廖紅蘭 陳 路 馬健雄

1.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，廣西 南寧 530003； 2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530025

裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)為馬鞭草科植物，藥用部位為干燥地上部分。該藥材性平味苦、微辛，具有消炎、止血、解腫毒、化濕濁等功效[1]。臨床研究[2-3]顯示，裸花紫珠對急慢性乙型肝炎的治療具有顯著療效，但其作用機(jī)制及活性成分尚未明確。研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，裸花紫珠含有多種化學(xué)成分，其中黃酮類化合物是其主要成分之一。黃酮類化合物廣泛存在于自然界的植物中，具有抗炎抗氧化等多種藥理活性?；瘜W(xué)成分研究是中藥新藥研發(fā)的基礎(chǔ)工作，有效成分的確定對進(jìn)一步提高中藥材的品質(zhì)，完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化具有深遠(yuǎn)意義。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，天然植物中所含的總黃酮能明顯降低乙型肝炎模型大鼠血清HBsAg、HBeAg水平，可改善大鼠肝損傷情形，抑制其纖維化，保護(hù)其肝功能，其作用機(jī)制與下調(diào)TGF-β/Smad3通路有關(guān)。因此，為明確裸花紫珠治療乙型肝炎的有效成分，本文采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了裸花紫珠總黃酮的提取工藝，并進(jìn)行相關(guān)藥理活性研究，以期為該藥材有效成分的篩選及深入開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 SF130型藥材粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)，KD-1018YS型超聲波清洗儀(深圳市科達(dá)超聲自動(dòng)化設(shè)備有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，循環(huán)水式真空泵(上海萬經(jīng)泵業(yè)制造有限公司)，UV752紫外分光光度計(jì)(青島精誠儀器儀表有限公司)，KDM型可調(diào)控溫電熱套(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)，F(xiàn)A2204B型電子天平(上海精密儀器儀表有限公司)，KH19A離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，101-0ABE型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司)，CO2孵箱(山東博科干細(xì)胞應(yīng)用研究院)。

1.2 材料 裸花紫珠，采自廣西南寧市郊，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園藍(lán)鳴生教授鑒定為馬鞭草科植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)。蘆丁對照品(批號(hào)：100080-201811，中國食品藥品檢定研究院)；HBsAg、HBeAg試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司)；HBV熒光定量試劑盒(達(dá)安基因公司)；拉米夫定(葛蘭素史克制藥有限公司)；試驗(yàn)用水為蒸餾水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取裸花紫珠藥材50 g，置于1000 mL圓底燒瓶中，加入70%乙醇適量，浸泡10 min，加熱回流提取2次，每次1 h。抽濾除去藥渣，合并提取液，減壓回收乙醇至約200 mL，離心5 min(10000 r/min)，離心液傾入250 mL容量瓶，70%乙醇定容，搖勻即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品10.18 mg置于50 mL容量瓶中，用適量70%乙醇溶解并定容至刻度，制得濃度為0.2036 mg/mL對照品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密量取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，各瓶依次加入5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液各1 mL和氫氧化鈉溶液10 mL，搖勻靜置。設(shè)置空白組，采用可見分光光度法進(jìn)行定量，在500 nm下測定吸光度。以吸光度為Y軸，濃度為X軸繪制標(biāo)注曲線，得回歸方程：y=10.069x+0.0412(r2=0.9997)，說明線性關(guān)系良好。如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線效果圖

2.1.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法分別于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h測定吸光度。結(jié)果吸光度RSD值為3.25%(n=6)，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液0.5 mL，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光度，重復(fù)測定6次，RSD值為1.25%(n=6)，說明該檢測方法精密度良好。

2.1.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取裸花紫珠藥材50 g，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量，重復(fù)試驗(yàn)6次。結(jié)果總黃酮平均百分含量為10.98%，RSD值為1.75%(n=6)，說明該檢測方法重現(xiàn)性良好。

2.1.7 加樣回收試驗(yàn) 稱取裸花紫珠藥材3份，每份25 g，制成含量不同的樣品(蘆丁含量為40.50 mg/g、41.25 mg/g、42.50 mg/g)，分別依次加入相同量(為已知含量的100%)的蘆丁對照品，依法制得供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法測定吸光度并計(jì)算回收率，平行試驗(yàn)3次。結(jié)果蘆丁的平均回收率為99.26%，RSD值為1.18%(n=9)，表明該檢測方法回收率良好。

2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 乙醇濃度對總黃酮百分含量影響 稱取裸花紫珠藥材50 g，用10倍量乙醇提取2次，每次1 h，分別考察40%、50%、60%、80%、90%乙醇提取效果。結(jié)果總黃酮提取率隨乙醇濃度增大而升高，60%乙醇提取率接近峰值，之后有回落趨向。如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對總黃酮百分含量影響圖

2.2.1.2 料液比對總黃酮百分含量影響 稱取裸花紫珠藥材50 g，用70%乙醇提取2次，每次1 h，分別考察料液比為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50的提取效果。結(jié)果顯示料液比1∶20提取率接近峰值，之后增速緩慢。如圖3所示。

圖3 料液比對總黃酮百分含量影響圖

2.2.1.3 提取時(shí)間對總黃酮百分含量影響 稱取裸花紫珠藥材50 g，用10倍量70%乙醇提取2次，考察提取時(shí)間0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h的提取效果。結(jié)果顯示提取2 h效果較好。如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對總黃酮百分含量影響圖

2.2.1.4 提取次數(shù)對總黃酮百分含量影響 稱取裸花紫珠藥材50 g，用10倍量70%乙醇提取1 h?？疾焯崛?次、2次、3次、4次、5次的提取效果，結(jié)果總黃酮提取率隨著提取次數(shù)的增多而升高，但提取2次后增速緩慢。如圖5所示。

2.2.2 多因素試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果及前期摸索的經(jīng)驗(yàn)，分別選擇A(乙醇濃度)、B(料液比)、C(提取時(shí)間)、D(提取次數(shù))4個(gè)因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)，綜合考察各因素水平對總黃酮得率的影響。如表1、表2、表3所示。

圖5 提取次數(shù)對總黃酮百分含量影響圖

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 L9(34)正交試驗(yàn)方案及結(jié)果表

表3 方差分析表

由表2中極差分析結(jié)果可以看出，對總黃酮得率影響的主次因素依次是：A>B>C>D，即乙醇濃度>料液比>提取時(shí)間>提取次數(shù)；表3中方差分析結(jié)果顯示，各因素均不具顯著性。綜合以上分析優(yōu)選最佳提取工藝為：A2B2C3D2，即60%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比為1∶20。

2.3 工藝驗(yàn)證 稱取3批裸花紫珠藥材各50 g，按最佳工藝條件進(jìn)行提取，每批次平行試驗(yàn)3次，結(jié)果總黃酮平均百分含量為11.29%，RSD值<2%，說明該工藝穩(wěn)定性良好。詳見表4。

表4 裸花紫珠最佳提取工藝驗(yàn)證

3 體外抗HBV活性測試

取“2.3”項(xiàng)下第2批次總黃酮提取物適量，用60%乙醇溶解，加入醋酸鉛胺沉淀過濾，濾液濃縮后過大孔樹脂、聚酰胺和硅膠柱，將分離純化后的樣品與標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁對照，測得總黃酮含量為72.6%。

3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取上述過柱后的總黃酮提取物樣品適量，制成不同濃度的含藥培養(yǎng)液。取HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×105mL-1，接種于96孔板，200 μL/孔，各孔分別加入上述含藥培養(yǎng)液200 μL，每個(gè)濃度6孔，設(shè)置空白對照組，將各組細(xì)胞置于CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)72 h。按照Reed-Muench 法計(jì)算得：TC0=250 μg/mL，TC50>500 μg/mL。即當(dāng)樣品濃度≤250 μg/mL時(shí)，裸花紫珠總黃酮提取物對HepG2.2.15無細(xì)胞毒性。

3.2 對HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的抑制作用 取上述過柱后的樣品適量，用培養(yǎng)液分別制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL含藥培養(yǎng)液。另取HepG2.2.15細(xì)胞，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1×105mL-1，接種于96孔板，200 μL/孔，各孔分別加入上述含藥培養(yǎng)液200 μL，每個(gè)濃度6孔，設(shè)置空白對照組，置CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)。72 h后，收集上清液按照HBsAg、HBeAg及HBV-DNA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在490 nm處測定各組OD值，計(jì)算HBsAg、HBeAg及HBV-DNA抑制率。HBsAg、HBeAg抑制率=(空白對照組OD值-劑量組OD值)/空白對照組OD值；HBV-DNA抑制率=(空白對照組DNA拷貝數(shù)-劑量組DNA拷貝數(shù))/空白對照組DNA拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，總黃酮提取物各劑量組對HBsAg、HBeAg及HBV-DNA均有抑制作用，與空白對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 裸花紫珠總黃酮提取物對HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的抑制作用

4 討論

裸花紫珠作為新增品種收錄于2020年版《中國藥典》(一部)，具有抗炎、止血、抑菌、抗氧化性及抗腫瘤等多種藥理作用，臨床廣泛應(yīng)用于各類型感染、出血、痤瘡、結(jié)核等疾病的治療和預(yù)防，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[9-11]。研究結(jié)果表明裸花紫珠總黃酮提取物具有一定的抗HBV活性，市場開發(fā)潛力巨大，故優(yōu)化總黃酮類的提取工藝流程，對其單味藥材及成方制劑的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。研究通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選了裸花紫珠總黃酮的提取工藝為60%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比為1∶20，工藝穩(wěn)定性良好。

提取方法的選擇，在參考現(xiàn)有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室研究實(shí)際，對比分析了乙醇回流提取法和乙醇超聲提取法等方法。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，乙醇回流提取法總黃酮提取率略高于其他提取法，故選用乙醇回流提取法。

細(xì)胞系的選擇，HepG2.2.15細(xì)胞是HepG2細(xì)胞所衍生，是抗HBV新藥開發(fā)的一個(gè)良好的體外研究工具。該細(xì)胞株是用2個(gè)頭尾相連的HBV-DNA全基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞HepG2而成，可在體外無性繁殖，能夠長期穩(wěn)定地向培養(yǎng)上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane顆粒，而且還能產(chǎn)生大量的復(fù)制中間體，是體外篩選抗HBV藥物的良好模型。在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上選擇HepG2.2.15細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[12-13]。本試驗(yàn)僅初步證明了裸花紫珠總黃酮提取物的抗HBV作用，這也進(jìn)一步印證了該藥材全株具有治療急慢性肝炎的臨床經(jīng)驗(yàn)記載，但具體活性單體成分還有待進(jìn)一步研究。