重癥肌無力相關(guān)基因和表觀遺傳學的研究進展

林晶晶， 李培軍， 陶林霜綜述， 胡蓓蕾審校

重癥肌無力(myasthenia gravis,MG)是一種由自身免疫抗體介導的疾病，作用于神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular Junction,NMJ)，其主要臨床特點是肌無力和易疲勞。MG以眼外肌的受累最為常見，隨疾病的進展，常從一組肌群開始逐漸累及其他肌群。MG發(fā)病率相對較低，全球患病率約為10～20/10萬人[1]。但MG患者有突發(fā)重癥肌無力危象的可能，會導致呼吸肌無力，引發(fā)呼吸衰竭甚至危及生命。MG疾病具有明顯的異質(zhì)性，在自身抗體方面，乙酰膽堿受體(AChR)、肌肉特異性激酶(MuSK)和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白4 (LRP4)的自身抗體已被證實具有致病性[2]?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)MG的易感性和疾病的嚴重程度與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)異?？赡芟嚓P(guān)[3]，另有研究發(fā)現(xiàn)MG的發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多種因素的綜合影響，其中遺傳因素是MG易感性的重要原因之一。隨著檢測手段的發(fā)展，表觀遺傳學在MG中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)和重視，包括非基因序列的改變引起基因表達變化和DNA甲基化以及非編碼微小RNA(microribonucleic acids,miRNAs)等。

1 重癥肌無力的相關(guān)基因

目前的遺傳學研究認為，人類白細胞抗原(HLA)基因、淋巴細胞相關(guān)蛋白4基因(CTLA4)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型基因(PTPN22)及自身抗原基因(CHRNA1)等與MG相關(guān)[4～7]。

1.1 人類白細胞抗原基因(HLA) HLA定位于人體細胞第6染色體短臂上，具有高度多態(tài)性，包括3個亞型。近50年前就有研究發(fā)現(xiàn)HLA基因組中含有大量與人類免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因，HLA被認為是與MG易感性密切相關(guān)的因素。有研究通過收集北美地區(qū)的病例，發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1與MG相關(guān)，且MG的早發(fā)型和遲發(fā)型存在重疊的疾病相關(guān)基因位點[4]。另一項研究對北歐地區(qū)的病例，發(fā)現(xiàn)HLA-B*08是主要的相關(guān)等位基因，早發(fā)型MG中相關(guān)的MHC與經(jīng)典的I類等位基因HLA-B*08有關(guān)，提示HLA-B*08為MHC中的主要風險等位基因，且在女性中HLA-B*08與早發(fā)型MG的相關(guān)性比男性更強[6]。最近的一項Meta分析發(fā)現(xiàn)LA-DRB1*16∶02等位基因與MG相關(guān)。且研究發(fā)現(xiàn)該位點與主要由自身抗體介導的疾病相關(guān)，與T細胞介導的無關(guān)[8]。這些研究表明，HLA等位基因多態(tài)性與MG臨床亞型之間的關(guān)系是復雜的，不同性別、種族、地區(qū)以及疾病類型等，HLA基因頻率是存在差異的。

1.2 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4基因(CTLA4) CTLA4基因具有多態(tài)性，CTLA4蛋白是由活化的T細胞表達的45-kD免疫球蛋白，與CD28具有明顯的一致性序列。CTLA4增加T細胞運動性，減少T細胞和抗原呈遞細胞之間的接觸時間，導致細胞因子產(chǎn)生減少。通過這種方式，CTLA4被認為可以下調(diào)T細胞活化，終止T細胞反應，并防止自身免疫[9]。Drachman等人發(fā)現(xiàn)位于CTLA4上游3.3kb的Rs231770處觀察到強關(guān)聯(lián)信號，通過實驗用CTLA4-Ig治療MG大鼠模型，證明了其有效性[4]。另外，有研究者通過分析基因型和等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)MG組的Rs733618*C等位基因頻率明顯高于對照組。Rs733618位于啟動子區(qū)域，其可促進轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合，從而影響CTLA4的剪接和基因表達[10]。以上發(fā)現(xiàn)的SNPs可能與自身免疫性疾病有關(guān)，而MG是T細胞依賴性疾病，這進一步說明了CTLA4與MG的密切相關(guān)性。近期有研究者通過收集已發(fā)表AchR陽性患者的GWAS數(shù)據(jù)分析與MG相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)了2個CTLA4附近的遺傳變異隨后的分析發(fā)現(xiàn)這些變異導致了CTLA4的低表達[11]。CTLA4基因多態(tài)性與重癥肌無力臨床亞型及重癥肌無力患者糖皮質(zhì)激素敏感性是否存在一定的相關(guān)性是未來研究的方向。

1.3 蛋白酪氨酸磷酸酶非受體22型基因(PTPN22) PTPN22基因位于1號染色體短臂(1p 13.3-1p13.1)上，編碼淋巴特異性酪氨酸磷酸酶，可抑制T細胞信號傳導。全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)證實了PTPN22與MG相關(guān)，已發(fā)現(xiàn)PTPN22的變體與MG有關(guān)[6,12]。在許多抗體介導的自身免疫性疾病中，PTPN22基因是最強的非MHC遺傳風險因子，研究者通過Meta分析發(fā)現(xiàn)PTPN22 R620W多態(tài)性與早發(fā)型MG患者發(fā)生相關(guān)[13]。而近期另一項轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)研究(TWAS)中提出PTPN22基因在晚發(fā)型MG患者中與疾病的相關(guān)性比早發(fā)型MG患者更顯著[14]。由于基因存在多態(tài)性，仍需要進一步研究，但可以看出PTPN22基因與疾病密切相關(guān)。

1.4 腫瘤壞死因子受體超家族成員11A(TNFRSF11A) TNFRSF11A編碼抗原呈遞樹突狀細胞表面表達的核因子-κB的4.5kDa受體激活劑，該受體是T細胞和樹突細胞之間相互作用的重要調(diào)節(jié)因子，對免疫監(jiān)視和調(diào)節(jié)特異性免疫都至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)TNFRSF11A與MG相關(guān)[9]，而且TNFRS11A相關(guān)信號在晚發(fā)型MG中明顯增強，但不存在于年輕MG患者。因此推測與年齡相關(guān)的局部基因表達變化容易導致對自身抗原的異常免疫反應。近期Ruth等人的GWAS分析和全轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)研究(TWAS)同樣表明TNFRSF11A位點在遲發(fā)型MG患者中比早發(fā)型MG患者中與疾病的相關(guān)性更明顯[14]。這些發(fā)現(xiàn)表明，除MHC基因外，遺傳因素在老年重癥肌無力的發(fā)病中起著重要作用。在缺乏其他證據(jù)的情況下，TNFRSF11A是否與年齡、特定的種族和其他MG亞型相關(guān)，還需要進一步研究。

1.5 自身抗原基因(CHRNA1)及自身免疫調(diào)節(jié)因子(AIRE)基因 CHRNA1是編碼AChRα亞基的基因，位于2號染色體長臂。CHRNA1中的啟動子變體編碼的AChR亞基，被發(fā)現(xiàn)與MG有關(guān)。AIRE基因的變異與自身免疫性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎和慢性甲狀旁腺功能減退癥有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)CHRNA1中的Rs16862847和Rs2229957、AIRE中的Rs3761389和CTLA4中的Rs733618均與MG顯著相關(guān)，CHRNA1的SNP中的關(guān)聯(lián)性最高。而且CHRNA1的Rs16862847的G等位基因載體是預測高水平AChR抗體的獨立危險因素。遺傳相互作用分析揭示了CHRNA1、AIRE和CTLA4對MG易感性起協(xié)同作用[5]。 近期關(guān)于MG的GWAS和TWAS的研究中發(fā)現(xiàn)CHRNA1位點在遲發(fā)型MG患者中比早發(fā)型MG患者與疾病的相關(guān)性更顯著[14]。CHRNA1編碼突變被認為是導致先天型重癥肌無力的原因之一，其特征是突觸后膜上功能型乙酰膽堿受體數(shù)量顯著減少?；趯G的研究，我們認為上述研究中發(fā)現(xiàn)的基因信號導致疾病發(fā)生可能存在以下幾種機制。例如，胸腺或其他免疫細胞中CHRNA1表達的改變可能會干擾對乙酰膽堿受體免疫耐受的發(fā)生發(fā)展或?qū)е滦叵賰?nèi)免疫產(chǎn)生。

1.6 重組人腫瘤壞死因子α誘導蛋白3(TNFAIP3)相互作用蛋白1(TNIP1)基因 也稱為A20結(jié)合抑制NF-κB激活因子(ABIN1)，位于染色體5q32-33.1上，具有共同的泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及與TNFAIP3和其他NF-κB家族成員相互作用的共有結(jié)構(gòu)域。與TNFAIP3一樣，TNIP1具有抑制活性，其過表達可降低TNF、IL-1和LPS誘導的NF-κB1活化[15]。TNIP1中第151位(Pro→Ala)的編碼變異體(Rs2233290)呈現(xiàn)了較強的風險關(guān)聯(lián)。151Pro在物種間高度保守，PolyPhen-2和其他根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的算法都預測Ala的替代是有害的。TNIP1在早發(fā)型MG中的關(guān)聯(lián)暗示了涉及蛋白依賴的NF-κB信號傳導失調(diào)的疾病機制[6]。近期有研究者通過 GWAS數(shù)據(jù)分析同樣發(fā)現(xiàn)TNIP1與EOMG相關(guān)[11]，TNIP1是TLR信號通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[16]。TLR信號的靶向治療可能為EOMG疾病的治療提供新的途徑，這值得進一步研究。

2 表觀遺傳學在MG中的應用

隨著檢測手段的發(fā)展，表觀遺傳學在疾病中的作用也逐漸被發(fā)現(xiàn)和重視，包括非基因序列的改變引起基因表達變化(如DNA甲基化等)、以及非編碼微小RNA(miRNAs)等。

2.1 DNA甲基化 在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位共價鍵結(jié)合一個甲基基團。是DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。與遺傳修飾不同，表觀遺傳變化的可逆性使它們成為治療靶點。例如，去甲基化藥物可以沉默不應該表達的基因，從而通過藥物調(diào)節(jié)甲基化來達到治療的效果[17]。胸腺瘤與多種自身免疫性疾病相關(guān)，其中約30%～40%的胸腺瘤與MG有關(guān)[18]，關(guān)于MG患者的胸腺瘤發(fā)生的表觀遺傳變化知之甚少。研究證實通過DNA啟動子甲基化可使腫瘤抑制基因沉默，例如脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)、錯配修復蛋白Mut L同源物1(MLH1)和E-鈣黏蛋白(E-cad)。有研究分析了接受胸腺腫瘤切除術(shù)MG患者的血液、腫瘤組織和正常胸腺上皮細胞中，與一碳代謝(MTHFR)和DNA甲基化(DNMT1、DNMT3A和DNMT3B)相關(guān)基因的DNA甲基化水平。發(fā)現(xiàn)MTHFR和DNMT3A啟動子在胸腺腫瘤組織中相對于血液顯示出更高的甲基化，并且MTHFR在胸腺腫瘤組織中也顯示出與相鄰正常胸腺上皮細胞相比更高的甲基化水平[19]。

前面已經(jīng)提及CTLA4和MG之間存在相關(guān)性。DNA甲基化可以調(diào)節(jié)CTLA4的表達，從而對調(diào)節(jié)Treg細胞功能具有重要意義。有研究通過測量外周血中的CTLA4甲基化水平，而發(fā)現(xiàn)MG組CTLA4甲基化的水平明顯高于對照組，且CTLA4甲基化也與MG患者的胸腺狀態(tài)有關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)干擾甲基化會導致AChR-Ab表達抑制，E-AChE的活性降低以及淋巴細胞中的Treg細胞比例降低。說明CTLA4甲基化可以通過上調(diào)AChR-Ab和E-AChE促進MG的發(fā)生，增加相關(guān)細胞因子的表達[20]。

2.2 微小RNA(miRNA) miRNA是一組進化上保守的、長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，通過沉默靶基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達[21]。miRNA可以被釋放到細胞外并在血清和血漿等體液中而易于被測量到，尋找到與MG相關(guān)的特異性miRNA可提供新的診斷途徑和可能用于疾病監(jiān)測，同時識別miRNA及其靶基因可提供MG發(fā)病機制有價值的信息并可能開辟新的治療途徑。

Huang等人通過RT-PCR技術(shù)檢測MG組和對照組外周血單個核細胞中miRNA表達情況，結(jié)果顯示miRNA-21和miRNA-126的表達存在差異[22]。Bo等通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-145-5p表達存在差異[23]，這與Wang等人在EAMG模型上發(fā)現(xiàn)下調(diào)的miR-145促進致病性T17細胞反應一致[24]，說明miRNAs可能在MG發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-7-5p是MG患者胸腺中下調(diào)最多的miRNA之一。miR-7對趨化因子配體21(CCL21)蛋白表達產(chǎn)生影響，miR-7-5p表達的降低可能是導致CCL21在MG胸腺中過表達的原因。Cron等人還觀察到miR-125a-5p在早發(fā)型MG患者的胸腺中過表達，在胸腺瘤相關(guān)MG中也上調(diào)[25]，這表明它可能參與調(diào)節(jié)胸腺瘤，而且miR-125a可能在MG患者中Treg細胞功能降低中起作用。在MG中，測量AChR或MuSK的血清自身抗體滴度不能完整的反映疾病進展。然而最近研究發(fā)現(xiàn)AchR型MG患者體液中的miR-150-5p和miR-21-5p的水平升高，且免疫抑制治療后的MG患者和胸腺切除術(shù)后獲得臨床改善的MG患者體內(nèi)的miR-150-5p水平則較低[26]。這說明在之后的研究中，類似miR-150-5p的miRNA可能被發(fā)現(xiàn)作為MG疾病改善監(jiān)測的潛在生物學標志物。miRNA的發(fā)現(xiàn)對于改進MG檢測也同樣有著重要價值和意義。

3 小結(jié)與展望

重癥肌無力在人口學特征、臨床表現(xiàn)、診斷方法陽性率及治療效果上都表現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性，而MG亞型對治療的反應都是不盡相同的。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)代醫(yī)學正逐步邁進精準醫(yī)療時代，MG相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及表觀遺傳學的應用，在未來對提高MG的診斷率及治療提供指導。而且我們需要新的治療方法，不僅需要應對嚴重和難治性MG，而且需要應對那些對現(xiàn)有治療副作用大、不能耐受的患者。MG相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)及表觀遺傳學的應用，有望對MG的診斷和治療提供新的數(shù)據(jù)和思路。