR已成為新輔助化療治療骨肉瘤困局

上世紀70年代前，針對骨肉瘤的治療方法有限，療效欠佳。70年代后有研究報道，應用大劑量甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑能夠有效治療骨肉瘤[4]，隨后將其應用于骨肉瘤的臨床治療中，使得該病的無病生存率接近70%。因骨肉瘤的治療取得階段性進展，輔助化療的臨床療效被國內(nèi)外學者肯定。隨著外科技術(shù)的發(fā)展，如何改善骨肉瘤患者生存率，提高保肢率逐漸受到重視。1979年Rosen等對“新輔助化療”概念的提出，進一步完善改進了原有的輔助化療，強調(diào)了術(shù)前化療，即術(shù)前化療-手術(shù)-術(shù)后化療，包括T4/T5方案，成為最早制定治療骨肉瘤的可行模式。新輔助化療在提高保肢率、降低控制轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮了重要作用，且聯(lián)合化療干預骨肉瘤可使其5年生存率由不及20%提高至65%～70%[5]，因此該療法已成為目前骨肉瘤的首選及標準治療模式。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，絕大多數(shù)學者認為化療是提高骨肉瘤患者遠期生存率的主要手段，阿霉素、甲氨蝶呤、順鉑及異環(huán)磷酰胺是公認的治療骨肉瘤有效化療藥物，且在藥物劑量的認知上亦達成共識。盡管在骨肉瘤化療方案上尚未形成定論，但多年來通過臨床工作者的不斷研究和探索，已證實新輔助化療能為患者帶來一定的益處，并被廣泛應用于臨床治療中。雖然該療法能在一定程度上延緩骨肉瘤患者的生存期，但不斷提高的化療強度已經(jīng)接近人體耐受極限，即使增大藥量、增加聯(lián)合化療藥物種類或改變給藥途徑，仍然有20%～30%的病例收效甚微，MDR即是治療的一大挑戰(zhàn)。目前普遍認為，MDR是腫瘤細胞對化療藥物殺傷作用最重要的抵御與自我保護機制，由一種藥物誘發(fā)產(chǎn)生耐藥性的同時，對其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生藥物對抗反應，是惡性腫瘤化療失敗和復發(fā)的重要原因，導致骨肉瘤患者的生存狀況難以得到改善[6-8]。

2 骨肉瘤化療的MDR發(fā)生機制

自從1970年Biedle等首次發(fā)現(xiàn)MDR以來，國內(nèi)外學者進行了廣泛、深入的基礎(chǔ)實驗與臨床研究，探尋MDR產(chǎn)生的分子機制取得了一定的進展。目前，在涉及MDR的病理機制中，多項研究聚焦于腫瘤細胞對藥物的攝取減少及外泵增加方面，ATP結(jié)合盒(atp-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族的參與和MDR形成具有密切關(guān)聯(lián)[9]。

P-糖蛋白(p-glyeoprotein, P-gp)是其中被研究最早、最深入的ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員。P-gp是一種分子量170 kD的跨膜糖蛋白，由位于人類染色體7q21.1的ABCBI(MDR1)基因編碼，它具有“藥泵功能”，其跨膜區(qū)域可結(jié)合藥物，2個ATP結(jié)合域相互靠近與ATP結(jié)合釋放能量，促使中心孔道開放，將藥物轉(zhuǎn)運至細胞外使?jié)舛认陆担罱K導致化療耐藥，這是產(chǎn)生MDR的經(jīng)典途徑[10-12]。多項研究[13-15]表明，P-gp的高表達是骨肉瘤產(chǎn)生MDR現(xiàn)象的關(guān)鍵機制，也是影響患者預后的重要因素，較高的復發(fā)率及轉(zhuǎn)移率與其相關(guān)。

除了P-gp介導的MDR經(jīng)典途徑以外，多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)介導的化療藥物外排也是產(chǎn)生MDR的另一條重要途徑。MRP與P-gp具有諸多相似之處，亦屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員，是第一個被發(fā)現(xiàn)的ABCC亞家族轉(zhuǎn)運蛋白。MRP蛋白在體內(nèi)主要分布于細胞質(zhì)內(nèi)的質(zhì)膜系統(tǒng)，具有解毒防御、分泌作用，可介導細胞膜及細胞質(zhì)囊泡內(nèi)部的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，調(diào)整細胞內(nèi)物質(zhì)分布，目前已發(fā)現(xiàn)9種具有轉(zhuǎn)運功能的MRP，分別為MRP1-MRP9[16]。MRP可以轉(zhuǎn)運砷等重金屬，保護機體免受環(huán)境中氧化態(tài)重金屬陰離子的傷害。MRP1是該家族中研究最為透徹的一個蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞膜上大量表達MRP1，MRP1可轉(zhuǎn)運蒽環(huán)霉素和長春花生物堿等抗癌藥物，通過識別化療藥物與谷胱甘肽(glutathione，GSH)形成的共軛物，將其排出細胞外，從而導致耐藥[17]。MRP1介導的藥泵功能和經(jīng)典的P-gp介導耐藥機制有部分相同底物，二者不同之處在于MRP1介導的藥物轉(zhuǎn)運外排途徑是伴有GSH的共軛轉(zhuǎn)運而進行的。基于現(xiàn)有的研究報道，P-gp及MRP1過表達被認為是腫瘤MDR最主要的因素。屠重棋等[18]研究對正常成年骨組織及骨肉瘤組織進行免疫組化檢測對比分析，結(jié)果證實71.11%骨肉瘤組織中MRP1表達呈陽性，且MRP的表達與該腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。

隨著研究的深入，眾多學者發(fā)現(xiàn)骨肉瘤化療的MDR并不是通過單一途徑介導發(fā)生，可能是多種機制相互作用的結(jié)果。針對化療藥物的解毒作用，目前研究較深入的是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)。有學者認為，GSTP1的過度表達與多種惡性腫瘤的化學抵抗及預后有關(guān)。一項以60例30歲以下患者骨肉瘤標本為對象的研究表明，GSTP1過表達與術(shù)前化療的組織學不良反應有密切關(guān)聯(lián)[19]。另外，細胞凋亡也是化療誘導細胞死亡的重要方式，細胞周期停滯及凋亡的一系列相關(guān)基因表達均可參與化療細胞毒性的調(diào)節(jié)，如p53、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因等[20，21]。由此可見，細胞解毒、細胞凋亡抑制與腫瘤細胞的耐藥有關(guān)。近年來，關(guān)于DNA損傷修復機制、骨肉瘤干細胞、細胞自噬作用的研究亦在不斷開展，但仍有很多耐藥因素尚未被闡釋明晰，需要進一步探索。

3 骨肉瘤化療耐藥逆轉(zhuǎn)策略

現(xiàn)階段，如何逆轉(zhuǎn)MDR、提高骨肉瘤化療效果已成為一項世界性難題。通過對腫瘤MDR產(chǎn)生的分子機制進行研究，已經(jīng)明確一些關(guān)鍵蛋白及異常生物過程調(diào)控在MDR中發(fā)揮著重要作用，并基于此開發(fā)了相關(guān)蛋白分子抑制劑，以嘗試逆轉(zhuǎn)腫瘤化療耐受。

其中，P-gp抑制劑能通過抑制細胞中P-gp轉(zhuǎn)運活性發(fā)揮MDR逆轉(zhuǎn)作用，臨床中常應用鈣離子通道抑制劑維拉帕米和環(huán)孢霉素A及其衍生物，但由于其毒副作用巨大，干擾化療藥物的藥代動力學，使得MDR逆轉(zhuǎn)劑的臨床應用受到限制。另外，針對MRP1介導腫瘤細胞MDR逆轉(zhuǎn)劑的研究方向主要包括兩方面，一是針對MRP1介導藥物中GSH的共軛物外排轉(zhuǎn)運特點，通過抑制GST/GSH系統(tǒng)，耗竭細胞內(nèi)GSH，從而減少MRP1對化療藥物的外排轉(zhuǎn)運，如丁硫氨酸硫酸亞胺(buthionine sulfoximine，BSO)；二是針對MRP1轉(zhuǎn)運底物的結(jié)構(gòu)特點而合成的化合物,如以異惡唑為基礎(chǔ)的化合物LY40291、喹啉化合物MS-209、LY335979等[22]。目前這些MRP1逆轉(zhuǎn)劑尚處于體外實驗階段，屬于前期研究階段，是否對人體有效還需要進一步的臨床驗證。

縱觀現(xiàn)有可行的MDR逆轉(zhuǎn)方法，或因造成明顯不良反應，或因價格昂貴、技術(shù)難度高，或因缺乏進一步臨床循證數(shù)據(jù)支撐，使MDR的臨床干預受限。因此，探討MDR產(chǎn)生機制的同時，仍需不斷尋求安全、有效的化療耐藥逆轉(zhuǎn)方法。

4 中藥在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤耐藥中的應用前景

近年來，中藥已成為抗腫瘤研究的熱點問題，中藥資源豐富，能夠通過多途徑、多靶點發(fā)揮療效，在腫瘤治療中的重要性不斷提高。針對腫瘤MDR機制的復雜性，中藥是有潛力開發(fā)成為能夠逆轉(zhuǎn)耐藥的理想藥物，其天然產(chǎn)物活性成分能夠影響腫瘤MDR，受到腫瘤屆醫(yī)學同道的廣泛關(guān)注[23]。這些潛在的治療藥物或具有鈣通道阻滯作用，或影響與耐藥相關(guān)蛋白的表達，或通過調(diào)節(jié)細胞凋亡等方式發(fā)揮逆轉(zhuǎn)MDR的作用。

4.1 粉防己堿

粉防己堿又名漢防己甲素，是一種雙芐基異喹啉類生物堿，主要來源于中藥防己根。粉防己堿具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤活性，具有鈣通道阻滯作用。王進等[24]研究發(fā)現(xiàn)，粉防己堿對骨肉瘤耐藥細胞系U2OS/DOX具有逆轉(zhuǎn)作用且其療效優(yōu)于維拉帕米及環(huán)孢霉素A。Lu等[25]通過評估粉防己堿對骨肉瘤中MDR的預防作用也得到了類似結(jié)論，結(jié)果表明粉防己堿能通過抑制P-gp過度表達，進而預防紫杉醇引起的MDR，這種變化機制可能與抑制骨肉瘤中的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號傳導有關(guān)。

4.2 姜黃素

姜黃素是姜黃根莖植物中重要的成分之一，具有良好的抗炎及抗癌特性，能夠起到逆轉(zhuǎn)MDR的作用。有研究[26]表明，姜黃素能增加阿霉素對阿霉素抗性骨肉瘤細胞株U2OS/ADM的毒性作用，且呈劑量依賴關(guān)系，可有效逆轉(zhuǎn)U2OS/ADM細胞的MDR現(xiàn)象。Si等[27]通過體內(nèi)外兩方面實驗證實，姜黃素具有增強抗腫瘤藥物活性、抑制多藥耐藥細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移作用，其下調(diào)P-gp且抑制P-gp外排泵功能可能有助于MDR逆轉(zhuǎn)。

4.3 三七皂苷R1

三七總皂苷是三七的主要活性成分，其特征化合物即為三七皂苷R1，該化合物對多種器官、組織具有良好的調(diào)節(jié)作用，而且已被證實在癌癥中能夠發(fā)揮抗腫瘤作用[28]。在骨肉瘤的研究中，三七皂苷R1能夠劑量依賴性地削減骨肉瘤細胞活力及遷移能力，并誘導腫瘤細胞凋亡。Lu等[29]通過研究也發(fā)現(xiàn)，三七皂苷R1能夠抑制骨肉瘤細胞中的阿霉素抗性。從機制上分析，其能夠有效阻斷白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)誘發(fā)的Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路的激活，臨床應用前景廣闊。

4.4 槲皮素

槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制癌細胞增殖作用，并能夠誘導其凋亡[30]。已有研究報道[31-33]，槲皮素在多種惡性腫瘤中作為輔助藥物能增強化療藥物的治療效果，具有較大的開發(fā)潛力。Zhang等[34]研究對槲皮素聯(lián)合順鉑治療骨肉瘤的效果進行評價，結(jié)果證實槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)miR-217-KRAS，增強順鉑治療骨肉瘤的敏感性，值得進一步研究。

4.5 雷公藤甲素

雷公藤甲素(triptolide, TP)來源于中藥雷公藤，其生物活性強，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理作用[35]。在抗腫瘤方面，TP能夠抑制多種腫瘤細胞生長并誘導其發(fā)生凋亡或者自噬，抑制血管生成，減少遠端轉(zhuǎn)移[36]。在TP抗骨肉瘤效應方面，有文獻報道[37]TP作為絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)的抑制劑，能夠阻止MKP-1的表達，增強順鉑誘導的骨肉瘤細胞死亡，表明TP與順鉑能夠協(xié)同抑制骨肉瘤細胞增殖。這些研究結(jié)果提示，TP具有逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療MDR的潛能，能夠與化療藥物協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應。

5 總結(jié)與展望

中藥具有多成分、多途徑、多靶點的特點，治療腫瘤歷史源遠流長且毒性小，在逆轉(zhuǎn)骨肉瘤MDR方面已展現(xiàn)出治療優(yōu)勢及潛力，但仍存在一定的局限性?？v觀現(xiàn)有的研究報道，大多體外實驗具有一定的局限性，針對中藥單體的藥理作用及機制還有待進一步通過體內(nèi)實驗驗證；目前，中藥復方干預骨肉瘤的防治研究相對較少，中醫(yī)歷來重視整體觀及辨證論治，因此復方的應用有著廣闊的發(fā)展前景。在今后的研究中，可進行相關(guān)研究探討中藥復方能否通過多藥味的協(xié)同作用，增強機體的抗癌能力，提高化療敏感性，進而逆轉(zhuǎn)MDR。以上問題的進一步完善，將為拓展臨床應用提供科學依據(jù)，對開發(fā)切實有效的新藥具有重要價值；近年來，已有多種檢測新技術(shù)涌現(xiàn)，對疾病的預防、診斷及預后意義深遠。因此，亟需對中藥MDR逆轉(zhuǎn)劑處理或未處理的化療耐受腫瘤細胞進行整體的蛋白質(zhì)和基因組定量分析，探求經(jīng)中藥處理后細胞內(nèi)蛋白及基因表達差異，并通過生物信息學技術(shù)分析這些差異蛋白或基因所在的信號網(wǎng)絡，為進一步闡釋中藥基于多靶點、多階段性特性逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療MDR的分子機制，提供方向及切入點。