干預固有免疫反應治療糖尿病心肌病的研究進展

周登雙，劉嫚琪，吳子君，吳鏗

(1.廣東醫(yī)科大學研究生院，廣東 湛江 524000； 2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心血管內科，廣東 湛江 524000)

糖尿病是一種以高血糖為主要特征同時伴有胰島素缺乏和(或)胰島素抵抗的慢性進行性代謝性疾病，其中2型糖尿病約占90%，預測2040年全球有6.42億糖尿病患者，我國已確診的糖尿病患者超過1.164億，約占世界總患病人數(shù)的1/4[1]。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DbCM)是基于糖尿病，除外高血壓、冠心病等疾病引起的心肌病，表現(xiàn)為左心室肥厚和舒張功能減退，伴或不伴有收縮功能障礙。DbCM早期階段已經出現(xiàn)心肌細胞底物代謝變化，線粒體功能異常，誘發(fā)微血管內皮和心肌細胞過度免疫炎癥反應，進而導致微血管功能障礙，心肌細胞異常凋亡和間質纖維化，引起心功能不全。心肌免疫炎癥反應包括固有免疫和適應性免疫兩大類，而DbCM的免疫反應被認為傾向于前者。固有免疫又稱先天免疫，即單核巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞、自然殺傷細胞等固有免疫細胞通過模式識別受體識別病原體相關分子模式的結構或危險模式信號分子，募集活化后產生的免疫效應。干預這些免疫反應將一定程度上減輕微血管炎癥，可能有效地改善糖尿病患者受損的心功能。目前已報道部分黏附分子、趨化因子及其受體、模式識別受體在DbCM中表達升高，在動物模型體內靶向這些分子已經顯示出對心臟的保護作用，但具體作用于血管內皮細胞或心肌細胞尚不明確。現(xiàn)將近年來干預固有免疫改善DbCM的研究進行歸納整理，為減輕微血管病變以治療DbCM提供更多的依據(jù)。

1 DbCM的病理生理機制

DbCM的關鍵病理生理機制主要分為兩個方面，即局部微血管功能障礙和心肌細胞自身功能結構的異常。首先，糖尿病患者的心臟葡萄糖利用障礙，其更依賴于長鏈脂肪酸作為能量來源，但脂肪酸氧化因氧耗逐漸增加和微血管供氧障礙而導致效率低下，脂肪酸代謝中間產物累積產生毒性，鈣離子失衡，心肌細胞收縮及舒張功能障礙且異常凋亡。其次，微循環(huán)障礙是糖尿病的特異并發(fā)癥，其典型改變是微血管基底膜增厚和功能異常。良好的冠狀動脈微循環(huán)在調節(jié)冠狀動脈血流以及響應心臟氧需求方面起著基礎性作用。當糖尿病患者心臟微血管內皮細胞遭受晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products,AGEs)和脂質氧化產物攻擊，可出現(xiàn)微血管慢性炎癥，血小板活化聚集[2]，成纖維細胞增殖和細胞外基質增加，血管周圍纖維化，最終引起冠狀動脈微循環(huán)血流受阻[3]。因此微血管病變可能是糖尿病心肌出現(xiàn)廣泛性壞死的關鍵病理因素。Rajagopalan等[4]利用單光子發(fā)射計算機斷層成像心肌灌注成像對無冠心病相關癥狀的糖尿病患者進行篩查，發(fā)現(xiàn)無癥狀糖尿病患者中存在心肌血流灌注缺損的占18%。這提示在糖尿病早期已經出現(xiàn)微血管病變，且影響了心肌血流的灌注。也有研究證明，糖尿病患者冠狀動脈血管儲備以及微血管阻力儲備下降[5]。經皮冠狀動脈介入手術可以改善糖尿病患者冠狀動脈主要分支血流灌注，但難以有效改善其微血管病變。因此，在DbCM早期微血管病變已經影響了心肌血流灌注。

2 固有免疫在DbCM中的作用

固有免疫是機體抵御病原體入侵的首要防線。心臟固有免疫反應存在于其豐富的血管和致密的肌肉組織中，其重要組成因素包括危險信號、黏附分子、趨化分子、免疫細胞、細胞因子和模式識別受體等。糖尿病患者長期的糖脂代謝異常造成持續(xù)的微血管慢性炎癥。AGEs、飽和脂肪酸、游離亞細胞碎片均可形成危險模式信號，從而啟動糖尿病狀態(tài)下心臟組織的免疫反應。飽和脂肪酸或AGEs均可與髓樣分化因子2結合并激活Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4引起心肌組織的炎癥反應[6]。各種因素導致心肌細胞應激或損傷后，心臟組織或外周血中炎癥細胞通過必要的免疫反應對凋亡細胞或失效的亞細胞器進行吞噬并清除，這種適當?shù)拿庖邞饘C體有利。Nicolás-ávila等[7]研究表明，心室肌巨噬細胞通過受體型酪氨酸激酶信號攝取心肌細胞廢舊線粒體碎片及亞細胞器的囊泡，減少炎癥小體激活而維持心臟穩(wěn)態(tài)，而分離這些巨噬細胞或敲除受體型酪氨酸激酶將導致心臟收縮及舒張功能減退。若刺激持續(xù)存在或刺激強度增大，募集大量外周血來源的免疫細胞浸潤，甚至正常心肌區(qū)域也出現(xiàn)明顯炎癥細胞浸潤，則引起炎癥過度激活，細胞外基質膠原沉積和間質纖維化。研究表明，前壁心外膜植入組織工程的平滑肌細胞和內皮祖細胞雙層細胞片可以減輕1型糖尿病大鼠的微血管功能障礙和心肌間質纖維化，血小板分化群CD31陽性密度降低，血管內皮生長因子、轉化生長因子-β表達水平降低[8]，表明改善微血管炎癥是治療DbCM的有效措施。由此可見，過度的固有免疫可能伴隨糖脂代謝紊亂，且貫穿于DbCM發(fā)生發(fā)展過程中。心血管疾病是糖尿病患者死亡的主要原因,尋求DbCM的有效治療策略十分重要，而改善微血管病變始終是極其重要的治療策略。

3 干預固有免疫反應防治DbCM

固有免疫防御體系一般由組織屏障、固有免疫細胞和固有免疫分子組成。心臟富含微血管，微血管與心肌細胞之間上皮或黏膜形成的組織屏障能在感知危險相關分子模式后較快地啟動免疫細胞與內皮細胞之間的黏附并且到達靶點。而持續(xù)高糖與飽和非酯化脂肪酸的長期刺激造成微血管固有免疫細胞募集和固有免疫分子表達，如糖尿病足和糖尿病腎病的組織微血管功能破壞，進而導致局部功能逐漸衰退。干預微血管的固有免疫反應可有效減輕微血管病變而治療DbCM。

3.1干預黏附分子治療DbCM 細胞黏附分子是介導細胞間或細胞與細胞外基質間相互結合和作用的分子，參與細胞的附著和移動，細胞的發(fā)育和分化，細胞的識別活化和信號轉導，是免疫應答和炎癥發(fā)生的重要分子基礎。黏附分子在微血管固有免疫反應中起到橋接內皮細胞和固有免疫細胞的作用。糖尿病患者體內血糖升高，當?shù)鞍踪|接觸醛糖后發(fā)生糖基化和氧化并生成糖化血紅蛋白，經過分子重排形成AGEs,AGEs可與內皮細胞AGEs受體結合，從而激活核因子κB，誘導多種基因的轉錄，如內皮素1、血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，以招募單核巨噬細胞等觸發(fā)炎癥反應[9]。高糖處理的人臍靜脈內皮細胞ICAM-1和VCAM-1表達增加[10]；另外，糖尿病患者外周血中VCAM-1和中性粒細胞水平高于健康人[11]，且有并發(fā)癥的糖尿病患者血清中可溶性VCAM-1水平明顯高于無并發(fā)癥患者[12]。注射ICAM-1抗體可減輕血管緊張素Ⅱ介導的心室重構[13]，但在糖尿病模型體內尚未驗證。穿心蓮內酯和木犀草素均可降低糖尿病小鼠心肌ICAM-1和VCAM-1表達水平，同時增加左心室射血分數(shù)[14-15]。另外，葛根素、白藜蘆醇查爾酮分別降低糖尿病大鼠心肌ICAM-1和VCAM-1密度，并改善心功能[16-17]。但上述4種中草單體是否可通過調節(jié)內皮細胞分泌的ICAM-1或VCAM-1改善DbCM動物模型的心功能有待進一步探討。

3.2干預趨化因子和趨化因子受體治療DbCM 趨化因子是一類由細胞分泌的具有誘導附近反應細胞定向趨化能力的細胞因子或信號蛋白。例如單核細胞在單核細胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein，MCP)-1等作用下由微血管內皮遷移至全身組織器官，根據(jù)局部微環(huán)境不同分化發(fā)育為經典活化的M1型巨噬細胞和旁路活化的M2型巨噬細胞。人內皮細胞經高糖處理24 h后導致MCP-1增加[10]，并促進單核細胞與ECV304細胞(一種人血管內皮細胞)間的黏附[18]。對糖尿病患者分離的內皮細胞進行高糖處理后，MCP-1表達增加40%～70%[19]。MCP-1介導單核巨噬細胞的募集和激活，導致纖維化因子(如轉化生長因子-β和骨橋蛋白)的增加[20]，對心肌重構發(fā)揮強大的纖維化作用[21]。這些證據(jù)表明高糖誘導血管內皮細胞的MCP-1基因表達增加，而有趣的是高水平的血漿MCP-1與晚期心力衰竭患者的不良結局獨立相關[22]。研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1競爭抑制劑可減少炎癥性單核細胞募集，限制血管新生內膜增生[23]?？梢?，血管內皮細胞表達的MCP-1參與了糖尿病心肌炎癥反應。有研究報道，姜黃素衍生物、丁香樹脂醇、熊果酸等單體或衍生物可減少糖尿病小鼠心肌炎癥細胞浸潤并降低MCP-1表達水平，減輕心臟炎癥反應[24-26]。而靶向MCP-1能否通過改善微血管內皮功能障礙延緩糖尿病心功能惡化有待進一步研究。與趨化因子結合的CC趨化因子受體2[chemokine (C-C motif) receptor 2,CCR2]和CXC趨化因子受體4[chemokine (C-X-C motif) receptor 4,CXCR4]均屬于趨化因子受體家族成員，為7次跨膜結構的G蛋白偶聯(lián)受體，與相應的趨化因子等配體結合后，啟動胞內下游信號通路發(fā)揮效應。糖尿病小鼠心肌組織CCR2信使RNA和蛋白水平均明顯升高，敲除CCR2基因可改善心肌纖維化和心功能[27]。CXCR4拮抗劑減少糖尿病小鼠心肌α-平滑肌肌動蛋白標記的細胞數(shù)量，顯著減輕心肌纖維化[28]，且甘草素可降低糖尿病大鼠心肌組織CXCR4蛋白水平，進而改善心功能[29]。但CCR2和CXCR4等趨化因子受體與趨化因子的相互結合是否在冠狀動脈內皮細胞上發(fā)揮調節(jié)DbCM的免疫作用仍有待證實。

3.3干預模式識別受體治療DbCM 模式識別受體廣泛存在于固有免疫細胞表面、胞內器室膜上，分布于組織、血液和胞質中，它們能夠直接識別外來病原體及其產物，或發(fā)生畸變、衰老和凋亡細胞的某些共有特定模式分子結構。固有免疫細胞可通過模式識別受體結合病原體及其產物或體內靶細胞表面相關配體，介導產生非特異性抗感染、抗腫瘤和免疫調節(jié)功能，還參與適應性免疫應答的啟動和效應全過程。幾種胞質模式識別受體能夠感知病原體相關分子模式和損傷相關分子模式，導致胱天蛋白酶1的募集和激活，并誘導白細胞介素(interleukin，IL)-1β和IL-18分泌。清道夫受體CD36、TLR和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR)等模式識別受體與DbCM密切相關。

3.3.1干預清道夫受體治療DbCM 清道夫受體是一種跨膜糖蛋白，主要表達于巨噬細胞表面，通過受體介導的內吞作用將病原菌或衰老凋亡的細胞殺傷清除。白細胞分化抗原CD36是清道夫受體家族成員之一，在單核細胞、內皮細胞和表皮細胞上具有免疫學功能,但在人體內僅表達于血小板上。血小板上的CD36是氧化型低密度脂蛋白的受體，其對氧化型低密度脂蛋白具有很高的親和力。CD36基因敲除小鼠體內巨噬細胞攝取的氧化型或乙?；兔芏戎鞍诇p少75%～90%[30]。也有研究表明，AGEs誘導人巨噬細胞攝取氧化型低密度脂蛋白形成泡沫細胞，同時增加CD36的表達[31]。糖尿病患者的血小板具有高反應性，這與AGEs的積累有關[32]。以上研究提示，清道夫受體CD36可能與糖尿病患者血液中AGEs誘發(fā)的血小板高反應性相關。AGEs通過誘導小鼠血管內皮細胞CD36表達增加而引起血管功能障礙[33]。與正常血糖受試者相比，糖尿病患者中糖基化的CD36表達水平顯著升高[34]。Zhu等[35]在糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，氧化型低密度脂蛋白通過CD36的相互作用可誘導血栓形成。AGEs或氧化型低密度脂蛋白激活的CD36誘導血小板活化，隨之微血栓形成，導致糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生。因此，CD36過度激活可能是DbCM冠狀動脈微血管病變的固有免疫反應的重要環(huán)節(jié)之一。研究表明，恩格列凈可減少糖尿病大鼠心臟CD36表達，降低心臟MCP-1、腫瘤壞死因子-α和IL-6信使RNA水平[36]。由此可見，干預CD36可能影響糖尿病模型動物冠狀動脈微血管功能而改變心臟功能，但仍需后續(xù)研究證實。

3.3.2干預TLR治療DbCM TLR是單個的跨膜非催化性蛋白，可識別來源于微生物的具有保守結構的分子，是一類參與固有免疫的重要蛋白質。TLR可分兩大類，第一類為內膜型，如TLR1、TLR2、TLR4、TLR6和TLR10；第二類為內體型，如TLR3、TLR7和TLR9。其中，TLR2、TLR3、TLR4和TLR6主要表達于心肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞中，并參與炎癥反應?，F(xiàn)在越來越多的研究表明，TLR是糖尿病心肌炎癥反應中的關鍵受體。首先，機體在長期高糖條件下產生AGEs和非酯化脂肪酸等物質作為內源性配體激活TLR4，TLR4活化后與髓樣分化因子88的Toll/IL-1受體同源結構域結合[37]，使得核因子κB核易位，促進基因轉錄[38]，導致IL-6、腫瘤壞死因子-α等表達增強，產生炎癥級聯(lián)反應，最終引起組織損傷。高糖可以誘導血管內皮細胞TLR4表達增加[39]。TLR2激動劑促進人血小板聚集和與內皮細胞黏附[40]。研究發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病大鼠主動脈中TLR2與髓樣分化因子88表達增加，蛋白相互作用增強；與野生型組相比，糖尿病大鼠組主動脈平滑肌細胞中TLR2表達升高，血管收縮標志物增加[41]。在糖尿病小鼠中激活TLR2導致左心室舒張末期內徑和收縮末期內徑增大，而TLR2基因敲除糖尿病小鼠心肌中纖維化較DbCM小鼠下降[42]。另外，TLR4基因沉默或抑制可減少糖尿病模型小鼠心肌細胞凋亡，減輕氧化應激和炎癥反應[43]；而尾部靜脈注射TLR4干擾小RNA可減輕糖尿病導致的炎癥介質和黏附分子過表達，改善左心室縮短分數(shù)和射血分數(shù)[44]。研究顯示，人參皂苷和紫檀烯可降低糖尿病大鼠心肌組織TLR4、NLR蛋白(NLR protein,NLRP)3和炎癥介質蛋白水平，改善其心功能[45-46]。敲除TLR6可抑制核因子κB的轉錄活性，明顯減輕心肌纖維化[47]。Gao等[48]發(fā)現(xiàn)，體內特異性敲除心肌細胞Yes原癌相關基因后，大多數(shù)TLR表達和促炎性細胞因子分泌增加?？傊琓LR2、TLR4、TLR6等均有可能在心肌細胞和血管內皮細胞的細胞膜上參與固有免疫應答。

3.3.3干預NLR治療DbCM NLR是細胞質蛋白家族，是一類重要的胞內識別受體。NLR主要表達于單核巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和內皮細胞。NLRP1、NLRP2和NLRP3為典型的NLRP，一旦激活則磷酸化核因子κB和促分裂原活化的蛋白激酶引起細胞凋亡。NLRP2基因敲除可抑制糖尿病大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡[49]。激活后的胱天蛋白酶1介導IL-1β前體和IL-18前體切割活化成IL-1β和IL-18并釋放到細胞外,促使組織細胞的炎癥壞死[50]。研究證實,高血糖可作為刺激信號,誘導NLRP3的裝配及活化[51]。高糖等外界刺激使活性氧急劇增加,機體抗氧化的能力相對不足,引起活性氧大量集聚。受損線粒體釋放的線粒體DNA片段和活性氧作為危險信號活化NLRP3[52]。氧化型低密度脂蛋白刺激后，人臍靜脈內皮細胞NLRP3水平上調[53]。在糖尿病大鼠心肌勻漿中，IL-1β、NLRP3水平顯著上調[54]。沉默NLRP3基因后糖尿病大鼠心肌中活化的胱天蛋白酶1和IL-1β水平降低，心肌纖維化減輕，左心室收縮舒張功能障礙減輕[55]。MCC950(一種NLRP3小分子抑制劑)可明顯抑制糖尿病小鼠主動脈粥樣硬化病變，減少炎癥反應，改善血管功能[56]。在DbCM模型大鼠心肌中可見NLRP3、胱天蛋白酶1過表達,當敲除大鼠NLRP3時,大鼠心肌纖維化減少,心功能明顯改善[57]。有研究發(fā)現(xiàn),沉默糖尿病大鼠心肌細胞硫氧還蛋白相互作用蛋白可以抑制NLRP3的活化,緩解高糖導致的細胞損傷[58]。與NLRP1和NLRP2相比，NLRP3是研究更為廣泛的胞內模式識別受體，然而這些受體蛋白在心肌細胞還是血管內皮細胞表達或發(fā)揮作用尚不確定。

4 小 結

心臟微血管炎癥導致的微循環(huán)障礙是DbCM發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素之一。減輕心臟微血管炎癥在一定程度上可延緩DbCM進程。干預MCP-1、CCR2、CXCR4、TLR和NLR等均可改善實驗性糖尿病動物的心功能。干預固有免疫的部分環(huán)節(jié)可有效治療DbCM。黏附分子、趨化因子與趨化因子受體、模式識別受體等可表達于心臟微血管內皮細胞或單核巨噬細胞胞膜，而CD36表達于血小板，它們均參與微血管內或血管周圍的固有免疫反應。另外，TLR同時在心肌細胞和成纖維細胞上表達，而NLR也可以表達于單核巨噬細胞，兩者是否參與心肌細胞的固有免疫反應尚不清楚。因此，干預上述固有免疫環(huán)節(jié)是否依賴于改善微血管炎癥治療DbCM有待進一步證實。