龐麗麗，石富江，田永章，秦昭恒，尹紀業(yè)

·綜述·

細胞治療產(chǎn)品非臨床致瘤性和成瘤性評價概況

龐麗麗，石富江，田永章，秦昭恒，尹紀業(yè)

細胞治療產(chǎn)品（cell therapy products，CTPs）是指用于治療人類疾病，來源、操作和臨床試驗過程符合倫理要求，按照藥品管理相關(guān)法規(guī)進行研發(fā)和注冊申報的人體來源的活細胞產(chǎn)品[1]；是從實驗室培養(yǎng)的干細胞、組織和器官中提取的，被注射到患者體內(nèi)的生物技術(shù)產(chǎn)品[2]。CTPs 主要包括干細胞和體細胞兩類，其中干細胞分為胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）、間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）和誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等，是目前正在研究的用于制備細胞治療產(chǎn)品的主要細胞類型[3]。

由于細胞治療產(chǎn)品采用個性化治療，其市場需求越來越大[4]，對干細胞及相關(guān)產(chǎn)品的安全性、有效性、可控性方面的要求不斷提高，以臨床應(yīng)用為目標的干細胞基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)成為新的研究熱點[5]。近幾年來，細胞藥物領(lǐng)域經(jīng)歷了前所未有的發(fā)展，越來越多的 CTPs 進入臨床，用于治療多種嚴重疾病[6]。至 2019 年底，全球共推出超過 27 種細胞和基因治療產(chǎn)品，已有多種細胞治療產(chǎn)品獲批上市。同時，國內(nèi)各大制藥企業(yè)積極布局產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，不斷深入對細胞治療產(chǎn)品的開發(fā)。2016 年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）發(fā)布了《細胞制品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則》（征求意見稿），首次明確將干細胞納入藥品管理。截至 2021 年 4 月，全球有 2073 種在研細胞治療藥物，比 2020 年增加了 572 種，增長 38%。

CTPs 的臨床前研究同樣遵從 GLP 規(guī)范，在非 GLP 狀況下開展的研究或檢測，應(yīng)予說明并評估非 GLP 條件對試驗結(jié)果可靠性、完整性及對細胞治療產(chǎn)品總體安全性評價的影響。申報時需要安全藥理學(xué)試驗、單次和重復(fù)給藥毒性試驗、免疫原性和免疫毒性試驗、致瘤性和成瘤性試驗以及非預(yù)期分化作用等研究數(shù)據(jù)。CTPs 的致瘤性和成瘤性評價周期長，并受到細胞來源、細胞的處理程度、給藥途徑和部位等因素的影響?；チ霭l(fā)生風(fēng)險高，是遠期毒性和臨床前毒性評價中最具挑戰(zhàn)性的試驗項目，也是該類藥物開發(fā)中的最大障礙[7]。

普遍認為，未分化細胞因具有固有的多向分化和多能性，在免疫缺陷動物中可形成畸胎瘤[8-9]。CTPs 成瘤性風(fēng)險主要與是否含有未分化細胞、非預(yù)期分化、多次傳代或轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的基因突變和不穩(wěn)定性[10]以及病毒載體（腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等）的致瘤性風(fēng)險等因素有關(guān)[11-14]。根據(jù)細胞產(chǎn)品的類型不同，一般認為 CAR-T 細胞的致瘤性和成瘤性風(fēng)險很低，評價時需重點考查其 CAR 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)帶來的致瘤性風(fēng)險，包括基因組插入的位點分析，病毒載體的致瘤性等。

本文將從致瘤性和成瘤性的角度對CTPs 臨床前毒性評價內(nèi)容進行綜述，以期為國內(nèi)細胞治療產(chǎn)品的臨床前評價提供參考。

1 致瘤性和成瘤性

《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中對致瘤性和成瘤性做了明確的定義。致瘤性（oncogenicity）：系指細胞裂解物中的化學(xué)物質(zhì)、病毒、病毒核酸或基因以及細胞成分接種動物后，導(dǎo)致被接種動物的正常細胞形成腫瘤的能力，即接種物（細胞和/或裂解物）促使正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞的能力。成瘤性（tumorigenicity）：系指細胞接種動物后在注射部分和（或）轉(zhuǎn)移部位由接種細胞本身形成腫瘤的能力。對腫瘤細胞生長的促進作用被稱為促瘤性。致癌性（carcinogenicity）通常用于藥物采用的嚙齒類動物的臨床前致癌性評價，而不適用在 CTPs 臨床前評價中。這里致瘤性評價與國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（ICH）指南 S6 中使用的致癌性研究（carcinogenicity study）同義，都是指臨床前評價中藥物引起的動物形成（良性和惡性）腫瘤的風(fēng)險。因此，習(xí)慣上將藥物開展的 2 年期的嚙齒類動物試驗稱為致癌性試驗，而 CTPs 的腫瘤風(fēng)險評估常用致瘤性和成瘤性等術(shù)語。

目前認為，對于CTPs腫瘤形成風(fēng)險的評價，2 年嚙齒類動物致癌性試驗不適用[15]。臨床前試驗普遍采用的是基于嚙齒類動物的體內(nèi)試驗和體外細胞學(xué)試驗結(jié)合的辦法。

2 細胞治療產(chǎn)品的指導(dǎo)原則

包括歐洲藥物管理局（EMA）、美國食品和藥物管理局（FDA）、日本厚生勞動?。∕HLW）等在內(nèi)的全球監(jiān)管機構(gòu)已經(jīng)提出了具體的法規(guī)和指南，以支持開發(fā) CTPs。FDA、MHLW 和世界衛(wèi)生組織（WHO）等都相繼頒布了細胞產(chǎn)品的相關(guān)指導(dǎo)原則，為臨床試驗批準和上市批準所需的質(zhì)量、安全和有效性方面提供了工作框架。

2.1 EMA 指導(dǎo)原則

2006 年，EMA 發(fā)布了細胞治療產(chǎn)品的指導(dǎo)原則，指出如果細胞轉(zhuǎn)化存在風(fēng)險，需要對細胞的增殖能力和染色體完整性開展試驗。2011 年，EMA 的先進療法委員會發(fā)布了關(guān)于干細胞治療產(chǎn)品的指導(dǎo)性文件，指出多能干細胞和成體干細胞雖有不同，但都存在形成腫瘤的固有風(fēng)險，并且培養(yǎng)條件會影響基因組的不穩(wěn)定性；還指出延長細胞培養(yǎng)時間可能對評價腫瘤發(fā)生性和染色體穩(wěn)定性有幫助。EMA 的一個工作組專門又對 MSC 治療產(chǎn)品的成瘤性進行了專題討論，并提出有些 MSC 比誘導(dǎo)的 iPSC 更容易發(fā)生染色體畸變[16]。

2.2 FDA 指導(dǎo)原則

2008 年，F(xiàn)DA 在簡報文件中討論了人類胚胎干細胞（human embryonicstem cells，hESCs）形成畸胎瘤的風(fēng)險，應(yīng)開展未分化 ESCs 雜質(zhì)檢測和不適當分化檢測等。測試方法主要包括流式細胞術(shù)和qRT-PCR 等。從 FDA 指南的角度來看，細胞移植的能力主要通過動物實驗來評估。

2013 年，F(xiàn)DA 還發(fā)布了關(guān)于研究性細胞和基因治療產(chǎn)品臨床前評估的行業(yè)指南，細胞治療產(chǎn)品涉及致瘤性和成瘤性問題，并指出細胞分化狀態(tài)、細胞操作的程度、誘導(dǎo)現(xiàn)有宿主惡性細胞和目標患者群體腫瘤形成的潛力因素需要考慮。并且在進行致瘤性和成瘤性試驗設(shè)計時，推薦選擇預(yù)期的臨床解剖部位給藥，并指出保證足夠的研究時間非常重要。

2.3 MHLW指導(dǎo)原則

MHLW《成體干細胞指南》中明確指出，評價中應(yīng)考慮細胞類型及其特征，討論腫瘤形成的可能性。要求在合適的動物模型上進行研究，但沒有提供關(guān)于評估動物模型適用性標準的說明；也可以采用體外細胞進行研究。

到目前為止，EMA 和 FDA 公布的指南中還沒有做后續(xù)的跟進（解釋或修訂），仍有一些問題尚未明確。比如，如果在檢測（體內(nèi)或體外方法）中結(jié)果顯示為陽性，即出現(xiàn)腫瘤發(fā)生的證據(jù)，后續(xù)應(yīng)采取什么樣的步驟，以及是否應(yīng)該限制對細胞的操作都無說明。Barkholt 等[17]研究認為，MSCs 的成瘤性風(fēng)險極低，只需進行體外核型鑒定即可；hiPSCs 引起畸胎瘤的固有風(fēng)險與存在的未分化的細胞、細胞操縱的程度和到達足夠數(shù)量前的傳代次數(shù)等因素有關(guān)。

2.4 中國 CTPs 法規(guī)和指導(dǎo)原則

2015 年，衛(wèi)生計生委和藥監(jiān)局頒布的《干細胞制劑質(zhì)量控制及臨床前研究指導(dǎo)原則（試行）》[18]要求應(yīng)當對高代次的或經(jīng)過體外復(fù)雜處理和修飾的自體來源以及各種異體來源的干細胞制劑進行臨床前研究階段動物致瘤性和成瘤性評價。建議選擇合適的動物模型，使用合適數(shù)量的干細胞、合理的植入途徑和足夠長的觀察期，以達到對干細胞產(chǎn)品致瘤性和成瘤性的有效評價。

2017 年，實施的《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》中，對非臨床研究中細胞治療產(chǎn)品的致瘤性和成瘤性研究做了要求：考慮到細胞治療產(chǎn)品中具體細胞種類的不同、各細胞群/亞群分型的分化狀態(tài)、生產(chǎn)過程對細胞的影響、基因修飾細胞中轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達（如各種生長因子）、細胞治療產(chǎn)品誘導(dǎo)或增強宿主體內(nèi)形成腫瘤的潛能、目標人群等因素，需要根據(jù)以上特點進行綜合考慮并評價細胞治療產(chǎn)品引起宿主細胞或細胞治療產(chǎn)品本身發(fā)生腫瘤的風(fēng)險[1]。目前，就如何選擇致瘤性/致癌性研究的動物模型尚未達成科學(xué)共識。

致瘤性試驗應(yīng)采用臨床擬用產(chǎn)品進行試驗，需確保細胞可在體內(nèi)長期存活以考察是否有潛在腫瘤形成[19]。試驗設(shè)計需注意以下方面：合適的對照組（例如陽性對照、空白對照）；每組需有足夠的動物數(shù)量，使腫瘤發(fā)生率的分析滿足統(tǒng)計學(xué)要求；需包含最大可行劑量；受試物應(yīng)到達擬定的臨床治療部位；足夠長的試驗周期。由于免疫排斥反應(yīng)，人源細胞治療產(chǎn)品的致瘤性和成瘤性試驗可考慮使用免疫缺陷的嚙齒類動物模型進行。

3 臨床前致瘤性和成瘤性評價策略

致瘤性和成瘤性試驗開始前，需要了解細胞產(chǎn)品的基本信息和質(zhì)控信息，根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的安全性評價指標或參數(shù)。致瘤性和成瘤性試驗應(yīng)與一般毒性試驗、概念驗證試驗、生物分布等研究同期開展。

3.1 動物在體試驗

動物在體致瘤性試驗設(shè)計中需要考慮：細胞的生產(chǎn)（GMP 或是實驗室產(chǎn)品），細胞質(zhì)控試驗（檢測細胞來源、細胞生長率、分化標志物的表達、基因表達和基因穩(wěn)定性等），動物模型和給藥途徑（免疫缺陷動物類型、皮下或臨床給藥相同的途徑），細胞移植方法，使用動物的性別和數(shù)量，細胞數(shù)量，陽性對照細胞的選擇和腫瘤形成的定義，觀察期，免疫組化監(jiān)測的步驟，異位腫瘤形成的檢測方法等[20]。

3.2 細胞質(zhì)量控制

臨床前使用的細胞應(yīng)與臨床擬用細胞盡量一致，且最好按 GMP 標準生產(chǎn)?？刂萍毎a(chǎn)品質(zhì)量的方法主要包括：基因芯片檢測基因表達、qRT-PCR 檢測干細胞標志物或分化標志物[21-22]、流式細胞術(shù)分析細胞表型。

基因不穩(wěn)定是影響 hCTPs 成瘤性的潛在危險，其表現(xiàn)為基因突變、基因擴增、核型異常或染色體重排的積累，以上都可能增加最終產(chǎn)物細胞惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險[23-24]。影響遺傳穩(wěn)定性的因素可能因細胞類型和（或）培養(yǎng)方法不同[25]，因此建議在使用治療前盡量縮短細胞培養(yǎng)時間和傳代次數(shù)，并評估 hCTPs 的遺傳穩(wěn)定性。采用基因組雜交技術(shù)（CGH）進行無菌試驗、支原體試驗、外顯子測序和染色體穩(wěn)定性試驗，通過 G-帶分析技術(shù)、多色熒光原位雜交顯帶技術(shù)（mBAND）或熒光原位雜交技術(shù)（FISH）進行染色體分析，可提供遺傳穩(wěn)定性的粗略指標[26]。遺傳穩(wěn)定性測試可能有助于表征 hCTPs 的質(zhì)量和安全性。然而，目前這種評估并不是強制性的，主要是為了獲得申報資料而進行。

3.3 動物模型

現(xiàn)已有大量商品化的免疫缺陷動物模型，包括 SCID（C.B-17/ Icr-scid/scid）、NOD-SCID（NOD/ShiJic-scid）和 NOD-SCID/IL-2Rγ KO（NOG）等小鼠[27]，它們都是 T 細胞、B 細胞和 NK 細胞功能的嚴重缺陷模型，在這些模型上細胞移植接種時可獲得更高的成功率。在一些短期和長期毒理學(xué)研究中，人源性細胞已經(jīng)成功地移植到免疫缺陷大鼠中[28]。有時不完全免疫缺陷（如無胸腺裸小鼠）模型或大型 SCID 豬也可選擇[29]，主要是從它們具有更大的體型能接受更多的細胞劑量的角度考慮?？梢姡瑒游锬Ｐ驮谶x擇時會考慮多個參數(shù)，每個模型的優(yōu)缺點都應(yīng)考慮在內(nèi)。細胞移植成功和存活的證據(jù)是試驗設(shè)計中要考慮的首要因素，在試驗開始前最好進行皮下荷瘤的預(yù)試和模型篩選。通常選擇 HeLa 細胞作陽性對照，推薦連續(xù)觀察 12 個月，TPD50（引起 50% 移植小鼠產(chǎn)生腫瘤的最低細胞數(shù)量）是一個重要的參考標準。

3.4 給藥途徑和給藥部位微環(huán)境的影響

臨床前給藥途徑應(yīng)與臨床給藥途徑盡量一致，可評價移植部位微環(huán)境對細胞治療產(chǎn)品的影響。動物實驗之前可在體外進行共培養(yǎng)預(yù)試驗，以評估宿主組織對腫瘤形成的影響。組織切片還可用免疫組化或 qRT-PCR 方法（如 LIN28）進行確認，其中 qRT-PCR 方法靈敏度極高。

有學(xué)者認為采用人源化的轉(zhuǎn)基因小鼠可能對提高預(yù)測能力有幫助[30]，人類腫瘤發(fā)生的微環(huán)境[31]至少包括血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-12 和成纖維細胞生長因子-2 等[32-35]，它們都具有人類特異性，并與人類受體特異性結(jié)合。此外，hCTPs 應(yīng)以實際患者接受的相同劑量或最大可行劑量施用，如難以將相同數(shù)目的細胞種植到小動物模型的情況下，可以將細胞數(shù)目縮小到最大可行劑量。或者，當 CTPs 直接注入一個特定區(qū)域（例如，特定的大腦區(qū)域、脊髓、心臟或眼睛等部位），可根據(jù)移植細胞與移植部位的體積比值計算實際需要的細胞數(shù)量。

此外，人源化細胞產(chǎn)品可通過人特異性抗體來識別移植部位的細胞存活和位置，Ki-67可反映腫瘤形成細胞的增生潛力[36]。動物實驗每組動物至少 6 只。如果目標人群是單一性別，臨床前可采用相同的單一性別開展試驗。

3.5 體外細胞評價

多種體外檢測方法（如流式細胞術(shù)和qRT-PCR）可以確定未分化的 hPSCs 的殘留數(shù)量，這些檢測方法證明是高度敏感和可靠的。為了檢測非預(yù)期轉(zhuǎn)化細胞的存在，可以使用細胞增殖實驗和數(shù)字軟瓊脂克隆形成實驗[36-37]，這兩種方法都被證明可以有效地檢測極少量中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細胞。傳統(tǒng)的軟瓊脂克隆形成實驗長期以來一直用于非接觸依賴的細胞生長和惡性細胞轉(zhuǎn)化的檢測，最近的研究表明，數(shù)字軟瓊脂克隆形成實驗對細胞轉(zhuǎn)化檢測更敏感[38]。

這些體外細胞學(xué)檢測新方法各有優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)每種產(chǎn)品以及目標患者人群進行相應(yīng)的選擇，而不應(yīng)作為強制的檢測清單來實施。與成瘤性相關(guān)的體外實驗主要包括兩個方面，即未分化 hPSCs 或 hCTPs 轉(zhuǎn)化細胞檢測的體外方法，qRT-PCR 和高效培養(yǎng)方法可用于檢測殘留 hPSCs，數(shù)字軟瓊脂克隆形成實驗方法來檢測轉(zhuǎn)化細胞，這些方法可能比目前使用嚴重免疫缺陷動物模型更敏感。體外實驗還能盡可能減少動物的使用數(shù)量，符合 3Rs 原則[39]。

4 展望

與傳統(tǒng)小分子藥物相比，CTPs 因其固有的復(fù)雜性和異質(zhì)性，無論監(jiān)管層面還是技術(shù)層面的審批都面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。臨床前需要結(jié)合動物在體試驗和基于體外細胞培養(yǎng)的試驗手段充分進行個性化研究。未來，新興技術(shù)將不斷被開發(fā)并得到應(yīng)用。在微流控芯片[40-41]（器官芯片技術(shù)）上體外培養(yǎng)人體組織，最終通過患者源性細胞和免疫細胞的結(jié)合，可以產(chǎn)生更具代表性的類人微環(huán)境。盡管該項技術(shù)還處于早期階段，但人類細胞芯片上的癌癥轉(zhuǎn)移模型有望成為一種有廣泛應(yīng)用前景的替代方法。另外，體外組織培養(yǎng)技術(shù)和離體器官培養(yǎng)技術(shù)可以為我們的試驗提供更接近于機體內(nèi)的真實環(huán)境[42]，以此獲得更加靈敏準確的數(shù)據(jù)。同時考慮進一步的試驗中，在現(xiàn)有動物實驗倫理和實驗條件允許的情況下，選擇更貼近于人類的靈長類動物進行試驗驗證，以期獲得更貼近于人類臨床試驗的數(shù)據(jù)。

總之，細胞治療產(chǎn)品作為一個新的制藥方向，需要各方共同努力，在臨床前提供基于科學(xué)的證據(jù)，以增強對再生醫(yī)學(xué)和細胞治療安全性的信心。

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100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室/國家北京藥物安全評價研究中心

尹紀業(yè)，Email：yinjiye11@163.com

2021-10-08