翁雨亭，蔣秀秀，方克偉

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)研究生院，昆明 650000； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明 650000)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是指一個(gè)或多個(gè)盆腔器官(膀胱、直腸、尿道、子宮等)進(jìn)入陰道或通過陰道向下膨出[1]，通常由盆腔支撐系統(tǒng)無法提供持續(xù)的支撐力所致[2-3]。在重力(如長時(shí)間站立、運(yùn)動(dòng)后)或非重力作用下(如長時(shí)間仰臥)，POP癥狀會(huì)加重，且腹肌緊張時(shí)癥狀更明顯[4]。POP在成年女性中十分普遍，流行病學(xué)顯示，我國成年女性POP患病率約為14.80%，且絕經(jīng)后患病率隨著年齡增長而明顯升高[5]。POP嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量，給社會(huì)帶來巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。

POP的傳統(tǒng)對(duì)癥治療藥物包括三環(huán)類抗抑郁藥[7]、雌激素抑制劑[8]、α腎上腺能激動(dòng)劑、中藥[9]等，但目前尚無針對(duì)POP的特效藥物，臨床常以手術(shù)治療作為最終治療手段，約10%的有癥狀患者接受POP手術(shù)治療，手術(shù)材料常選用單絲聚丙烯網(wǎng)片，但網(wǎng)片與骨盆組織的機(jī)械特性不匹配可能導(dǎo)致網(wǎng)片排異、侵蝕以及網(wǎng)片暴露等特定并發(fā)癥[10]，這極可能是POP患者手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率較高的主要原因[11-12]。早在2011年，美國食品藥品管理局發(fā)現(xiàn)經(jīng)陰道放置網(wǎng)片治療POP存在嚴(yán)重的安全性問題，并于2016年將其歸類為“高風(fēng)險(xiǎn)”材料，并建議無癥狀POP患者僅進(jìn)行常規(guī)護(hù)理即可[13]。鑒于此，尋找組織兼容性更好、安全性更高的盆底肌重建材料是降低POP術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率的重要影響因素。現(xiàn)就細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)涂層聚丙烯網(wǎng)的特性、制備技術(shù)及其在女性盆底重建中的應(yīng)用研究和技術(shù)改良予以綜述。

1 ECM的特性及分類

ECM是常駐細(xì)胞的分泌產(chǎn)物，參與構(gòu)成復(fù)雜的由結(jié)構(gòu)和功能分子組成的獨(dú)特的組織特異性三維細(xì)胞外微環(huán)境[14]。ECM可調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀、極性、凋亡、增殖和侵襲，并使其在正常情況下發(fā)揮生物力學(xué)性能[15]，成為近年組織再生領(lǐng)域的新型材料。ECM可細(xì)分為間質(zhì)ECM(主要由纖維狀膠原、彈性蛋白和纖連蛋白組成)和專門的細(xì)胞黏附性ECM[16]。ECM亞類包括膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、ECM相關(guān)蛋白、ECM調(diào)節(jié)劑和分泌因子等，其中最重要的是膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及彈性蛋白，它們是維持結(jié)締組織強(qiáng)度及組織完整性的基礎(chǔ)[17]。

影響ECM重塑反應(yīng)的因素包括募集內(nèi)源性干細(xì)胞和祖細(xì)胞、螯合生長因子[18]、降解過程中釋放具有生物活性ECM片段[19]以及調(diào)控巨噬細(xì)胞表型來調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)[20]。研究表明，帶有ECM的支架可形成豐富的血管反應(yīng)，其中血管生成因子(血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β)有利于植入部位的細(xì)胞生長及組織愈合[21]?，F(xiàn)代技術(shù)通過凍干、酶消化等過程將ECM制成室溫下呈液體且37 ℃時(shí)呈膠凍樣的溫敏性水凝膠，其可黏附于人體局部組織并持續(xù)發(fā)揮作用[22]。目前，不同組織來源ECM水凝膠的組織重塑性均較強(qiáng)，其作為一種新型支架載體已廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。

2 ECM涂層聚丙烯網(wǎng)制備技術(shù)

2.1ECM涂層聚丙烯網(wǎng)技術(shù)原理 人工合成材料上往往沒有細(xì)胞黏附位點(diǎn)，而聚丙烯網(wǎng)片可通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法(如應(yīng)用一些親水材料或通過改變幾何形貌)提供足夠的細(xì)胞黏附力，以利于細(xì)胞在這些生物惰性材料上黏附和生長。目前ECM與聚丙烯結(jié)合形成的最常見材料為ECM涂層聚丙烯網(wǎng)。ECM中包含的生物活性因子可作為化學(xué)引誘劑，通過招募細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞反應(yīng)和生物功能，使主要蛋白質(zhì)(包括紐蛋白和肌動(dòng)蛋白)表達(dá)增加，以實(shí)現(xiàn)快速骨再生和切口愈合[23]。

2.2實(shí)驗(yàn)室ECM涂層的聚丙烯網(wǎng)制備步驟 目前實(shí)驗(yàn)室常用的ECM涂層為豬真皮ECM，其傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室制備方法為：通過機(jī)械分層去除豬全層皮膚的皮下脂肪和表皮，依次用胰蛋白酶處理6 h、70%乙醇處理10 h、3%過氧化氫處理15 min后，將其在含有1% Triton X-100的0.26%乙二胺四乙酸溶液中放置6 h后更換新鮮溶液再放置16 h，隨后在0.1%過氧乙酸4%乙醇浸泡2 h[24]。需要注意的是，每次更換溶液后都用純水沖洗，最后交替使用純水和磷酸鹽緩沖液沖洗，且所有的化學(xué)變化均在300 r/min的軌道振動(dòng)器攪拌下進(jìn)行。然后，將真皮ECM冷凍、凍干，并粉碎成40目的粉末。將經(jīng)酶解后的真皮ECM粉溶于胃蛋白酶溶液，48 h后配置成濃度為10 mg ECM/ml的溶液。將溶解后的真皮ECM置于冰上，加入一定體積的磷酸鹽緩沖液與氫氧化鈉，使其達(dá)到生理pH值和鹽濃度，然后用磷酸鹽緩沖液進(jìn)一步稀釋至8 mg ECM/ml，立即將ECM消化液加入預(yù)切的聚丙烯網(wǎng)片中，直至凝膠化發(fā)生。處理好的聚丙烯網(wǎng)置于37 ℃孵化器中30～45 min，直到真皮ECM在網(wǎng)狀物周圍和聚丙烯網(wǎng)纖維之間形成水凝膠，隨后將真皮ECM水凝膠包埋網(wǎng)片置于37 ℃環(huán)境風(fēng)干12 h，完成包覆過程。

3 ECM涂層聚丙烯網(wǎng)在女性POP手術(shù)中的優(yōu)勢及應(yīng)用研究

術(shù)后異物反應(yīng)常與纖維化、組織順應(yīng)性下降有關(guān)，而局部炎癥與聚丙烯不可降解有關(guān)，而天然ECM合成的網(wǎng)狀材料可降低纖維化程度，但存在機(jī)械強(qiáng)度較低、提供的支撐力有限、在體內(nèi)降解速率不一等問題[25]?？梢姡珽CM涂層聚丙烯網(wǎng)既不影響網(wǎng)片的機(jī)械強(qiáng)度又可減輕術(shù)后異物反應(yīng)。

3.1減少局部炎癥反應(yīng) ECM可通過限制破壞性炎癥反應(yīng)、招募所需細(xì)胞群(包括祖細(xì)胞)以及支持細(xì)胞附著、增殖和基質(zhì)生產(chǎn)來促進(jìn)特定位點(diǎn)的功能性組織重塑[26]。哺乳動(dòng)物的ECM中存在抗菌肽，與合成支架材料相比，豬小腸ECM涂層支架的持續(xù)性細(xì)菌感染抵抗力更強(qiáng)，但其作用機(jī)制尚不清楚[27]。

Wolf等[24]將傳統(tǒng)聚丙烯網(wǎng)片與豬真皮ECM涂層聚丙烯網(wǎng)分別置于雌性大鼠腹部，分別在不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠后進(jìn)行組織學(xué)和力學(xué)分析，結(jié)果顯示，ECM涂層聚丙烯網(wǎng)可有效減輕典型的異物反應(yīng)及炎癥反應(yīng)，且在不降低機(jī)械強(qiáng)度的情況下，ECM涂層聚丙烯網(wǎng)片的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑更大，即通過減少每單位面積纖維累積和纖維組織的沉積增加ECM涂層聚丙烯網(wǎng)片的柔順度，從而預(yù)防萎縮。在植入網(wǎng)片后期，已降解涂層被疏松的膠原結(jié)締組織代替，減少了初始細(xì)胞向網(wǎng)孔區(qū)域的浸潤，即ECM涂層有利于網(wǎng)片植入后短期內(nèi)的組織重塑。

為探究ECM涂層聚丙烯網(wǎng)片植入部位炎癥反應(yīng)減輕的原理，有研究采用熒光標(biāo)記法測量巨噬細(xì)胞表型并進(jìn)行組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，ECM涂層能減弱M1型巨噬細(xì)胞的反應(yīng)，并增加M2/M1與聚丙烯網(wǎng)的比值[28]。Faulk等[29]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在6個(gè)月內(nèi)，ECM涂層不影響網(wǎng)眼內(nèi)的組織強(qiáng)度，且植入網(wǎng)片部位成熟膠原沉積減少，慢性炎癥反應(yīng)減輕。Sicari等[30]發(fā)現(xiàn)，與年長動(dòng)物衍生的支架相比，年幼動(dòng)物衍生的支架更具建設(shè)性，更適合部位的組織重塑反應(yīng)，這為ECM涂層的優(yōu)化提供了新思路。

3.2促進(jìn)骨盆及陰道內(nèi)新生膠原的成熟 盆底新生膠原成熟是影響POP術(shù)后恢復(fù)的因素之一。在分子間疏水和靜電力的作用下，膠原蛋白分子易在固定溶液環(huán)境中自組裝成原纖維[31]。Darzi等[32]在骨盆解剖和陰道大小與人類相似的羊模型中，比較未修飾的PP網(wǎng)和兩種含膠原網(wǎng)片的長期組織反應(yīng)，通過免疫染色和形態(tài)計(jì)量學(xué)定量觀察巨噬細(xì)胞表型、對(duì)植入網(wǎng)狀物的反應(yīng)以及血管數(shù)量，利用Sirius Red雙折射和形態(tài)計(jì)量學(xué)定量分析顯示，ECM成分、膠原組織和網(wǎng)狀植入物界面周圍面積百分比的變化在網(wǎng)狀組織界面的微觀分子水平上存在顯著差異；與陰道內(nèi)植入的未經(jīng)修飾的聚丙烯網(wǎng)相比，網(wǎng)眼中的膠原蛋白可明顯促進(jìn)網(wǎng)眼絲周圍膠原纖維的成熟，使涂覆膠原蛋白網(wǎng)片中的總成熟膠原蛋白和未成熟膠原蛋白水平均更接近天然組織。Wang等[33]將制造的仿生膠原蛋白支架應(yīng)用于大鼠跟腱缺損模型，觀察到納米水平上隨膠原纖維形成而出現(xiàn)平行排列的膠原蛋白原纖維，同時(shí)再生肌腱的橫截面也出現(xiàn)膠原蛋白基質(zhì)沉積和重塑，提示膠原蛋白覆膜網(wǎng)片通過促進(jìn)新膠原成熟改善生物相容性和愈合反應(yīng)。

3.3維持陰道平滑肌形態(tài)與功能 ECM涂層聚丙烯網(wǎng)可有效維持陰道平滑肌的功能及形態(tài)，有利于術(shù)后盆底功能的恢復(fù)。Nagatomi等[34]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)支配對(duì)于維持正常的平滑肌形態(tài)和功能至關(guān)重要。Shaffer等[35]在恒河猴模型中比較了傳統(tǒng)聚丙烯網(wǎng)片、雙層ECM復(fù)合網(wǎng)片及單純6層ECM生物支架肌束和肌細(xì)胞形態(tài)、橫截面直徑和α平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，并采用神經(jīng)介導(dǎo)的平滑肌收縮性測試研究神經(jīng)密度，結(jié)果顯示，單獨(dú)植入聚丙烯網(wǎng)片可導(dǎo)致局部肌肉形態(tài)紊亂，并可使陰道平滑肌收縮力降低63%、陰道神經(jīng)密度降低48%、陰道α平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)降低68%；與聚丙烯網(wǎng)片植入相比，雙層ECM復(fù)合網(wǎng)片及單純6層ECM生物支架植入后陰道平滑肌的肌束更有條理，組織形態(tài)類似于假手術(shù)，且陰道α平滑肌肌動(dòng)蛋白水平升高近2倍，幾乎與假手術(shù)無差別。但單純6層ECM生物支架植入會(huì)導(dǎo)致陰道平滑肌出現(xiàn)誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，即增加小的平滑肌束數(shù)量，而肌細(xì)胞大小或收縮功能并未改變。這為探索植入的ECM復(fù)合網(wǎng)片在微觀形態(tài)、收縮特性、神經(jīng)支配方面對(duì)陰道平滑肌結(jié)構(gòu)和功能的影響機(jī)制提供了重要證據(jù)，為ECM復(fù)合網(wǎng)片在POP手術(shù)中的應(yīng)用帶來希望。

4 ECM涂層聚丙烯網(wǎng)在女性盆底手術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)改良

4.1組織原位脫細(xì)胞法(in situ decellularization of tissue，ISDoT) 脫細(xì)胞技術(shù)可將ECM從天然細(xì)胞和遺傳物質(zhì)中分離出來，同時(shí)保留ECM的固有結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及機(jī)械完整性[36]。經(jīng)脫細(xì)胞技術(shù)處理的ECM可形成天然支架，防止盆底組織塌陷，且其還可進(jìn)行再細(xì)胞化，以產(chǎn)生功能性組織或器官。

傳統(tǒng)的脫細(xì)胞技術(shù)無法提高ECM體系結(jié)構(gòu)的體內(nèi)成像分辨率，且可能影響組織的完整性和生物分子結(jié)構(gòu)。鑒于此，Mayorca-Guiliani等[37]開發(fā)了一種以血管流為導(dǎo)向的脫細(xì)胞方法，稱為ISDoT，該方法可通過小鼠的心血管系統(tǒng)將脫細(xì)胞試劑有效地遞送至任何器官或組織，其原理是利用天然組織和器官脈管系統(tǒng)有效去除細(xì)胞，防止組織塌陷，以維持組織ECM結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定；研究者通過二次諧波成像和染色觀察到，ISDoT可實(shí)現(xiàn)任何組織或解剖器官系統(tǒng)的完全脫細(xì)胞化并保留ECM結(jié)構(gòu)，這為研究天然ECM成分的組成和分布以及繪制健康和患病器官的三維(3D)空間結(jié)構(gòu)圖提供了可能。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，ISDoT可用于分析ECM的所有亞類，提示ISDoT可用于多種組織和器官，但不會(huì)丟失ECM成分；進(jìn)一步修改原始程序后，ISDoT可對(duì)包含盆底組織的33種不同組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理[38]。因此，ISDoT在組織發(fā)育和體內(nèi)平衡以及疾病發(fā)展過程中發(fā)生的ECM重塑結(jié)構(gòu)的研究中具有巨大潛力，并具有3D成像功能，有利于術(shù)后ECM網(wǎng)片的體內(nèi)定位，避免破壞ECM結(jié)構(gòu)。目前，ISDoT已在小鼠模型中應(yīng)用，隨著手術(shù)領(lǐng)域的擴(kuò)展，未來ISDoT在女性POP手術(shù)中的運(yùn)用有巨大潛力。

4.2具有可控3D結(jié)構(gòu)的納米電紡纖維ECM 電紡絲利用靜電力從聚合物溶液或熔體中形成直徑通常為1～10 μm的聚合物納米纖維或微纖維墊，其結(jié)構(gòu)與天然的ECM相似，導(dǎo)致基質(zhì)具有較高的表面積與體積比，在體內(nèi)植入時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞黏附與生長[39]。此外，電紡纖維可由多種生物或合成聚合物制成，其具體類型取決于特定的應(yīng)用和患者的病情[40]。納米纖維生產(chǎn)的靜電紡絲新技術(shù)源于工業(yè)，用于生產(chǎn)可降解聚合物，目前生物領(lǐng)域有一種具有大規(guī)模生產(chǎn)納米纖維ECM的新型工業(yè)無針多噴靜電紡絲設(shè)備，該納米纖維ECM具有可控的3D形態(tài)。研究表明，在不同加工條件(如電壓、電極距離、旋轉(zhuǎn)電極速度級(jí)電場強(qiáng)度)下，不同濃度明膠聚合物溶液經(jīng)電紡絲化后均可獲得具有較理想3D形態(tài)的3D結(jié)構(gòu)納米電紡纖維；與傳統(tǒng)平面聚合物材料相比，具有3D結(jié)構(gòu)的納米電紡纖維的生物相容性更強(qiáng)，且其表面附著的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖明顯改善；蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞中α-微管蛋白和樁蛋白的表達(dá)增加[24]。未來，無針多噴靜電紡絲技術(shù)可能用于批量生產(chǎn)具有固有生物相容性和干細(xì)胞理想整合能力的人工ECM，且其可能在臨床手術(shù)中大規(guī)模應(yīng)用。

4.3添加雌二醇的ECM涂層聚丙烯網(wǎng) 陰道壁中足夠的ECM有助于維持盆底結(jié)構(gòu)，而雌激素通過控制膠原的重塑速度在維持盆底結(jié)構(gòu)中起關(guān)鍵作用；另外，雌二醇還具有直接刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞以及上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子受體表達(dá)的促血管生成作用[41]。臨床中，晚期POP患者陰道成纖維細(xì)胞的重塑能力大大降低。Weber等[42]發(fā)現(xiàn)，術(shù)前局部使用雌激素能夠有效改善POP患者盆底結(jié)構(gòu)的完整性。Rahn等[43]研究顯示，低濃度雌激素可通過刺激陰道成纖維細(xì)胞的分裂以及改善陰道周圍血管的血供來改善盆底結(jié)構(gòu)。有研究者在電紡絲技術(shù)的基礎(chǔ)上，將脂溶性17-β-雌二醇添加于PU聚合物溶液中，在人脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種的聚合物支架上進(jìn)行為期3個(gè)月的雌二醇釋放檢測實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，從實(shí)驗(yàn)第10天開始，支架連續(xù)3個(gè)月釋放有效的低濃度雌二醇，提示添加雌二醇的ECM支架可促進(jìn)體外細(xì)胞模型陰道成纖維細(xì)胞的再生、加速盆底血供恢復(fù)[2]，但相關(guān)體內(nèi)及臨床試驗(yàn)尚未開展。

5 目前ECM涂層聚丙烯網(wǎng)用于POP手術(shù)的缺點(diǎn)

網(wǎng)狀聚合物的類型、材料重量、細(xì)絲結(jié)構(gòu)和孔徑是體內(nèi)生物相容性的重要決定因素[40]。ECM涂層聚丙烯網(wǎng)在體內(nèi)的生物相容性明顯提高。由于ECM涂層聚丙烯網(wǎng)無法達(dá)到ECM在天然生物組織中的應(yīng)變值，修補(bǔ)后的組織不能完全達(dá)到損傷前的自然狀態(tài)。同時(shí)，由于有關(guān)ECM涂層聚丙烯網(wǎng)的長期研究較少，其長期有效性及降解后的影響等尚無法評(píng)估[24]。目前暫無統(tǒng)一且高效的ECM合成與制備方法，現(xiàn)有制備方法存在難度大、費(fèi)用高等問題，極大地限制了ECM涂層聚丙烯網(wǎng)的研究和應(yīng)用[44]，且ECM涂層聚丙烯網(wǎng)的應(yīng)用大多限于動(dòng)物模型，其用于女性盆底重建還需要大量安全性研究的證實(shí)，故尚未完成臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膭?dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床試驗(yàn)是ECM涂層生物材料成熟應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵。因此，加速生物材料的發(fā)展有助于未來ECM的臨床應(yīng)用。

6 小 結(jié)

女性盆底疾病嚴(yán)重影響中老年女性生活質(zhì)量，手術(shù)治療是重度POP的終末治療手段。傳統(tǒng)的單絲聚丙烯網(wǎng)片廣泛存在排異反應(yīng)，這是引起POP手術(shù)復(fù)發(fā)率較高的原因，因此需要尋找一種可以減少炎癥及排異反應(yīng)，且機(jī)械硬度不降低、能夠維持正常盆底器官結(jié)構(gòu)及位置的材料。與傳統(tǒng)材料不同，ECM涂層生物材料在保留傳統(tǒng)材料機(jī)械硬度的同時(shí)具備一定的生物相容性，可抑制炎癥反應(yīng)、減少巨噬細(xì)胞、促進(jìn)新生膠原成熟，有助于維持平滑肌的形態(tài)與功能。國內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，ECM涂層聚丙烯網(wǎng)可改善POP術(shù)后炎癥、排異反應(yīng)及其并發(fā)癥[45]，但各種來源ECM各具優(yōu)缺點(diǎn)，故ECM涂層聚丙烯網(wǎng)在臨床盆底手術(shù)中的推廣應(yīng)用仍需大量臨床病例對(duì)照研究以及長時(shí)間隨訪的進(jìn)一步驗(yàn)證。未來，可通過各類技術(shù)改良使ECM涂層聚丙烯網(wǎng)具有更好的生物學(xué)效應(yīng)，并可通過完善ECM涂層生物材料的功能，提升其體內(nèi)植入的精確度。