戊型肝炎病毒編碼蛋白的功能與跨種屬感染機(jī)制研究進(jìn)展

段安樂(lè)，楊永林

(1.甘肅省第三人民醫(yī)院，甘肅蘭州 730030；2.泰州市人民醫(yī)院 南通大學(xué)第五附屬醫(yī)院，江蘇泰州 225300)

戊型肝炎(Hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染宿主所引起的一種人獸共患病，HEV可以通過(guò)多種途徑從動(dòng)物性宿主傳播給人類(lèi)引發(fā)戊型肝炎[1]。HEV感染動(dòng)物后一般不產(chǎn)生明顯癥狀[1]，但禽類(lèi)HEV的感染可導(dǎo)致雞肝脾腫大及母雞產(chǎn)蛋量下降[2]。HEV從動(dòng)物性宿主跨種屬傳播是目前我國(guó)人群感染HEV的主要原因[1]。HEV對(duì)普通人群致死率約0.5%到3%，但對(duì)孕婦致死率高達(dá)30%。大量研究表明人獸共患型HEV跨種屬感染人類(lèi)后可導(dǎo)致慢性戊型肝炎及肝臟外病變[3]，因此我國(guó)研究人員對(duì)于HEV的關(guān)注逐年增加。HEV動(dòng)物性宿主的篩查發(fā)現(xiàn)豬和家兔為我國(guó)主要的HEV動(dòng)物性宿主。但由于動(dòng)物感染HEV后僅有顯微水平的肝臟炎癥而無(wú)明顯癥狀，增加了動(dòng)物HEV跨種屬感染人的風(fēng)險(xiǎn)。本文總結(jié)歸納近年來(lái)在HEV編碼蛋白的功能，HEV跨種屬感染機(jī)制，以及病毒與宿主細(xì)胞的相互作用等領(lǐng)域取得的新進(jìn)展，并對(duì)HEV可能的跨種屬感染機(jī)制提出新的看法。

1 戊型肝炎的分型與基本病毒學(xué)特征

HEV為單股正鏈不分節(jié)段RNA病毒，是嗜肝病毒科(Hepeviridae)的唯一成員。感染動(dòng)物和人的HEV可進(jìn)一步分為正嗜肝病毒屬(Orthohepevirus)，而美洲鱒魚(yú)源來(lái)源的兇猛鱒魚(yú)病毒則被單獨(dú)劃分為魚(yú)嗜肝病毒屬(Piscihepevirus)[4]。正嗜肝病毒屬的成員可以依據(jù)動(dòng)物宿主類(lèi)型及核酸序列進(jìn)一步劃分為A～D 4個(gè)種并下設(shè)基因型。 早期HEV分類(lèi)系統(tǒng)中主要感染人類(lèi)的4種HEV基因型被列為正嗜肝病毒A種1～4基因型(HEV-1-4)[5]。在這4個(gè)基因型中，HEV-1和HEV-2只感染人類(lèi)，而HEV-3和HEV-4除感染人類(lèi)外則有多種動(dòng)物宿主。其中HEV-3的主要?jiǎng)游锼拗饔胸i、鹿、貓鼬、野豬和家兔，而HEV-4主要?jiǎng)游镄运拗鳛樨i、牛和綿羊[4-5]。HEV病毒粒子呈現(xiàn)典型的20面體對(duì)稱(chēng)形態(tài)，被長(zhǎng)期認(rèn)為是一種無(wú)囊膜病毒。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)HEV以脂質(zhì)囊膜包裹的形式從被感染的細(xì)胞中釋放，因此具有特殊的囊膜結(jié)構(gòu)。此類(lèi)HEV病毒粒子被命名為準(zhǔn)囊膜化HEV(eHEV)[6]。盡管eHEV在體外培養(yǎng)系統(tǒng)上可感染細(xì)胞，但沒(méi)有證據(jù)顯示eHEV囊膜上具有囊膜蛋白。此外，有研究發(fā)現(xiàn)eHEV對(duì)易感細(xì)胞的感染效率遠(yuǎn)低于無(wú)囊膜HEV[7-8]，且識(shí)別HEV主要衣殼蛋白的抗體無(wú)法在體外試驗(yàn)上中和eHEV對(duì)靶細(xì)胞的感染[9]。因此，eHEV如何感染靶細(xì)胞有待進(jìn)一步研究。

2 HEV的基因組結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的功能

HEV基因組為7.2 kb的mRNA樣核酸，含有5′帽子結(jié)構(gòu)、3′多聚腺苷酸尾巴及非翻譯區(qū)。一般認(rèn)為HEV編碼3個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)[10]。HEV-ORF1蛋白可從病毒基因組直接翻譯，編碼與HEV復(fù)制相關(guān)的酶類(lèi)[11]。HEV-ORF2和HEV-ORF3蛋白只能從2 kb大小的病毒亞基因組mRNA翻譯且存在相互重疊現(xiàn)象[12]。HEV-ORF2主要編碼病毒的衣殼蛋白，構(gòu)成HEV病毒粒子。HEV-ORF3編碼13 ku小分子多功能的磷酸化蛋白。此外，近年新發(fā)現(xiàn)HEV-1型病毒的第2701至2787核苷酸區(qū)域含有一個(gè)非經(jīng)典內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)樣序列，可啟動(dòng)IRES下游的HEV-ORF4(第2835-3308位核苷酸，完全嵌合于ORF1)表達(dá)，但該IRES序列在人獸共患型HEV及動(dòng)物源HEV上不保守，因此其他動(dòng)物源HEV是否編碼ORF4依然未有定論。

2.1 HEV-ORF1蛋白的功能

HEV-ORF1翻譯產(chǎn)生一個(gè)含有1700氨基酸的蛋白，是HEV編碼的最大的蛋白產(chǎn)物。同源比對(duì)分析顯示HEV-ORF1含有至少8個(gè)功能結(jié)構(gòu)域[11,13]，分別為甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，Y結(jié)構(gòu)域，木瓜樣半胱氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，X結(jié)構(gòu)域，高變區(qū)結(jié)構(gòu)域，脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域，解旋酶結(jié)構(gòu)域和RNA依耐性RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域。大腸埃希氏菌表達(dá)ORF1部分功能結(jié)構(gòu)域或多結(jié)構(gòu)域截短體顯示HEV-ORF1甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，蛋白酶結(jié)構(gòu)域，解旋酶和RNA依耐性RNA聚合酶結(jié)構(gòu)域等具有相應(yīng)的酶活性[14]。HEV-ORF1蛋白也可拮抗宿主細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答信號(hào)[14]。此外，HEV-ORF1的高變區(qū)和脯氨酸富集結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生片段插入和缺失，呈現(xiàn)出多樣化特征[15]。這一區(qū)域的插入和缺失片段與病毒在體外的復(fù)制效率有關(guān)[16]。如常用的HEV-3型病毒培養(yǎng)系統(tǒng)(KernowC1 p6毒株)在以上區(qū)域插入一段174nt的人核糖體蛋白S17序列，使HEV-KernowC1 p6毒株ORF1蛋白獲得胞漿/核穿梭功能，從而增強(qiáng)病毒復(fù)制[17]。此外，不同基因型HEV-ORF1在這段高變區(qū)呈現(xiàn)出特異性差異，提示其與HEV在不同宿主的易感性及跨種屬傳播有關(guān)[17]。

2.2 HEV-ORF2蛋白及其功能

HEV-ORF2除編碼病毒衣殼蛋白外，可在HEV感染細(xì)胞內(nèi)以多種形式存在。HEV-ORF2全長(zhǎng)約660氨基酸殘基，其N(xiāo)端含有15AA的信號(hào)肽序列，可以在翻譯后將全長(zhǎng)ORF2蛋白導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，且介導(dǎo)ORF2蛋白在137、310及562位的天冬酰胺(Asn)殘基發(fā)生糖基化并以二聚體的形式從被感染分泌釋放[18-19]。分泌型HEV-ORF2蛋白無(wú)法結(jié)合HEV的細(xì)胞受體，但可結(jié)合HEV特異性抗體從而在體內(nèi)阻斷抗體對(duì)HEV的中和作用。因此，分泌性HEV-ORF2蛋白被認(rèn)為是HEV逃逸宿主體液免疫應(yīng)答的一種特殊機(jī)制。成熟的HEV衣殼是ORF2從其編碼序列內(nèi)部第16位的起始密碼子翻譯產(chǎn)生的蛋白經(jīng)過(guò)宿主蛋白酶作用去除N端前111個(gè)氨基酸殘基與C末端的52氨基酸殘基，所產(chǎn)生的56 ku單體蛋白組裝而成[12]。利用桿狀病毒重組表達(dá)的56 ku的ORF2截?cái)囿w可以在體外自組裝為病毒樣顆粒且可作為疫苗使用。

2.3 HEV-ORF3蛋白及其功能

HEV-ORF3編碼1個(gè)長(zhǎng)度112至114氨基酸的蛋白，不參與HEV核酸復(fù)制但參與HEV的釋放且調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路。早期研究發(fā)現(xiàn)用HEV感染性克隆突變獲得ORF3缺失型HEV無(wú)法在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物上建立感染。而將編碼HEV-ORF3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ORF3蛋白可結(jié)合于細(xì)胞骨架中的微管蛋白，且ORF3蛋白可通過(guò)PSAP基序與內(nèi)體篩選復(fù)合物系統(tǒng)中的關(guān)鍵蛋白腫瘤易感基因101發(fā)生互作。內(nèi)體篩選復(fù)合物系統(tǒng)主要介導(dǎo)囊膜病毒以出芽的方式從細(xì)胞釋放，提示ORF3蛋白可能利用內(nèi)體篩選復(fù)合物系統(tǒng)完成HEV釋放[13]。但這種觀點(diǎn)與早期認(rèn)為HEV顆粒無(wú)囊膜的特性不相符。HEV與甲型肝炎病毒(HAV)均具有裸露病毒粒子和特殊的準(zhǔn)囊膜化病毒粒子的兩種形態(tài)，同時(shí)有研究確認(rèn)HEV-ORF3除調(diào)控內(nèi)體篩選復(fù)合物系統(tǒng)形成類(lèi)囊膜HEV顆粒外，其具有病毒孔蛋白活性，可介導(dǎo)HEV粒子通過(guò)內(nèi)體篩選復(fù)合物系統(tǒng)從被感染細(xì)胞中釋放[20]，并且附著于病毒衣殼蛋白上形成準(zhǔn)囊膜化HEV病毒粒子。準(zhǔn)囊膜化的HEV可被識(shí)別ORF3的單克隆抗體捕獲，提示HEV-ORF3可能是HEV結(jié)構(gòu)蛋白。HEV-ORF3蛋白在HEV復(fù)制的過(guò)程也可調(diào)控包括宿主天然免疫應(yīng)答在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路[14]。序列分析顯示OrthohepevirusA種內(nèi)的8個(gè)基因型HEV編碼的ORF3氨基酸序列N端(1-60aa)相對(duì)保守，而C端(61-114aa)除高度保守的PSAP基序外其他序列存在明顯差異，提示除參與病毒釋放和準(zhǔn)囊膜粒子的形成外，不同基因型來(lái)源的ORF3蛋白還具有其他特定功能。

3 HEV編碼蛋白的功能與跨種屬感染

人獸共患型HEV及來(lái)源于動(dòng)物HEV樣病毒被分離鑒定以來(lái)，依據(jù)HEV基因型分型及宿主范圍，HEV可以被劃分為人源限制性HEV(HEV-1或HEV-2)，人獸共患型HEV(HEV-3，HEV-4與HEV-7)及動(dòng)物源限制性HEV(如禽源HEV)三類(lèi)[21]。大量研究認(rèn)為除宿主本身外，不同基因型HEV所編碼的蛋白功能在HEV跨種屬感染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

在所有病毒蛋白中，ORF1蛋白長(zhǎng)期被認(rèn)為在HEV跨種屬感染及決定HEV宿主嗜性中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用反向遺傳學(xué)手段在HEV-1感染性克隆骨架上將ORF1編碼序列替換為HEV-4型ORF1，所獲得的嵌合病毒具備在豬的腎臟細(xì)胞上復(fù)制的能力[22]。將HEV-1的5′非編碼區(qū)以及ORF1與2之間的連接區(qū)域替換為HEV-3序列后產(chǎn)生的嵌合病毒卻無(wú)法感染豬[23]。盡管HEV-1和HEV-3的ORF1不同功能結(jié)構(gòu)域片段互換所產(chǎn)生的嵌合病毒可在人肝癌細(xì)胞上進(jìn)行復(fù)制，但這些嵌合病毒均無(wú)法在動(dòng)物試驗(yàn)上跨種屬感染豬[24]，提示ORF1蛋白不是決定HEV跨種屬感染和宿主嗜性的唯一因素。

作為HEV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2蛋白的氨基酸序列在不同動(dòng)物來(lái)源的HEV中相對(duì)保守。分析顯示感染人類(lèi)的HEV-1至HEV-4在ORF2上的同源性超過(guò)86%[25]，因此ORF2蛋白最早被認(rèn)為與HEV的跨種屬感染無(wú)關(guān)。將人與豬共患型HEV-3/4的ORF2蛋白通過(guò)反向遺傳學(xué)替換為感染人的HEV-1-ORF2所產(chǎn)生的嵌合病毒無(wú)法感染豬，顯示ORF2蛋白在決定HEV宿主范圍上發(fā)揮重要作用。對(duì)ORF2蛋白的功能結(jié)構(gòu)域替換顯示將HEV-3型ORF2蛋白456-605位氨基酸替換為HEV-1型ORF2上對(duì)應(yīng)的序列后，所獲得的嵌合病毒無(wú)法在體外試驗(yàn)上結(jié)合豬源細(xì)胞[13]，證實(shí)ORF2蛋白在決定HEV宿主范圍和跨種屬感染過(guò)程中有重要作用。由于尚未鑒定出HEV的細(xì)胞受體，因此，HEV-ORF2蛋白與細(xì)胞受體之間的互作如何決定不同基因型HEV的宿主范圍有待進(jìn)一步研究。

除ORF1與ORF2蛋白外，ORF3蛋白在決定HEV宿主范圍及跨種屬感染方面同樣發(fā)揮重要作用。ORF3蛋白通過(guò)第95-98位的PSAP基序與宿主TSG101蛋白互作參與HEV釋放且該基序在不同物種HEV中應(yīng)當(dāng)高度保守[20]。但大鼠HEV-ORF3在同一位置上的氨基酸基序?yàn)镻xYPMP[13]。因此，大鼠HEV-ORF3蛋白并不結(jié)合TSG101蛋白，而是用多泡狀小體途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)病毒粒子釋放，完全不同于人類(lèi)及其他哺乳動(dòng)物源HEV，提示HEV-ORF3存在基因型特異性的功能且可能與HEV跨種屬感染或宿主范圍有關(guān)。此外，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)HEV-ORF3的C末端序列(62-114aa)在不同基因型或宿主來(lái)源的HEV中并不保守[13]，可能與病毒在不同的宿主上的適應(yīng)有關(guān)。而ORF3在HEV基因組的位置在不同種屬來(lái)源的HEV上存在明顯差異。大部分哺乳動(dòng)物源HEV的ORF2與ORF3編碼序列僅存在部分重合，而禽源HEV與美洲鱒魚(yú)源HEV的ORF3的編碼序列則完全嵌合于ORF2中，提示HEV-ORF3在不同宿主適應(yīng)的過(guò)程中存在宿主或基因型特異性的演化過(guò)程，并可能具有相應(yīng)的特殊功能，最終影響HEV宿主范圍[13]。感染人類(lèi)的4種不同基因型HEV對(duì)應(yīng)的ORF3蛋白在增強(qiáng)模式識(shí)別受體介導(dǎo)的干擾素產(chǎn)生的功能上確實(shí)存在差異[13]。因此，基因特異性的HEV-ORF3蛋白的功能可能影響到HEV在特定宿主的感染力與復(fù)制水平，進(jìn)而影響到病毒的跨種屬感染。

4 展望

自從20世紀(jì)90年代末確認(rèn)HEV存在動(dòng)物宿主并且是唯一的人獸共患肝炎病毒以來(lái)，HEV得到越來(lái)越多獸醫(yī)及醫(yī)學(xué)研究人員的重視，并且鑒定出大量的動(dòng)物源HEV及相應(yīng)的動(dòng)物宿主。我國(guó)作為HEV的高流行區(qū)域，如何預(yù)防HEV的跨種屬感染是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前尚無(wú)獸用的HEV疫苗獲批上市，且HEV的跨種屬感染機(jī)制及宿主嗜性范圍仍然有待深入研究，因此臨床獸醫(yī)及一線醫(yī)務(wù)人員對(duì)HEV認(rèn)識(shí)程度有待提高。