低氧與免疫細胞※

李慧倩綜述 永 勝審校

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016)

低氧可以觸發(fā)免疫細胞中低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIFs)的表達并使之趨于穩(wěn)定，同時HIFs作為免疫細胞功能的調(diào)節(jié)器影響免疫反應(yīng)。闡明低氧在固有和適應(yīng)性免疫中的作用是低氧與免疫研究方向備受關(guān)注的課題，相關(guān)研究已經(jīng)衍生出許多新的觀點和結(jié)論，但部分觀點仍存有異議。本文主要就低氧在固有和適應(yīng)性免疫細胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮的作用進行綜述。

1 低氧對固有免疫細胞的影響

1.1 對中性粒細胞的影響

多項研究顯示低氧影響中性粒細胞的脫顆粒反應(yīng)。據(jù)報道，從急性缺氧的健康志愿者動脈血中分離的中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)釋放(脫顆粒，在體外)增加[1]；研究發(fā)現(xiàn)與常氧條件相比，低氧條件下分離的人外周血中性粒細胞會釋放更多的去甲腎上腺素、髓過氧化物酶和基質(zhì)金屬蛋白酶等顆粒物質(zhì)，以增強抗菌作用[2，3]；Hoenderdos等發(fā)現(xiàn)[2，4]，低氧可以通過HIF非依賴途徑增強中性粒細胞的脫顆粒反應(yīng)。目前，低氧影響中性粒細胞脫顆粒研究的總體共識是低氧通過增加顆粒胞吐作用增強中性粒細胞的抗菌功能，中性粒細胞顆粒亞型的不同，會導(dǎo)致抗菌功能的不同。低氧增強中性粒細胞的脫顆粒反應(yīng)是一把“雙刃劍”，這種反應(yīng)既能增強抗菌能力，又能在反應(yīng)過程中釋放有毒顆粒造成周圍組織廣泛損傷[5]。

此外，大量研究表明低氧對中性粒細胞的凋亡有重要影響。如曹潔等報道，中性粒細胞的凋亡在低氧環(huán)境下受到嚴重抑制，且HIF-1信號通路在持續(xù)低氧條件下是調(diào)節(jié)中性粒細胞凋亡的關(guān)鍵通路[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以抑制中性粒細胞凋亡[7]。Thompson等人發(fā)現(xiàn)[8]，中性粒細胞中HIF-2α基因的特異性缺失會增加中性粒細胞在體內(nèi)的凋亡數(shù)量。另外，體外培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示，與常氧培養(yǎng)相比，低氧-常氧的培養(yǎng)條件延遲了中性粒細胞的凋亡[9]。目前，對低氧抑制中性粒細胞凋亡的機制研究集中在與HIF、NF-κB相關(guān)的通路上。

1.2 對巨噬細胞的影響

有研究認為，巨噬細胞根據(jù)其表型特征和生物學(xué)功能的不同通常可極化為兩個亞群細胞，包括經(jīng)典激活的巨噬細胞(M1)和替代激活的巨噬細胞(M2)[10]。低氧影響巨噬細胞的極化反應(yīng)和效應(yīng)功能。例如，有研究將從健康志愿者外周血中分離誘導(dǎo)獲得的巨噬細胞置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)，并采用流式細胞術(shù)檢測M1、M2的表面標(biāo)志物表達和細胞因子釋放情況，發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)的M1細胞CD206的mRNA表達明顯高于常氧培養(yǎng)的M1細胞，其細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-12的分泌減少，而IL-1β的分泌增加；與常氧M2細胞相比，低氧M2細胞的CD80陽性細胞百分率顯著降低，其細胞表面標(biāo)志物CD206的表達水平顯著升高，細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、CCL18(趨化因子-18)和CCL24的釋放被缺氧所抑制，但IL-12與TGF-β的分泌未受影響[11]。上述研究結(jié)果提示，低氧環(huán)境阻礙巨噬細胞向經(jīng)典激活表型極化，并促進一些替代激活表型的典型分泌特征的獲得。Ke Xixian等人的研究得出了與此相似的結(jié)論：低氧可以影響巨噬細胞的極化，不同的是，低氧降低了M1細胞中促炎介質(zhì)的分泌，對M2細胞的影響不明顯[12]。眾所周知，巨噬細胞適應(yīng)低氧的過程涉及許多基因的表達，其中主要的基因是HIF-1。然而研究表明，在低氧通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化影響A549肺癌細胞惡性行為的調(diào)控過程中，參與調(diào)控的關(guān)鍵因子是p38蛋白，而不是HIF-1α[12]，這與Rodrigues等人的研究結(jié)論有出入[13，14]。Gondin等人的研究也發(fā)現(xiàn)，在無菌炎癥模型中，敲除骨髓HIF-1或HIF-2對巨噬細胞的極化反應(yīng)和效應(yīng)器功能沒有影響，提示HIF-1、HIF-2可能不是巨噬細胞極化的關(guān)鍵因子[15]。因此，以上研究提示低氧可以通過HIF依賴與非依賴途徑影響巨噬細胞的極化反應(yīng)和細胞因子分泌功能，但關(guān)于低氧如何調(diào)控巨噬細胞極化反應(yīng)過程，參與調(diào)控此過程的關(guān)鍵分子及介導(dǎo)通路是哪些等問題，有待進一步探索。

另外，一些研究證明HIF-1α在巨噬細胞感染過程中發(fā)揮重要作用。Braverman等人發(fā)現(xiàn)[16]，HIF-1α缺乏的巨噬細胞在控制IFN-γ依賴的結(jié)核分枝桿菌感染時存在缺陷，而HIF-1α蛋白水平的升高有助于協(xié)調(diào)巨噬細胞向有氧糖酵解的代謝轉(zhuǎn)移，以及大量免疫效應(yīng)物質(zhì)的產(chǎn)生，對于控制IFN-γ依賴的巨噬細胞感染至關(guān)重要。Knight等人證明，HIF-1α介導(dǎo)形成的IFN-γ依賴性巨噬細胞內(nèi)脂肪滴，是巨噬細胞對結(jié)核分枝桿菌免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因素[17]。有研究觀察到肺結(jié)核病的小鼠模型中巨噬細胞HIF-1α的表達水平升高，于是做了進一步的研究發(fā)現(xiàn)：在結(jié)核病早期，將HIF-1α阻斷會導(dǎo)致小鼠疾病病情加劇；而在結(jié)核病晚期，抑制HIF-1α則會使巨噬細胞凋亡數(shù)量增加、細菌載量降低，提示HIF-1α在結(jié)核病的早晚期發(fā)揮著不同的作用。

此外，多數(shù)學(xué)者對于HIF-1α在利什曼原蟲感染中發(fā)揮的保護性作用持一致結(jié)論。Mesquita等人證明[18]，HIF-1α的遺傳缺陷能夠?qū)е鹿撬杓毎目估猜x感染功能受損，巨噬細胞中敲除HIF-1α使巨噬細胞更容易感染利什曼原蟲[14]。Alonso等在體外觀察發(fā)現(xiàn)[19]，低氧增強了巨噬細胞對利什曼原蟲感染的抵抗力。然而，部分學(xué)者對此持有不同意見：Singh等人認為[20]，利什曼原蟲在受感染的巨噬細胞中因利用HIF-1獲得細胞內(nèi)生存優(yōu)勢而受益；Schatz等人認為[21，22]，單核吞噬細胞中的HIF-1α在利什曼原蟲誘導(dǎo)的皮膚利什曼病中具有保護作用，而在內(nèi)臟利什曼病中是有害因素，其穩(wěn)定激活促進了脾臟和骨髓中利什曼病的發(fā)生。因此，在內(nèi)臟和皮膚利什曼病中，使HIF-1α穩(wěn)定的不同背景很可能影響HIF-1α激活的功能后果，需要進一步研究來揭示最終導(dǎo)致HIF-1α依賴性固有免疫細胞功能差異的不同信號。

1.3 對樹突狀細胞的影響

多項研究表明，低氧可促進樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)的遷移和遷移能力。Kohler T等人發(fā)現(xiàn)[23]，暴露在低氧環(huán)境中的未成熟DCs以HIF-1α依賴的方式上調(diào)CCR7，而CCR7與其配體CCL21、CCL19的結(jié)合是控制DCs向引流淋巴結(jié)遷移的重要方式[24]；Irene Filippi等[25]通過單核細胞體外遷移實驗發(fā)現(xiàn)，短期缺氧可增強人的單核細胞源性DCs的遷移能力。以上研究表明，低氧可以促進未成熟DCs的遷移能力。另外，有報道稱DCs的糖酵解代謝重編程部分受到HIF-1α的調(diào)節(jié)，HIF-1α在低氧條件下穩(wěn)定，可促進糖酵解基因的表達，糖酵解的增加對DCs向引流淋巴結(jié)的遷移至關(guān)重要[26-28]。然而，也有報道顯示，低氧微環(huán)境可以通過抑制DCs膜表面膜1型金屬蛋白酶(membrane type 1 metalloprotease，MT1-MMP)和MMP-9的產(chǎn)生抑制單核細胞衍生性DCs的遷移活性，從而減弱能夠引起適度免疫反應(yīng)的刺激[29]。以上結(jié)果表明，雖然低氧影響DCs遷移能力的研究已經(jīng)得到了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，但缺乏共識，推測上述結(jié)果出現(xiàn)差異的原因可能與DCs的成熟程度及低氧刺激的時間長短有關(guān)。

此外，低氧可以影響DCs介導(dǎo)的T細胞反應(yīng)。Akil Hammami等人認為[30]，在低氧和炎癥的微環(huán)境中，HIF-1α的穩(wěn)定表達抑制DCs產(chǎn)生IL-12，從而限制了Th1細胞的發(fā)育，并干擾慢性內(nèi)臟利什曼病期間保護性Th1反應(yīng)的啟動和維護。缺失HIF-1α基因的DCs激活的T細胞釋放顆粒酶B的水平顯著降低，提示HIF-1α可以促進DCs介導(dǎo)的T細胞活化[31]。Flück K等人將敲除DCs特異性 HIF-1α基因的結(jié)腸炎小鼠模型與野生型小鼠同時暴露在低氧環(huán)境下飼養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)DCs HIF-1α的缺失損傷了其對調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)的誘導(dǎo)，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)更嚴重的腸道炎癥[32]。這些結(jié)果均表明HIF-1α的穩(wěn)定存在有助于DCs介導(dǎo)的T細胞適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生。

2 低氧對適應(yīng)性免疫細胞的影響

2.1 對B淋巴細胞的影響

低氧和HIFs在B細胞的發(fā)育和其他功能中起重要作用。B細胞在發(fā)育和分化過程中暴露于不同的氧水平。Cho等人證明，生發(fā)中心(Germinal center，GC)明區(qū)是缺氧的，這誘導(dǎo)了B細胞中HIF的表達[33]。最近的研究顯示，HIF活性在骨髓B細胞的不同發(fā)育階段有所不同。例如在人和小鼠骨髓祖B細胞和前B細胞中HIF活性較高，而在未成熟B細胞階段活性較低，且HIF-1α活性異常與B細胞譜系多樣性受限、B細胞受體(BCR)編輯和存活率降低均有關(guān)聯(lián)，B細胞發(fā)育過程中低氧依賴基因的表達與糖酵解和細胞周期基因表達的增加也有關(guān)聯(lián)[34，35]。這些結(jié)果表明HIF的活性變化對B細胞的正常發(fā)育十分重要。另外，Jellusova等人認為，在代謝適應(yīng)過程中，GC B細胞分別通過HIF和糖原合成酶激酶3(GSK3)促進糖酵解和線粒體生物合成，以支持低氧微環(huán)境中B細胞的生長和增殖[36]。在脾臟和淋巴結(jié)的GC中，靜止的B細胞受到抗原刺激后增殖、分化，產(chǎn)生高親和力抗體，并促進抗體類別轉(zhuǎn)換。通過敲除B細胞中的VHL來穩(wěn)定HIF導(dǎo)致促炎性IgG2c亞型的成熟和類別轉(zhuǎn)換受損，以及記憶B細胞和整體B細胞的形成減少[33]。Abbott等人得出了與之相反的結(jié)論，認為低氧條件下Ig的類別轉(zhuǎn)換增加[37]。因此，以上研究表明缺氧和HIF之間存在復(fù)雜的關(guān)系，上述結(jié)果的出現(xiàn)可能受刺激的類型和低氧暴露時間長短的影響。

此外，Meng等人的研究證明了HIF-1α在驅(qū)動B細胞IL-10表達及控制其在炎癥性疾病中的保護活性方面的關(guān)鍵作用[38]。Qian等人的研究也發(fā)現(xiàn)了HIF-1α誘導(dǎo)的B細胞CD11b分子的表達上調(diào)與B細胞在某些炎癥性疾病中的保護作用有關(guān)[39，40]。因此，HIF-1α對B細胞介導(dǎo)的保護性抗炎反應(yīng)具有重要作用，或許可以作為一些炎癥性疾病的治療靶點。

2.2 對T淋巴細胞的影響

目前，已有多項研究認為HIF-1α與Th17/調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞的免疫平衡調(diào)節(jié)密切相關(guān)。有研究者發(fā)現(xiàn)，木香烴內(nèi)酯通過抑制Th17細胞的糖酵解過程和分化程度降低Th17/Treg細胞的比例，從而減輕了潰瘍性結(jié)腸炎(UC)的促炎損傷，此過程中，木香烴內(nèi)酯對HIF-1α泛素化-蛋白酶體降解途徑的觸發(fā)是主要的分子機制[41]。有報道認為，芍藥湯能夠通過抑制HIF-1α的活化來調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞的免疫平衡，從而改善UC大鼠的炎癥反應(yīng)[42]。也有研究表明，敲除骨髓細胞中的HIF-1α導(dǎo)致葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的臨床癥狀減輕，并且使Tregs的存活率增高；而敲除骨髓細胞中的HIF-2α導(dǎo)致由DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎炎癥反應(yīng)加劇，且促炎因子IL-17的表達升高：提示HIF-1α與HIF-2α在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中發(fā)揮的作用不同[43]。因此，上述研究結(jié)果提示，HIF-1參與了Th17/Treg細胞的發(fā)育及分化平衡調(diào)節(jié)，準(zhǔn)確地說，T細胞中HIF-1的穩(wěn)定維持可以促進Th17細胞的發(fā)育，抑制Treg的分化及其他功能。

有報道發(fā)表了與之相反的結(jié)論，Astrid M等人將從結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌小鼠模型的結(jié)腸固有層淋巴細胞中分離出的CD4+效應(yīng)T細胞和Treg細胞，置于常氧和低氧條件下培養(yǎng)，并檢查其表型和功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸中嚴重缺氧，伴隨著CD4+效應(yīng)T細胞分化減少，Treg細胞數(shù)量和抑制活性增加；且體內(nèi)外補充研究表明，低氧條件下的T細胞刺激抑制了Th1細胞的分化、增殖和IFN-γ的產(chǎn)生，并增強了Treg的抑制能力[44]。由此可見，HIF-1影響免疫細胞間功能平衡的深入機制尚待進一步探討。此外，有研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者體內(nèi)高表達的甲基化CpG結(jié)合域蛋白2(MBD2)通過HIF-1α介導(dǎo)調(diào)節(jié)Th17細胞的分化，為中性粒細胞主導(dǎo)的炎性哮喘表觀遺傳調(diào)控提供了新的見解[45]。Ruifang Wu等人的實驗結(jié)果表明，HIF-1α參與銀屑病患者外周血單核細胞和CD4+T細胞中microRNA-210基因的轉(zhuǎn)錄激活調(diào)控，而microRNA-210的過表達能夠促進Th1、Th17細胞的分化，抑制Th2細胞的分化，進而加重銀屑病患者外周血與皮損中的免疫失衡和炎癥反應(yīng)[46]。

總之，通過以上研究能夠得出下述結(jié)論：HIF-1α是參與調(diào)節(jié)免疫細胞間功能平衡的關(guān)鍵分子，并且與炎癥性疾病的發(fā)展密不可分，或可成為多種炎癥相關(guān)性疾病的治療靶點。

此外，低氧在調(diào)節(jié)細胞毒性T(CD8+T)細胞功能中也起重要作用。實驗發(fā)現(xiàn)，低氧以HIF-1α依賴的方式影響CD8+T細胞的糖酵解代謝，缺乏HIF-1α的CD8+T細胞顯示糖酵解代謝相關(guān)基因的表達受損，同時，研究證明HIF-1α的缺失導(dǎo)致終末分化的CD8+T細胞存活率降低，其產(chǎn)生效應(yīng)細胞因子TNF-α和IFN-γ的數(shù)量也降低[47]。Yael Gropper等人的研究得出了相似的結(jié)論，低氧條件下CD8+T細胞的存活和成熟良好，效應(yīng)產(chǎn)物顆粒酶B的產(chǎn)量更高，溶細胞能力更強，且與糖酵解相關(guān)的基因表達水平更高[48]。另外，Liikanen等人的實驗結(jié)果表明CD8+T細胞中HIF的激活促進了CD8+T細胞在腫瘤組織中的駐留、積累及其抗腫瘤能力，為過繼性T細胞療法在癌癥治療中的應(yīng)用提供了新的參考依據(jù)[49]?？傊?，以上研究表明低氧對CD8+T細胞的功能具有增強作用。

然而，也有一些學(xué)者發(fā)表了相反的觀點。Multhoff G等認為，低氧通過降低CD4+、CD8+T細胞等效應(yīng)細胞的生存能力、溶細胞毒性和遷移活性，負向調(diào)節(jié)機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)[50]。Charles等人發(fā)現(xiàn)DCs中HIF-1α的條件性缺失增強了它們誘導(dǎo)CD8+T細胞反應(yīng)的能力，而表達HIF-1α的DCs則表現(xiàn)出驅(qū)動效應(yīng)CD8+T細胞功能的能力降低，產(chǎn)生的抗炎介質(zhì)增加[51]。

目前，關(guān)于低氧影響CD8+T細胞功能的具體機制尚不明了，出現(xiàn)上述兩種不同的觀點，可能與CD8+T細胞的分化狀態(tài)及激活環(huán)境有關(guān)。進一步探討低氧及HIFs參與增強或抑制CD8+T細胞效應(yīng)功能的深層機制，將為腫瘤及炎癥等相關(guān)疾病的治療提供新的思路。

3 結(jié)語

低氧影響免疫細胞功能的各個方面，在固有免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。目前，盡管多數(shù)關(guān)于低氧和HIFs與免疫細胞的研究仍處于初步探索階段，且部分結(jié)論尚存有差異，但隨著生物信息學(xué)的快速發(fā)展及分子實驗技術(shù)的不斷進步，相信低氧和HIFs調(diào)控免疫細胞功能的深層作用機理將逐步得到闡明，且HIFs在不同的免疫細胞類型和不同的環(huán)境中表現(xiàn)出的功能差異，將使其成為一個具有挑戰(zhàn)性的疾病治療靶點。