糖料作物啟動子研究進展

孟帥辰，王希，陳麗

（1.黑龍江大學現(xiàn)代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院/中國農業(yè)科學院甜菜研究所，哈爾濱 150080；2.黑龍江省普通高等學校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江省甜菜工程技術研究中心，哈爾濱 150080；3.國家糖料改良中心/中國農業(yè)科學院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

基因啟動子（Promoter）位于基因編碼區(qū)的上游，負責RNA 聚合酶的識別、結合和起始轉錄[1]。啟動子及其啟動子元件是轉錄水平上基因表達的主要調控因子，啟動子需要與轉錄因子相結合來控制和開啟下游基因的表達。另外，啟動子是基因工程表達載體的重要元件，對外源基因表達水平影響較大[2]，因此，掌握啟動子結構與功能對基因工程也大有助益。目前啟動子克隆及分析已涉及到許多作物，如花生、玉米、水稻、棉花、大豆等[3-7]。糖料作物的分子生物學研究雖然起步較晚，但近年來在啟動子克隆與分析研究方面也取得了一定進展。通過啟動子的克隆和分析，將對糖料作物基因中具有重要作用的功能元件和調控區(qū)域進行精準定位，對研究糖料作物的生理適應、遺傳改良、外源基因高效表達等方面均具有重要意義；此外，隨著糖料作物基因工程工作的進步，對啟動子種類、結構、功能的需求增長也將是必然趨勢。因此，本文綜述了糖料作物中啟動子研究的進展情況，以期為糖料作物相關研究提供信息。

1 甘蔗的啟動子研究

甘蔗是世界上最重要的糖料作物。此外，甘蔗可作為能源乙醇的原料，為緩解能源問題提供實際幫助。甘蔗屬于無性繁殖作物，分蘗莖的生長情況會對甘蔗出苗率和下種量有重要影響，因此挖掘分蘗和腋芽生長的優(yōu)異基因就顯得尤為重要。李旭娟等[8]從甘蔗中克隆到了調控分蘗發(fā)育MOC1的同源基因ScMOC1，為了后續(xù)能夠高效驅動目的基因表達和功能研究，利用巢式PCR 技術克隆到甘蔗ScMOC1基因起始密碼子上游1 874 bp 的啟動子序列，通過在線分析軟件PlantCARE 對該序列分析，結果表明序列中含有TATA-box、CAAT-box、ARE、ABRE、ERE 等重要的順式調控元件，瞬時表達分析表明該序列可驅動GUS基因在甘蔗葉中表達。分蘗基因對甘蔗分蘗形成起著重要作用，利用好啟動子序列對研究遺傳育種具有重要意義。相對于模式植物，甘蔗分蘗基因的挖掘和啟動子序列的研究較滯后，是目前乃至今后重點的研究方向。

甘蔗糖分代謝相關基因的挖掘和啟動子克隆，一直是研究者重點研究的內容。糖分代謝過程較為復雜，其中受蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）、可溶性中性或堿性轉化酶（ANI）及可溶性酸性轉化酶（SAI）等多種酶的調控[9-11]。這些都是參與蔗糖合成、代謝及轉運等功能的關鍵酶，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，這些酶除參與蔗糖積累，還與脅迫應答有一定關系，受到不同因素的調控。周平等[12]從甘蔗品種‘FN95-1702’中克隆了SPSⅢ基因的5'側翼啟動子序列，通過基因槍微彈轟擊甘蔗愈傷組織觀察瞬時表達，證實該序列具有啟動子活性。曹輝慶等[13]從甘蔗品種‘新臺糖22 號’中克隆了SPSB基因的5'側翼啟動子序列，其序列長度為4 399 bp并具有逆境應答等特性。雷美華等[14]從甘蔗品種‘FN95-1702’中克隆到蔗糖合成酶基因（SS）1.9 kb的上游啟動子序列，在線數(shù)據(jù)庫分析表明該序列含有TATA-box 以及糖誘導SURE 元件。?？∑娴萚15-17]從甘蔗品種‘GT28’中克隆到SoSAI1、SoNIN1及SoCIN1基因上游的啟動子序列；啟動子序列長度分別為417 bp、1 174 bp 及792 bp；軟件分析3 個基因的啟動子序列，除具有真核生物啟動子特定結構TATA-box 和CAAT-box外，SoSAI1還含有胚乳特異表達順式作用元件（Skn-1_motif）和參與干旱誘導的MYB結合位點，進一步研究表明該基因應對環(huán)境脅迫發(fā)揮作用。

近年來全球氣候多變，甘蔗在生長過程中常受到干旱、低溫以及過量光等非生物脅迫因子的影響，甘蔗脅迫響應的分子機制研究也包含了一些與啟動子克隆有關的研究。逆境相關蛋白[18]（Stress-associated protein,SAP）基因家族中具有參與植物逆境應答和提高轉基因植物抗逆性的重要基因。李曉君等[19]分離獲得SAP 基因家族成員ShSAP1基因的1 243 bp 啟動子序列；生物信息學分析表明，該序列具有啟動子的特征元件，還包含干旱脅迫的相關應答元件及組織特異性相關元件；說明ShSAP1啟動子具有逆境應答特性，為后續(xù)驗證活性和功能提供幫助。PRABU等[20]克隆到逆境轉錄因子MYB基因ScMYBAS1的5'側翼啟動子序列；通過啟動子缺失實驗分析，證明該啟動子受凍害、高溫和干旱誘導，可見ScMYBAS1表達調控的復雜性。KHARTE 等[21]分離了甘蔗MYB 轉錄因子基因PEaMYBAS1啟動子序列，揭示了其轉錄水平的脅迫耐受機制；啟動子缺失分析顯示，缺失片段F0（-1032 bp）在非生物脅迫條件下，外源基因PEaMYBAS1啟動子轉錄起始位點上游可誘導GUS基因高表達。GAO 等[22]分離到甘蔗桿狀病毒啟動子（SCBV21）在甘蔗莖維管束和貯藏薄壁組織中進行基因表達。ISKANDAR等[23]和KHAN等[24]分別證實甘蔗Pr-1DHNSo和OsC3H52啟動子受干旱脅迫誘導，基因表達量隨干旱脅迫時間的延長而增加。目前，甘蔗中有許多與逆境脅迫相關的關鍵調控酶基因已相繼被克隆出來，例如甘蔗獨腳金內酯生物合成基因（ScCCD8）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因（SsCIPK23）、甘蔗ABA 生物合成關鍵酶基因（SoNCED）等[25-28]，但關于這些基因的啟動子克隆研究仍然較少，后續(xù)研究應適當以這方面內容為重點。

2 甜菜的啟動子研究

甜菜是一種重要的制糖作物。目前，甜菜啟動子克隆的報道較少，僅有少部分學者對其進行了研究。THURAU 等[29]為了研究抗線蟲基因Hs1pro-1在細胞水平上的轉錄調控，從Hs1pro-1基因的YAC-DNA 中分離出3 082 bp 的Hs1pro-1啟動子片段，并與β-葡萄糖醛酸酶報告基因（1832prm1::GUS）融合，分別轉化為感病甜菜根和擬南芥植株；對攜帶1832prm1::GUS 構建體的轉基因甜菜根和擬南芥植株進行熒光與組織化學GUS分析，結果表明，Hs1pro-1啟動子在這兩種植物中都有功能，并驅動線蟲反應和攝食位點特異性GUS表達；為了闡明Hs1pro-1啟動子的調控區(qū)域，構建了Hs1pro-1啟動子和GUS基因5'缺失的融合基因，并對轉基因甜菜根進行分析；負責攝食位點特異性基因表達的順式作用元件位于Hs1pro-1轉錄起始位點的-355～+247，而增強子區(qū)域位于啟動子的-1 199～-705。在甜菜和擬南芥中，Hs1pro-1啟動子驅動線蟲取食位點特異性GUS表達，表明Hs1pro-1在這兩個物種中表達的調節(jié)機制是保守的。雙生病毒最近已成為世界熱帶和亞熱帶地區(qū)快速發(fā)展的植物病原體，其啟動子中的許多轉錄增強元件位于病毒基因組的編碼和非編碼區(qū)域，甚至位于基因的重疊區(qū)域，使病毒的基因組最小化，它們?yōu)檠芯恐参镏械腄NA 復制、轉錄和基因表達提供了一個良好的模型系統(tǒng)。對甜菜曲頂病毒（BCTV）、甜菜曲頂伊朗病毒、菠菜嚴重卷曲頂病毒、胡椒黃矮病毒（PeYDV）、蘿卜曲頂病毒和小麥矮化曲頂病毒對雙向啟動子系列分析表明，BCTVs 菌株的宿主范圍最廣，BCTV 有47 個轉錄因子結合位點（TFBS），而PeYDV 具有26 個TFBS，在病毒體正義鏈啟動子和病毒體反義鏈啟動子中分別具有最大和最小的TFBS數(shù)量。在上述病毒中，病毒體反義鏈啟動子比正義鏈啟動子具有更多的轉錄因子[30]。

OLTMANNS 等[31]從甜菜中克隆了Tlp、His1-r及Mll基因的啟動子，并將其轉化到甜菜和煙草中。在轉基因甜菜植株中報告基因的表達分析表明，3 種啟動子都在貯藏根中具有活性；Mll基因在甜菜的不同發(fā)育階段具有高度的器官特異性；在煙草中，Tlp和Mll啟動子優(yōu)先驅動報告基因在下胚軸和根中表達；Mll啟動子的特性可能有利于改變貯藏根的蔗糖代謝；研究還發(fā)現(xiàn)，常用的β-葡萄糖苷酸酶報告基因并不適用于甜菜，因為甜菜主根中的酚類化合物會抑制該酶，而熒光素酶基因（LUC）更適合。梁文潔等[32]將克隆到的甜菜Mll啟動子與洋蔥SST基因重組，實驗結果表明，SST基因可以提高甜菜的抗旱性。

蘭雪[33]以甜菜基因組為模板，PCR技術擴增出甜菜BvCPD基因啟動子區(qū)域3個5'端缺失片段，利用煙草GUS 瞬時表達體系分析表明3 個啟動子片段均具有啟動活性；進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉基因擬南芥在干旱、低溫和避光環(huán)境下啟動子片段驅動的GUS 表達量相比于未處理組均有不同程度的變化，表明BvCPD啟動子受干旱、低溫和光照誘導調控。于志海[34]從紅柄甜菜葉中克隆到BvcTYR基因5'上游1 670 bp啟動子序列，預測結果顯示在3'端含有轉錄起始位點（TSS）、TATA-box、CAAT-box 等調控元件，瞬時表達分析表明該序列可驅動GUS基因在擬南芥的根和葉柄中表達。白璐[35]采用LA-PCR方法克隆到甜菜谷氨酰胺合成酶基因5'上游828 bp啟動子片段，通過軟件TSSP分析啟動子序列，結果表明該序列含有TATA-box、CAAT-box以及干旱誘導表達有關的順式作用元件，為后續(xù)了解甜菜谷氨酰胺合成酶基因的表達調控及構建表達載體提供了依據(jù)。馬冰雪等[36]克隆到甜菜色素合成關鍵基因UGT和TYR的啟動子序列，序列分析表明，2 個基因均含有特征元件TATA-box 和CAAT-box 及光響應元件ACE 和G-Box，推測甜菜UGT、TYR基因的表達對光照較為敏感。王玉婷[37]利用在線分析數(shù)據(jù)庫PlantCARE預測甜菜BvM14-MADSbox基因啟動子區(qū)域，推測出該啟動子為誘導型啟動子，可通過促進劑誘導基因表達。

3 甜葉菊的啟動子研究

甜葉菊又稱甜菊，其葉片中富含的天然甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs）是蔗糖甜度的300 倍[38]。目前在甜菊葉中已鑒定出30種糖苷組分，其中甜菊苷（Stevioside，STV）和瑞鮑迪苷（Rebaudioside A，R-A）為主要成分，占總甜菊糖苷的75%～95%[39]。因此，挖掘甜菊糖苷組分生物積累的相關基因以及研究基因的表達調控，是提高甜菊糖苷含量和品質的關鍵。楊永恒等[40]發(fā)現(xiàn)甜菊葡萄糖苷轉移酶基因（SrUGT76G1）是STV 苷和R-A 苷合成的關鍵基因；為了進一步研究該基因在甜菊中的調控表達模式，采用染色體步移的方法克隆到SrUGT76G1基因上游長度為2 283 bp啟動子序列，經在線分析工具PlantCARE對啟動子序列進行分析，結果顯示該序列具有475 個順式調控元件，除了含有TATA-box、CAAT-box 等典型保守元件外，還包含干旱、低溫等環(huán)境因子響應元件，赤霉素等植物激素響應元件，芽、胚乳等組織特異性表達元件；為了驗證啟動子活性，構建表達載體在甜菊幼苗和擬南芥中進行瞬時表達，結果表明啟動子具有活性，但很多順式元件的功能對SrUGT76G1基因表達調控作用還需進一步深入研究。

ZHANG 等[41-42]采用TAIL-PCR 方法分離到SrUGT76G1基因上游2 050 bp 的啟動子序列，序列分析顯示存在多個W-box 順式元件，它們是WRKY 轉錄因子的識別基序。SrWRKY71 具有典型的WRKY 結構域和一個C2H2 鋅指樣基序，利用酵母單雜交實驗證實SrWRKY71 轉錄因子直接與甜葉菊SrUGT76G1基因近端啟動子區(qū)W-box1 和W-box2 結合；此外，SrWRKY71 抑制了SrUGT76G1在煙葉和甜葉菊愈傷組織中的表達水平。鑒定出SrUGT76G1基因的轉錄因子SrWRKY71為甜菊糖苷生物合成調控網(wǎng)絡提供了新的途徑。

4 甜高粱的啟動子研究

甜高粱是一種高含糖量、高產的作物，目前關于甜高粱啟動子研究文獻較少。植物WRKY 轉錄因子家族通過結合下游靶基因啟動子區(qū)的W-box來調節(jié)其生理生化反應參與逆境的響應，甜高粱SbWRKY50基因可直接與其SOS1、HKT1基因和擬南芥的SOS1基因的上游啟動子結合，通過調控離子平衡參與其抗鹽反應[43-44]。脯氨酸是植物遭受非生物脅迫時積累的一種滲透物質[45]，有助于提高植物的抗逆能力。SU 等[46]在甜高粱中分離到兩個脯氨酸合成調節(jié)酶基因（SbP5CS1、SbP5CS2）；為了進一步了解基因表達情況，利用染色體步移技術克隆到兩個基因起始密碼子上游長度為2 000 bp的啟動子序列；生物信息學分析后，兩個序列不僅包含TATA-box、CAAT-box等典型保守元件，還包含干旱、寒冷、脫落酸響應元件（ABRE）、茉莉酸甲酯響應元件（MEJA）及脅迫誘導轉錄因子結合位點MYCCONSENSUSAT、WRKY 和MYBCORE；進一步研究發(fā)現(xiàn)在干旱和高鹽脅迫下兩個基因的轉錄水平存在差異，SbP5CS1基因可以更好地提高甜高粱的抗逆能力。

鋁（AI）是植物生長過程中非必需的營養(yǎng)元素。植物根尖胼胝質的形成是響應鋁脅迫的敏感現(xiàn)象，同時也是評價植物AI毒害和耐AI性的有效生理指標[47]。已有研究表明，甜高粱根尖胼胝質的降解會受到β-1,3-葡聚糖酶基因的調控，而β-1,3-葡聚糖酶基因具有提高植物的防御作用。張慧[48]將甜高粱耐鋁和鋁敏感品系的β-1,3-葡聚糖酶基因SbGLU1在擬南芥中異源表達，結果顯示擬南芥β-1,3-葡聚糖酶活性增強，鋁在根尖上胼胝質的沉積減弱，從而提高擬南芥的耐鋁性；PCR 克隆到SbGLU1基因2 kb 的啟動子序列，啟動子序列分析表明，兩個品種啟動子核心元件TATA-box相差13 個，而增強子元件CAAT-box相差3 個，導致兩個品種間SbGLU1基因的轉錄水平存在表達差異，為后續(xù)深入揭示AI誘導甜高粱根尖胼胝質積累機制提供基礎。閆思奇[49]研究發(fā)現(xiàn)甜高粱轉錄因子SbSTOP1 可能通過結合基因SbGlu1啟動子與其2 段20 bp 的DNA 序列相互作用，調控SbGlu1的表達，促進β-1,3-葡聚糖酶催化胼胝質降解，從而提高其對Al的耐受性。

5 總結與展望

目前國內糖料作物主要以傳統(tǒng)PCR 為基礎技術克隆啟動子和cDNA 全長，但存在擴增結果易產生非特異性產物的缺點，且其過程過于依賴內切酶的選擇，相較于國外在SOE-PCR、COLD-PCR、FPNI-PCR等新型PCR 技術的應用上還存在較大差距，尤其是糖料作物還未發(fā)現(xiàn)有相關報道，因此克隆技術還有待于繼續(xù)進步。啟動子功能方面，研究方法主要是利用DNA 和蛋白質相互作用的特性進行分析，而分析系統(tǒng)經常出現(xiàn)靈敏度不高、特異性調控元件失活等問題，因此，分析系統(tǒng)的設計與優(yōu)化制約著研究的效率與準確性，通過預備性試驗建立特定作物或特定元件的分析系統(tǒng)的工作也值得重視；此外，使用某些新技術如離子共振[50]（SPR）也有利于提高啟動子和蛋白質相互作用的檢測效果，從而進一步了解啟動子的結構與功能，但在糖料作物啟動子的研究中知之甚少。相信在今后的研究中還會看到更多的技術應用在不同領域，更多技術參數(shù)、技術體系得到優(yōu)化，能夠提供更多啟動子研究的新途徑。

在研究對象方面，糖料作物啟動子克隆的研究整體尚處于初步階段，僅有甘蔗在這方面報道較多，主要研究多集中于分蘗、糖分代謝及非生物脅迫等方面，但相較于模式植物，在抗病性、發(fā)育調節(jié)及開發(fā)組織特異性啟動子等方面還不夠深入。甜菜、甜葉菊和甜高粱現(xiàn)有研究主要包括抗病性、糖分積累及非生物逆境方面，但研究還比較分散，尚未能系統(tǒng)地分析啟動子功能、表達效率及調控能力等方面，如針對啟動子的瞬時表達-轉錄活性分析、GUS-活性分析、啟動子缺失體克隆分析等重要后續(xù)分析均顯不足。與模式植物相比，糖料作物基因資源缺乏，導致捕捉序列信息困難，基因啟動子克隆耗時長、操作繁瑣，這些因素從客觀上限制了糖料作物啟動子研究的進步。此外，比較了國內外基因研究策略發(fā)現(xiàn)，國內尚處于個別基因的序列獲取和功能分析上，而國外更加側重于基因的分子機制和調控機制的研究，因此國內的啟動子研究尚缺乏必要的起始材料和信息。

植物生物技術領域的研究通常關注兩個方面：序列信息與調控機制。序列信息的豐富與調控機制的明確，是互相制約、互相依賴的兩個研究方向。對于啟動子研究而言，其克隆與結構分析對序列信息的依賴性更強，同時其功能分析也需要更多的信號轉導、轉錄因子功能等信息作為支撐；另一方面，啟動子功能的明確又將為各種分子機制研究提供至關重要的信息。因此，糖料啟動子研究一方面需要數(shù)量更多、質量更高、信息更全面的序列信息，一方面需要與各種性狀、生理過程、信號轉導過程協(xié)同研究，以取得更大、更有意義的進展。如今，隨著分子生物學的快速發(fā)展，測序技術的快速進步與成本的不斷下降，基因克隆技術和啟動子分析方法不斷創(chuàng)新，相信將會有更多糖料作物基因和啟動子序列得到深入研究，并由此為基因調控機制、啟動子內部功能元件的調控網(wǎng)絡、相關基因的信號轉導過程等方面的研究提供更多的分子理論參考。