胡建明，張雅婷，周英，劉浩，李璇，杜光輝，劉飛虎,**

(1.云南大學 資源植物研究院，云南 昆明 650091；2.云南大學 生命科學學院，云南 昆明 650091；3.云南省西雙版納傣族自治州農(nóng)業(yè)科學研究所，云南 景洪 666100)

近幾十年來，中國工業(yè)化進程明顯加快，城市規(guī)模迅速擴張，引發(fā)的土壤重金屬污染問題日益嚴峻[1].據(jù)調(diào)查顯示，中國約有2.0×107hm2的耕地受到重金屬污染[2]，每年受到土壤重金屬污染影響的農(nóng)作物約有1.2×107t[3]，嚴重危害中國糧食生產(chǎn)安全.鉛是主要的重金屬之一，土壤中高水平的鉛等重金屬污染不僅會影響植物的正常生長，而且可能通過食物鏈傳遞進入人體[4]，引發(fā)各種高風險疾病和癌癥，危害人類健康.土壤重金屬污染直接影響食品及環(huán)境安全，因而引起了社會各界的廣泛關(guān)注.

重金屬污染土壤的植物修復技術(shù)一直是國內(nèi)外環(huán)境治理的研究熱點，而如何有效活化土壤中的重金屬是植物修復技術(shù)的關(guān)鍵[5].螯合劑是一種多齒配體，其配體如氧（―OH，―COO，―POO）、氮（―NH2，―NH）或硫（―SH，―S―S）等可以與單個金屬離子結(jié)合[6]，螯合劑與金屬離子結(jié)合后會形成多齒金屬配合物，稱為螯合物.螯合物極易溶于水，阻礙了金屬的沉淀和吸附，從而增加了植物對金屬離子的吸收作用.研究表明，在土壤中施入螯合劑，可以使重金屬離子變?yōu)橐子谥参镂盏挠行B(tài)，增加植物的吸收和積累量[7-9]，最終達到降低土壤中重金屬含量的目的.不同種類和濃度的螯合劑對植物吸收重金屬的促進效果不同，且螯合劑可能對植物本身和環(huán)境造成危害，所以篩選出合適的螯合劑及施加濃度來輔助植物吸收土壤重金屬具有重要的研究意義和潛在應(yīng)用價值.

大麻(Cannabis sativaL.)是大麻科大麻屬的一年生草本植物，其根系發(fā)達、生物量大、抗逆性強、生長速度快且生育周期短[10]，對重金屬具有較強的耐性和富集能力，因此它是一種理想的用于修復重金屬污染土壤的備選作物[11-12].有研究表明，在鉛污染為1 100 mg·kg-1的土壤中施加螯合劑可以提高大麻對重金屬鉛的積累量[13].然而，本實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，大麻在鉛質(zhì)量比2 000 mg·kg-1條件下仍能進行正常生長[14].本文基于本實驗室的前期試驗結(jié)果，選取對重金屬鉛敏感且對螯合劑耐性較強的大麻品種巴馬火麻為試驗材料[14]，通過盆栽試驗，在基質(zhì)中添加2 000 mg·kg-1的Pb(NO3)2模擬土壤重金屬鉛污染，比較該脅迫程度下施加螯合劑EDTA 或CA 對大麻生長及吸收、轉(zhuǎn)運和富集重金屬鉛能力的影響，旨在為螯合劑輔助植物修復土壤重金屬污染提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試大麻品種為巴馬火麻（BM），由廣西農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所提供；Pb(NO3)2、螯合劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na，簡寫為EDTA）和檸檬酸（CA）均為分析純試劑，購自西隴科學股份有限公司（Lot No.1609031）.稱取一定質(zhì)量的螯合劑溶于水中，定容至1 L，配置成不同濃度的螯合劑溶液（0、2、5、10、15 mmol·L-1）供試基質(zhì)為挪威JIFFY 公司生產(chǎn)的泥炭基質(zhì)，其基本化學組成（mg·kg-1）：全氮5 200、水解氮292、全磷760、有效磷338、全鉀1 780、速效鉀859、總鉛168.5、有效鉛103.5，pH=5.6.

1.2 試驗方法采用盆栽試驗，用直徑40 cm、高26 cm 帶有托盤的塑料花盆，先每盆裝商用泥炭3.5 kg 并施加15 g 復合肥m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=24∶10∶14）作為底肥，然后基于前期試驗結(jié)果，向泥炭基質(zhì)中添加2 000 mg·kg-1的Pb(NO3)2，攪拌均勻，靜置平衡2周，期間每隔5 d 澆500 mL 水濕潤基質(zhì)，促進基質(zhì)與重金屬絡(luò)合.

每盆播種30 粒精選的大麻種子，待幼苗長至3 對真葉時進行間苗，每盆留下長勢均勻的幼苗8 株.間苗后2 d 開始施加螯合劑乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）或檸檬酸（CA），濃度均為0（CK）、2、5、10 mmol·L-1和15 mmol·L-1，每個處理設(shè)3 次重復.每次每盆施螯合劑溶液500 mL（靜置自來水配制），共澆施4次，間隔1 周.根據(jù)基質(zhì)濕度進行定量澆水，保持基質(zhì)含水量為最大田間持水量的70%～80%.

1.3 測定指標及方法

1.3.1 大麻株高、莖粗和生物量的測定 最后一次澆施螯合劑1 周后收獲植株，使用卷尺和游標卡尺測量所有大麻植株的株高和莖粗.之后將根、莖、葉分別采收，裝入不同紙袋.地上部分（莖、葉）108 ℃下殺青20 min，80 ℃條件下烘干；地下部分清水洗凈后，用濾紙吸去根表水分，80 ℃烘干.

1.3.2 基質(zhì)中總鉛、有效態(tài)鉛質(zhì)量比和大麻植株中總鉛質(zhì)量比的測定 將試驗后各處理的基質(zhì)分別收集，經(jīng)風干、粉碎、過篩后交由專業(yè)單位測定基質(zhì)的總鉛有效態(tài)鉛質(zhì)量比（mg·kg-1）.取1.3.1烘干的根、莖、葉樣品，經(jīng)粉碎、過篩后交由專業(yè)單位測定大麻根、莖、葉中鉛質(zhì)量比（mg·kg-1）.大麻植株鉛含量的測定方法參照《食品安全國家標準-食品中鉛的測定》（GB 5009.12—2017）標準進行測定；基質(zhì)總鉛含量的測定方法參照《固體廢物-金屬元素的測定電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（HJ 766—2015）標準進行測定；基質(zhì)有效態(tài)鉛含量的測定方法參照《土壤8 種有效態(tài)元素的測定二乙烯三胺五乙酸浸提-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法》（HJ 804—2016）標準進行測定。

1.4 重金屬鉛吸收量、富集系數(shù)及轉(zhuǎn)移系數(shù)計算方法根據(jù)大麻對重金屬鉛的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)移系數(shù)評價螯合劑處理下大麻對重金屬鉛的富集能力，計算方法如下[15]：

鉛積累量（μg/株）=植物地上部（地下部）鉛質(zhì)量分數(shù)×植物地上部（地下部）干重；

富集系數(shù)=植物地上部分（地下部分）鉛質(zhì)量分數(shù)/基質(zhì)中總鉛質(zhì)量分數(shù)；

轉(zhuǎn)移系數(shù)=植物地上部鉛質(zhì)量分數(shù)/植物地下部鉛質(zhì)量分數(shù).

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析各處理和各項指標測定均設(shè)置3 次生物學重復，利用Microsoft Excel 2010 整理所收集到的試驗數(shù)據(jù)、建立數(shù)據(jù)表并作圖；使用IBM SPSS Statistics 25.0 進行數(shù)據(jù)單因素方差分析和LSD 進行處理間多重比較（P＜0.05）.

2 結(jié)果與分析

2.1 螯合劑對重金屬鉛的活化效果由圖1 可知，兩種螯合劑均能顯著（P＜0.05，下同）提高基質(zhì)中的有效態(tài)鉛質(zhì)量比.隨著EDTA 和CA 濃度的增加，基質(zhì)有效鉛質(zhì)量比逐漸上升，并在濃度15 mmol·L-1時有效鉛質(zhì)量比達到最大值，分別為1 233.33、1 190.33 mg·kg-1，是CK 的1.96 和1.90 倍.施 加2 mmol·L-1的EDTA 和CA時，基質(zhì)有效鉛質(zhì)量比較CK 相比，分別增加了30.50%和26.58%；在相同濃度條件時，CA 處理下的基質(zhì)有效鉛含量均低于EDTA 處理.由此可見，施加兩種螯合劑都能在一定程度上提高基質(zhì)有效鉛質(zhì)量比（活化重金屬），且EDTA 活化鉛的效果更好.

圖1 不同螯合劑及其濃度對基質(zhì)中有效態(tài)鉛質(zhì)量比的影響Fig.1 Effects of different chelators and their concentrations on the content of available Pb in the cultivation substrate

2.2 螯合劑對大麻吸收鉛的影響與CK 相比，施加螯合劑使大麻根部、莖部和葉部的鉛質(zhì)量比呈顯著性增加，且根部的鉛質(zhì)量比總是高于同濃度處理下的莖部和葉部.大麻根、莖、葉的鉛質(zhì)量比隨EDTA 和CA 濃度的增加均呈現(xiàn)先升后降的趨勢.不同的是，在EDTA 濃度為5 mmol·L-1時，大麻的根、莖、葉對重金屬鉛吸收量達到最大值，分別為428.8、307.7 mg·kg-1和287.4 mg·kg-1，是CK 的5.25、7.86 和11.59倍，此后隨著EDTA 濃度的升高，大麻對重金屬鉛的吸收量顯著降低；CA 在10 mmol·L-1濃度處理下時大麻根、莖、葉鉛吸收量最高，分別為378.1、262.5 mg·kg-1和210.1 mg·kg-1，是CK 的4.63、6.71 和8.47 倍.此外，低濃度（≤5 mmol·L-1，下同）EDTA 處理時大麻對鉛的吸收量高于CA，但高濃度（≥10 mmol·L-1，下同）EDTA 處理時，大麻對鉛的吸收量顯著降低，低于同濃度CA 處理（圖2）.

圖2 不同螯合劑及其濃度對大麻植株鉛質(zhì)量比的影響Fig.2 Effects of different chelators and their concentrations on Pb content in hemp plants

植株鉛吸收量隨基質(zhì)有效態(tài)鉛質(zhì)量比的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在基質(zhì)有效鉛質(zhì)量比為1 043 mg·kg-1時達到最大（圖3）.EDTA 處理下植株鉛吸收量最大值為363.15 mg·kg-1，CA 處理下為307.19 mg·kg-1，此時分別是CK 的6.39 和5.41倍.當基質(zhì)中有效鉛質(zhì)量比大于1 043 mg·kg-1后，植株鉛質(zhì)量比急劇下降.由此可見，EDTA 螯合鉛的能力較CA強，且在一定條件下大麻對鉛有較強的富集能力.

圖3 不同螯合劑處理下基質(zhì)有效態(tài)鉛質(zhì)量比與大麻植株鉛質(zhì)量比的關(guān)系Fig.3 The relationship between the available Pb content in the substrate and the Pb content in hemp plants under treatments of different chelators

2.3 螯合劑對重金屬鉛污染基質(zhì)中大麻生長的影響表1 為施加不同濃度螯合劑對大麻株高、莖粗、生物量的影響.從表1 中可知，大麻株高、莖粗和生物量隨EDTA 和CA 濃度的升高均呈現(xiàn)先升后降的趨勢.在濃度為2 mmol·L-1時大麻的株高、莖粗和生物量達到最大，此時EDTA 處理下相比于CK 分別增加了0.27%、2.53%和5.85%，而CA相比于CK 分別增加了1.87%、7.43%和15.17%.可見在鉛脅迫環(huán)境下施加低濃度螯合劑可以緩解重金屬鉛對植株生長所造成的傷害，此外，相同濃度條件下，CA 處理組大麻株高、莖粗和生物量均高于EDTA 處理，說明CA 的緩解作用強于EDTA.

表1 不同螯合劑及其濃度對大麻株高、莖粗和生物量的影響Tab.1 Effects of different chelators and their concentrations on the plant height,stem diameter and biomass of hemp

2.4 螯合劑對大麻積累重金屬鉛的影響如圖4所示，大麻根、莖、葉的鉛積累量隨螯合劑濃度的增加均呈先升高后降低的趨勢，且莖部的積累量總是高于同處理的根部和葉部.在EDTA 為5 mmol·L-1時，大麻根、莖、葉的鉛積累量達到最大值，分別為1 460.8、3 655.4 μg/株和3 295.9 μg/株，是CK 的4.21、7.12、10.56 倍；CA 處理下，大麻對重金屬鉛的最大積累量出現(xiàn)在CA 濃度為10 mmol·L-1時，分別為1 222.4、3 553.2 μg/株和2 183.6 μg/株，是CK 的3.36、6.23、6.36 倍.此外，低濃度EDTA 處理下大麻鉛積累量高于CA，但高濃度EDTA 處理下，大麻鉛積累量顯著降低，低于同濃度CA 處理.

圖4 不同螯合劑及其濃度對大麻植株鉛積累量的影響Fig.4 Effects of different chelators and their concentrations on Pb accumulation in hemp plants

2.5 螯合劑對大麻富集和轉(zhuǎn)運鉛能力的影響由表2 可知，大麻地上部分、地下部分以及單株富集系數(shù)隨螯合劑濃度增加均呈先上升后下降的趨勢，而且地下部分富集系數(shù)高于地上部分.在EDTA 濃度為5 mmol·L-1時，大麻的地下部、地上部及單株富集系數(shù)均達到最大，分別為0.214、0.149 和0.171，是CK的5.25、9.30 和7.03 倍；在CA 濃度為10 mmol·L-1時，大麻的相應(yīng)參數(shù)達到最大，分別為0.189、0.118和0.142，是CK 的4.63、7.39 和5.84 倍.施加濃度為2 mmol·L-1的EDTA 和CA時，大麻的轉(zhuǎn)運系數(shù)達到最大，較CK 分別提高了79.16%和75.11%.此外，相同濃度條件下，EDTA處理組大麻轉(zhuǎn)運系數(shù)高于CA.因此，適當施加兩種螯合劑均可以提高大麻對鉛的富集能力和鉛從根部向地上部轉(zhuǎn)移的能力，且EDTA 的強化效果較CA 更好一些.

表2 不同螯合劑及濃度對大麻鉛富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響Tab.2 Effects of different chelators and their concentrations on Pb enrichment coefficient and transport coefficient of hemp

3 討論

土壤中的鉛具有穩(wěn)定[16]、易積累和不可逆等特性[17]，植物過量吸收會對植物的生理生長產(chǎn)生毒害.重金屬在土壤中與土壤的固相部分結(jié)合緊密，導致其很難被植物吸收利用.螯合劑是含有多齒配體的高分子化合物，其配體可以和單個金屬離子結(jié)合，從而打破重金屬離子與土壤固相的結(jié)合，增加土壤中重金屬離子濃度，提高重金屬離子的生物有效性，促進植物對金屬離子的吸收作用[18].本試驗中，在鉛脅迫環(huán)境下施加不同濃度（0、2、5、10 mmol·L-1和15 mmol·L-1）、不同種類（EDTA 和CA）的螯合劑，發(fā)現(xiàn)不同螯合劑在提高基質(zhì)有效態(tài)鉛方面均能發(fā)揮較好的效果.結(jié)合2 種螯合劑對大麻吸收重金屬鉛的影響來看，發(fā)現(xiàn)低濃度的EDTA處理下大麻對重金屬鉛的吸收量高于CA 處理，但高濃度的EDTA 處理下，大麻對重金屬鉛的富集量顯著降低，低于同濃度CA 處理.造成這一現(xiàn)象的原因可能是EDTA 作為一種氨基多羧酸，螯合鉛的能力較強，但具有一定的生物毒性[19]，因此低濃度EDTA 促進植株吸收重金屬效果顯著，但濃度過高時會對大麻的生長生理過程產(chǎn)生的較大的影響，導致大麻富集能力降低.CA 是一種天然小分子有機酸，螯合鉛的能力較EDTA 稍弱，但對植物毒性較小甚至能在一定程度上減輕重金屬對植物的毒害作用[20-21]，其在基質(zhì)中除了發(fā)揮螯合作用之外，還能降低基質(zhì)pH，增強基質(zhì)中微生物的活性[8]，進而促進大麻對鉛的吸收.因此，在高濃度螯合劑處理下，CA 促進大麻吸收鉛效果較EDTA 好.植株鉛含量隨基質(zhì)有效態(tài)鉛含量的增加先緩慢上升隨后急劇下降，分析其中原因可能是因為低濃度螯合劑和低濃度重金屬鉛都可以促進植物生長[22]，而當螯合劑或重金屬鉛濃度超過一定閾值后都會使植株生長嚴重受阻[23]，甚至破壞細胞結(jié)構(gòu)[24]，最終抑制植株對鉛的吸收.基質(zhì)中有效態(tài)鉛質(zhì)量比隨螯合劑濃度的增加而增加，這與陳雅慧等[25]的研究結(jié)論一致.在本試驗中，施加15 mmol·L-1EDTA 和CA 時基質(zhì)有效態(tài)鉛質(zhì)量比達到最大，施加更高濃度的螯合劑能否繼續(xù)有效活化基質(zhì)中的鉛有待進一步研究.

大麻不同部位的鉛質(zhì)量比大小為根＞莖＞葉（圖2），但由于大麻根部生物量較低，因此根部鉛積累量并不高，且在高濃度螯合劑處理下根部生長受抑制嚴重，該現(xiàn)象尤為明顯.由于植物的根數(shù)、根長和根表面積在重金屬脅迫下會嚴重減少[26]，分析大麻根部生長受到抑制的原因之一是螯合劑促使大量重金屬鉛通過根系進入植株體內(nèi)，造成根部細胞受損嚴重.研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)EDTA 處理后，盡管玉米根系鉛含量是地上部的5.48倍，但根中的鉛積累量因生物量小而遠遠低于地上部分[27].此外，本試驗結(jié)論是在盆栽條件下獲得的，也有可能是盆栽環(huán)境限制了大麻生長，阻礙了大麻根系的伸展，減少了其對重金屬鉛的吸收、積累，其結(jié)果還有待于大田微區(qū)試驗進一步驗證.

低濃度螯合劑處理可促進大麻生長使大麻株高、莖粗和生物量有所上升，其原因可能是低濃度的螯合劑可在一定程度上緩解重金屬對植物造成的抑制作用，從而使生物量有所增加[15].本試驗中，高濃度的螯合劑導致大麻的株高、莖粗和生物量降低，這與大部分學者研究得出的“高濃度螯合劑會導致植物生長受到抑制”結(jié)論相符[28-29].分析其中原因可能有兩個：一是高濃度的螯合劑作為脅迫因子破壞了植株的細胞結(jié)構(gòu)，導致植株生長受到抑制.另一可能是高濃度螯合劑增加了大麻對重金屬鉛的吸收，鉛在植物體內(nèi)傳遞的過程中破壞了正常的離子調(diào)控轉(zhuǎn)運機制和細胞質(zhì)膜，使大麻體內(nèi)積累了較多的重金屬，從而導致植株的生長受到抑制.在濃度相同時，CA 處理組大麻株高、莖粗和生物量均高于EDTA 處理，這同馬葉等[30]的研究結(jié)論一致，其原因是EDTA 作為一種人工螯合劑，對植株和土壤產(chǎn)生毒性影響[31]；而CA 是植物生長自身合成的有機酸，在低濃度時可改善土壤環(huán)境有利植物生長[20-21].

植物的生物量和富集系數(shù)是衡量植物是否具有重金屬修復潛力的關(guān)鍵.本試驗中，施加低濃度的螯合劑可以促進植株生長和提高大麻對重金屬鉛的富集系數(shù)，并且根部富集系數(shù)總是顯著高于地上部分.結(jié)合螯合劑對大麻鉛轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響來看，根部富集的鉛向地上部轉(zhuǎn)移并不充分，表明大麻將重金屬鉛由根部轉(zhuǎn)移到地上部的效率有限，根部成為了大麻富集鉛的主要器官，國內(nèi)部分學者在黑麥草和蠶豆的相關(guān)研究中也得出類似的結(jié)論[32-33].此外，當螯合劑濃度為2 mmol·L-1時轉(zhuǎn)運系數(shù)最大，而富集系數(shù)在5 mmol·L-1EDTA 和10 mmol·L-1CA 處理時最大.這可能是由于在高濃度螯合劑處理時，基質(zhì)中活化的鉛濃度過高，大量鉛富集在根部并產(chǎn)生毒性，導致鉛向地上部轉(zhuǎn)運受阻[34]，從而使轉(zhuǎn)運系數(shù)表現(xiàn)下降.

綜上所述，在鉛添加量為2 000 mg·kg-1的泥炭盆栽條件下，施加適宜濃度的螯合劑不僅可以緩解重金屬鉛對大麻生長產(chǎn)生的毒害，而且提高了大麻對鉛的吸收和轉(zhuǎn)運能力，增強了大麻對鉛污染基質(zhì)的修復效果，為鉛污染土地的植物修復提供了有效的策略.

4 結(jié)論

施加EDTA 或CA 均能顯著提高基質(zhì)中的有效態(tài)鉛質(zhì)量比，且EDTA 提高基質(zhì)有效態(tài)鉛效果較CA 好.在鉛脅迫條件下施加低濃度的螯合劑可以在一定程度上緩解鉛對植株生長所造成的傷害，而高濃度螯合劑會導致植物生長受阻；適當施加螯合劑有助于大麻對鉛的吸收與積累、增強大麻對鉛的富集能力和鉛由地下部向地上部轉(zhuǎn)移的能力.綜合大麻對鉛的吸收和大麻生長（生物量）來看，施加5 mmol·L-1EDTA 或10 mmol·L-1CA 時大麻對鉛污染基質(zhì)的修復效果最佳.