陽玉珍 馮湘玲 張妍薇 孫玥 許菁菁 陳繼華

中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 長沙 410078

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量低、骨組織退化和骨結(jié)構(gòu)破壞為特征的常見骨骼疾病，容易導(dǎo)致骨質(zhì)疏松性骨折[1-2]。骨質(zhì)疏松與年齡增長有關(guān)，隨著我國人口老齡化日趨嚴(yán)重，其已成為我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[3]。有研究預(yù)測，在2050年我國骨質(zhì)疏松性骨折患者將接近600萬人，這將成為我國沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。因此越來越多研究關(guān)注老年人骨健康。

近年來有研究表明肥胖可加劇骨質(zhì)疏松，高脂飲食可抑制老年人和大鼠骨骼系統(tǒng)中成骨細(xì)胞形成，降低骨礦物質(zhì)含量，從而對骨質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)作用[5-6]。也有研究發(fā)現(xiàn)高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠骨小梁較正常飼料組稀疏，小鼠內(nèi)臟脂肪/體重的值與骨密度呈負(fù)相關(guān)，提示高脂飲食所致的肥胖可能會(huì)引起骨質(zhì)破壞，而高脂飲食引起的炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)及氧化應(yīng)激增加可能是骨質(zhì)破壞的原因之一[7]。但高脂飲食在不同年齡階段對機(jī)體骨骼系統(tǒng)的影響是否一致，目前尚無明確結(jié)論。因此，本研究擬用正常和高脂飼料喂養(yǎng)2月齡和8月齡小鼠，觀察不同飼料對不同月齡小鼠血脂、氧化應(yīng)激和炎癥水平、骨代謝及骨微觀結(jié)構(gòu)等指標(biāo)的變化，比較高脂飼料對不同月齡小鼠骨骼健康的影響，為進(jìn)一步明確高脂飲食對不同月齡小鼠骨質(zhì)量的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料：SPF級(jí)2/8月齡雄性C57BL/6J小鼠購于北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。動(dòng)物飼料購買于Research Diets公司，高脂和正常飼料分別采用60%脂肪供能(D12492)和10%脂肪供能(D12450J)的小鼠飼料。所有程序經(jīng)中南大學(xué)湘雅公共衛(wèi)生學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)：XYGW-2018-14)。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與設(shè)備：EDTA脫鈣液(Boster，美國)；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(南京建成，中國)。全波段酶標(biāo)儀(賽默飛，美國)；倒置熒光顯微鏡(Invitrogen，美國)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)：2月齡和8月齡雄性C57BL/6J小鼠各16只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，均隨機(jī)分為兩組，每組8只，分別為6月齡正常飼料組、6月齡高脂飼料組、12月齡正常飼料組、12月齡高脂飼料組。喂養(yǎng)16周后處死，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2標(biāo)本的采集與處理：小鼠喂養(yǎng)結(jié)束后摘眼球取血，全血在4 ℃靜置8 h，于3 000 r/min離心15 min后收集上層血清。小鼠左側(cè)股骨用含生理鹽水紗布包裹后置于-20 ℃，右側(cè)股骨用4%多聚甲醛固定。

1.2.3血脂指標(biāo)檢測：用生化檢測試劑盒檢測總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白肝固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白肝固醇(HDL-C)水平。取血清加至96孔板，加入工作液后37 ℃水浴，于510 nm或546 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.4葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)：小鼠飼養(yǎng)第15周時(shí)進(jìn)行葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT)：小鼠禁食12 h后自由飲水，以2 g/kg體重腹腔注射葡萄糖溶液和0.6 U/kg體重腹腔注射胰島素溶液，分別在注射前和注射后15、30、60、120 min進(jìn)行尾靜脈采血，血糖試紙檢測血糖濃度。

1.2.5氧化應(yīng)激、炎癥和骨代謝標(biāo)志物檢測：用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Ⅰ型前膠原N端前肽(PINP)、Ⅰ型前膠原C端肽(CTX-1)的水平。用生化試劑盒檢測血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。將血清樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加至96孔板，37 ℃孵育2 h，加入各工作液和洗滌液并棄掉，加入終止液混勻后于450 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.6微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)：使用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)對小鼠左側(cè)股骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描。設(shè)定掃描參數(shù)：60 kV，133 uA，單次曝光時(shí)間500 ms，掃描分辨率9 μm，掃描角度間隔0.5度。掃描完成后分析骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨表面密度(BS/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)等指標(biāo)。

1.2.7骨組織形態(tài)學(xué)觀察：將多聚甲醛固定后的股骨至于EDTA脫鈣液中，將成功脫鈣的骨組織送至武漢塞維爾生物科技有限公司進(jìn)行包埋、切片及HE染色。將HE染色片置于顯微鏡下拍照。每組在骨小梁附近隨機(jī)選取3個(gè)100×鏡下視野對破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.8質(zhì)量控制：實(shí)驗(yàn)中各小鼠均隨機(jī)分組，飼養(yǎng)溫室(22±2)℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食、飲水。各指標(biāo)隨機(jī)選取至少3只小鼠標(biāo)本進(jìn)行檢測，各組樣品檢測在同樣條件下進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，LSD法進(jìn)行兩兩比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高脂飼料對不同月齡小鼠體型和體重的影響

飼養(yǎng)開始時(shí)，各年齡組中正常飼料組和高脂飼料組小鼠體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。飼養(yǎng)16周后，與正常飼料組相比，6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠體型均增大。從不同飼料組看，6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠的體重和體脂率均高于其正常飼料組(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 高脂飲食對不同月齡小鼠體型的影響Fig.1 Effect of HFD on body size at mice at different months of age

圖2 小鼠體重變化(A)和小鼠體重增長(B)情況Fig.2 Changes in body weight (A) and weight growth (B) of mice注：n=6，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.2 高脂飼料對不同月齡小鼠血脂血糖的影響

從不同飼料組來看，6月齡高脂飼料組的TC、TG高于其正常飼料組，12月齡高脂飼料組的TC、TG、LDL-C也高于其正常飼料組(P<0.05)。從不同月齡組看，12月齡正常飼料組的TC、TG、LDL-C均高于6月齡正常飼料組，12月齡高脂飼料組的TC、LDL-C高于6月齡高脂飼料組(P<0.05)。血清FFA在各組間差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平Table 1 Blood lipid levels of mice

6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠GTT、ITT水平較正常飼料組升高，其曲線下面積均大于正常飼料組(P<0.05)。從不同月齡組看，12月齡正常飼料組的GTT曲線下面積高于6月齡正常飼料組(P<0.05)。GTT和ITT曲線下面積均在12月齡高脂飼料組最高。見圖3。

圖3 高脂飲食對小鼠ITT(A、B)、GTT(C、D)水平的影響Fig.3 Effect of HFD on ITT (A, B) and GTT (C, D) in mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.3 高脂飼料對不同月齡小鼠骨微觀結(jié)構(gòu)的影響

與6月齡和12月齡正常飼料組相比，高脂飼料組小鼠的骨量丟失明顯，骨質(zhì)減少，骨微結(jié)構(gòu)被破壞；且12月齡各飼料組小鼠骨量也較6月齡各飼料組減少。12月齡高脂飼料組小鼠骨微結(jié)構(gòu)破壞最為明顯。見圖4。

圖4 小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端三維重建圖Fig.4 3D reconstruction of the metaphysis of the distal femur in mice

從不同飼料組看，各月齡高脂飼料組BV/TV、BS/TV低于正常飼料組(P<0.05)；從不同年齡組看，12月齡正常飼料組和高脂飼料組BV/TV和BS/TV低于6月齡組。與正常飼料組相比，12月齡高脂飼料組小鼠Tb.Th、Tb.Sp增高，Tb.N、TBPf降低(P<0.05)；12月齡高脂飼料組DA值與12月齡正常飼料組和6月齡高脂飼料組相比均降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠Micro-CT骨參數(shù)水平Table 2 Micro-CT bone parameter of mice

2.4 高脂飼料對不同月齡小鼠股骨遠(yuǎn)端組織形態(tài)的影響

6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁數(shù)目較其正常飼料組減少，均可見圓形脂肪空泡。從不同年齡組看，12月齡各飼料組骨小梁均明顯比6月齡各飼料組少。比其他組相比，12月齡高脂飼料組小鼠股骨遠(yuǎn)端脂肪空泡明顯最多，而骨小梁數(shù)目最少。見圖5。

圖5 小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色圖(100×)Fig.5 HE staining of the distal femur of mice (100×)

圖6A中紅色框內(nèi)即為破骨細(xì)胞，從不同飼料組看，6月齡和12月齡高脂飼料組破骨細(xì)胞數(shù)均比其正常飼料組增多(P<0.05)；從不同年齡組看，12月齡各飼料組破骨細(xì)胞數(shù)均多于6月齡組(P<0.05)。見圖6。

圖6 小鼠股骨遠(yuǎn)端HE染色圖中破骨細(xì)胞形態(tài)(A)和100×視野下破骨細(xì)胞數(shù)目(B)Fig.6 Morphology (A) and number in 100× field (B) of osteoclasts in HE staining of the distal femur of mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.5 高脂飼料對不同月齡小鼠氧化應(yīng)激和炎癥水平的影響

從不同飼料組看，6月齡高脂飼料組血清IL-6、TNF-α、 MDA水平均高于其正常飼料組，12月齡高脂飼料組血清IL-6、TNF-α、MDA水平也高于其正常飼料組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激和炎癥水平Table 3 Oxidative stress and inflammation levels of mice

2.6 高脂飼料對不同月齡小鼠骨代謝指標(biāo)的影響

從不同飼料組看，6月齡高脂飼料組CTX-1、PINP水平均高于其正常飼料組；12月齡高脂飼料組CTX-1低于其正常飼料組，PINP卻明顯升高(P<0.05)。從不同月齡組看，與6月齡正常飼料組相比，12月齡正常飼料組CTX-1水平升高，PINP降低。見圖7。

圖7 高脂飲食對小鼠CTX-1(A)和PINP(B)的影響Fig.7 Effect of HFD on CTX-1 (A) and PINP (B) in mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05。

3 討論

近年來調(diào)查顯示，我國居民脂肪供能比超過中國居民膳食指南(2016年)推薦的人越來越多[8]。長期攝入高脂飲食易導(dǎo)致脂肪蓄積而引起肥胖[9]。本研究通過16周的高脂飼料喂養(yǎng)小鼠以模擬高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖現(xiàn)象，飼養(yǎng)結(jié)束時(shí)發(fā)現(xiàn)高脂飼料組小鼠體重和體脂率增加，血脂水平也增加。有研究發(fā)現(xiàn)在超重和肥胖的健康人群中，骨密度會(huì)隨之下降[10-11]。與上述研究結(jié)果一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)在肥胖小鼠骨組織中脂肪空泡明顯增加，各月齡高脂飼料組小鼠較正常飼料組骨質(zhì)破壞明顯，骨小梁減少，且在12月齡高脂飼料組小鼠最為明顯，這提示高脂和高齡均可損害小鼠骨健康，且高脂與年齡增加同時(shí)存在時(shí)損害作用更明顯。

血清PINP是Ⅰ型膠原合成過程中產(chǎn)生的骨形成標(biāo)志物；CTX-1是以破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)為特點(diǎn)的代謝性骨病常用的骨吸收標(biāo)志物[12]。本研究中各月齡高脂飼料組小鼠血清PINP水平均較正常飼料組升高，且在12月齡高脂組中最高，提示高脂飲食和增齡可使小鼠體內(nèi)的PINP水平升高。有學(xué)者認(rèn)為PINP增高與髖部皮質(zhì)骨間隙增大、厚度減小有關(guān)，這可能是骨膜貼壁和皮質(zhì)重建增加所致，這些骨骼結(jié)構(gòu)變化容易致骨折[13]。6月齡高脂飼料組小鼠的CTX-1水平高于其正常飼料組，但在12月齡高脂飼料組中該值卻低于其正常飼料組，這可能與小鼠的性別和年齡有關(guān)。有研究對多名24～76歲對象檢測后發(fā)現(xiàn)年齡與CTX-1濃度降低有關(guān)，30～59歲各年齡段男性CTX-1與腰椎BMD無相關(guān)性[14-15]。雖然12月齡高脂飼料組中CTX-1值低于其正常飼料組，但HE染色顯示破骨細(xì)胞數(shù)目在12月齡高脂飼料組中最多，提示高脂飲食和高齡均促使小鼠破骨細(xì)胞增多，即高脂和年齡增加可破壞骨代謝平衡，增強(qiáng)骨吸收，使骨量減少。

在人群和動(dòng)物中均有研究發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α與骨密度呈負(fù)相關(guān)[16-17]。TNF-α可通過調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等來調(diào)控骨代謝，如刺激IL-6、M-CSF等因子釋放或參與PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)破骨細(xì)胞產(chǎn)生和成熟，從而致骨質(zhì)疏松[18-19]。MDA可反映體內(nèi)過氧化程度，Zhao等[20]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有關(guān)，骨質(zhì)疏松組的MDA水平要高于非骨質(zhì)疏松組。高脂飲食可通過影響IL-6和TNF-α等氧化應(yīng)激和炎癥因子水平而影響骨骼健康[21]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂飼料組與正常飼料組相比，小鼠血清IL-6、TNF-α和MDA水平均升高，破骨細(xì)胞數(shù)目也明顯增加，且在12月齡高脂飼料組中最高。以上結(jié)果均提示高脂飼料和高齡均可損害骨健康，且同時(shí)存在時(shí)損害作用更大。

本研究通過比較正常和高脂飼料喂養(yǎng)不同月齡小鼠后其骨骼系統(tǒng)的健康水平，來探究高脂飼料對不同月齡小鼠骨骼的影響。研究結(jié)果表明，高脂飼料會(huì)使小鼠血脂水平升高，炎癥因子表達(dá)上調(diào)，對骨健康產(chǎn)生負(fù)作用，且該負(fù)作用與年齡有關(guān)，即高脂和高齡同時(shí)存在時(shí)對骨骼健康的負(fù)作用更加顯著。